Прогноз и последствия асцита брюшной полости. Выделение антител из асцита


Получение моноклональных антител

Селекция гибридных клеток основана на том, что в ГАТ среде родительские миеломные клетки погибают, а нормальные клетки селезенки не обладают способностью расти при данных условиях культивирования, так что выживают и размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клеток способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.

Подготовительные этапы перед проведением слияния

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы:

иммунизация животных;

подготовка клеток к слиянию;

слияние;

отбор индуцирующих специфические антитела клонов;

клонирование и реклонирование;

массовая наработка гибридомных клеток;

получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;

выделение антител.

Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3-4 месяца.

Организация работы и оборудование. Для работы по получению гибридом желательно выделить отдельное помещение. Эксперимент можно проводить и в части большой комнаты, максимально удаленной от входной двери. Это помещение надо оснастить следующим оборудованием:

Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих частицы крупнее 0,3 мкм.

Инкубатор, в котором автоматически поддерживается влажность, температура и концентрация СО2.

Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с охлаждением.

Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-констрастным устройством.

Холодильник на +4 и на –200 С.

Водяная баня на +37 и +560 С.

Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь морозильник на –700 С и сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток. Для получения гибридом нужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток: 96-луночные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для проведения иммуноферментного и радиоиммунологического анализов, среды для культивирования, необходимые реактивы, сыворотку плода коровы (СПК).

Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Основными средами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Выбор экспериментального животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных.

Другие животных практически не используются.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере на последних этапах иммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной техники и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и употребив впоследствии эти антитела для очистки антигена.

Способы иммунизации. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимы выделять селезеночные клетки животных через 3-4 суток после последнего введения антигена, то есть тогда, когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого, используют введение антигена, преципитированного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация может иметь обратный эффект – отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации.

www.wikidocs.ru

причины, симптомы, диагностика и лечение

Асцит или брюшная водянка может сопровождать течение самого широкого круга заболеваний в гастроэнтерологии, гинекологии, онкологии, урологии, кардиологии, эндокринологии, ревматологии, лимфологии. Накопление перитонеальной жидкости при асците сопровождается повышением внутрибрюшного давления, оттеснением купола диафрагмы в грудную полость. При этом значительно ограничивается дыхательная экскурсия легких, нарушается сердечная деятельность, кровообращение и функционирование органов брюшной полости. Массивный асцит может сопровождаться значительной потерей белка и электролитными нарушениями. Таким образом, при асците может развиваться дыхательная и сердечная недостаточность, выраженные обменные нарушения, что ухудшает прогноз основного заболевания.

Причины асцита

В норме серозный покров брюшной полости – брюшина продуцирует незначительное количество жидкости, необходимое для свободного движения петель кишечника и предупреждения склеивания органов. Этот экссудат всасывается обратно самой же брюшиной. При целом ряде заболеваний секреторная, резорбтивная и барьерная функции брюшины нарушаются, что приводит к возникновению асцита.

Асцит у новорожденных часто встречается при гемолитической болезни плода; у детей раннего возраста – при гипотрофии, экссудативных энтеропатиях, врожденном нефротическом синдроме. Развитие асцита может сопровождать различные поражения брюшины: разлитой перитонит неспецифической, туберкулезной, грибковой, паразитарной этиологии; мезотелиому брюшины, псевдомиксому, перитонеальный карциноз вследствие рака желудка, рака толстого кишечника, рака молочной железы, рака яичников, рака эндометрия.

Асцит может служить проявлением полисерозита (одновременного перикардита, плеврита и водянки брюшной полости), который встречается при ревматизме, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, уремии, а также синдрома Мейгса (включает фиброму яичника, асцит и гидроторакс).

Частыми причинами асцита выступают заболевания, протекающие с портальной гипертензией – повышением давления в портальной системе печени (воротной вене и ее притоках). Портальная гипертензия и асцит могут развиваться вследствие цирроза печени, саркоидоза, гепатоза, алкогольного гепатита; тромбоза печеночных вен, вызванного раком печени, гипернефромой, заболеваниями крови, распространенным тромбофлебитом и т. д.; стеноза (тромбоза) воротной или нижней полой вены; венозного застоя при правожелудочковой недостаточности.

К развитию асцита предрасполагает белковая недостаточность, заболевания почек (нефротический синдром, хронический гломерулонефрит), сердечная недостаточность, микседема, болезни ЖКТ (панкреатит, болезнь Крона, хроническая диарея), лимфостаз, связанный со сдавлением грудного лимфатического протока, лимфоангиоэктазиями и затруднением лимфооттока из брюшной полости.

Таким образом, в основе патогенеза асцита может лежать сложный комплекс воспалительных, гемодинамических, гидростатических, водно-электролитных, метаболических нарушений, вследствие чего происходит пропотевание интерстициальной жидкости и ее скопление в брюшной полости.

Симптомы асцита

В зависимости от причин асцит может развиваться внезапно или постепенно, нарастая на протяжении нескольких месяцев. Обычно пациент обращает внимание на изменение размера одежды и невозможность застегнуть пояс, увеличение веса.

Клинические проявления асцита характеризуются ощущениями распирания в животе, тяжестью, абдоминальными болями, метеоризмом, изжогой и отрыжкой, тошнотой. По мере нарастания количества жидкости живот увеличивается в объеме, пупок выпячивается. При этом в положении стоя живот выглядит отвисшим, а в положении лежа становится распластанным, выбухающим в боковых отделах («лягушачий живот»). При большом объеме перитонеального выпота появляется одышка, отеки на ногах, затрудняются движения, особенно повороты и наклоны туловища. Значительное повышение внутрибрюшного давления при асците может приводить к развитию пупочной или бедренной грыж, варикоцеле, геморрою, выпадению прямой кишки.

Асцит при туберкулезном перитоните вызван вторичным инфицированием брюшины вследствие генитального туберкулеза или туберкулеза кишечника. Для асцита туберкулезной этиологии также характерны похудание, лихорадка, явления общей интоксикации. В брюшной полости, кроме асцитической жидкости, определяются увеличенные лимфоузлы вдоль брыжейки кишечника. Экссудат, полученный при туберкулезном асците, имеет плотность >1016, содержание белка 40-60 г/л, положительную реакцию Ривальта, осадок, состоящий из лимфоцитов, эритроцитов, эндотелиальных клеток, содержит микобактерии туберкулеза.

Асцит, сопровождающий перитонеальный карциноз, протекает с множественными увеличенными лимфоузлами, которые пальпируются через переднюю брюшную стенку. Ведущие жалобы при данной форме асцита определяются локализацией первичной опухоли. Перитонеальный выпот практически всегда имеет геморрагический характер, иногда в осадке обнаруживаются атипичные клетки.

При синдроме Мейгса у пациенток выявляется фиброма яичника (иногда злокачественные опухоли яичника), асцит и гидроторакс. Характерны боли в животе, выраженная одышка. Правожелудочковая сердечная недостаточность, протекающая с асцитом, проявляется акроцианозом, отеками голеней и стоп, гепатомегалией, болезненностью в правом подреберье, гидротораксом. При почечной недостаточности асцит сочетается с диффузным отеком кожи и подкожной клетчатки – анасаркой.

Асцит, развивающийся на фоне тромбоза воротной вены, носит упорный характер, сопровождается выраженным болевым синдромом, спленомегалией, незначительной гепатомегалией. Вследствие развития коллатерального кровообращения нередко возникают массивные кровотечения из геморроидальных узлов или варикозно увеличенных вен пищевода. В периферической крови выявляется анемия, лейкопения, тромбоцитопения.

Асцит, сопровождающий внутрипеченочную портальную гипертензию, протекает с мышечной дистрофией, умеренной гепатомегалией. На коже живота при этом хорошо заметно расширение венозной сети в виде «головы медузы». При постпеченочной портальной гипертензии стойкий асцит сочетается с желтухой, выраженной гепатомегалией, тошнотой и рвотой.

Асцит при белковой недостаточности, как правило, небольшой; отмечаются периферические отеки, плевральный выпот. Полисерозиты при ревматических заболеваниях проявляются специфическими кожными симптомами, асцитом, наличием жидкости в полости перикарда и плевры, гломерулопатией, артралгиями. При нарушениях лимфооттока (хилезном асците) живот быстро увеличивается в размерах. Асцитическая жидкость имеет молочный цвет, пастообразную консистенцию; при лабораторном исследовании в ней выявляются жиры и липоиды. Количество жидкости в брюшинной полости при асците может достигать 5-10, а иногда и 20 литров.

Диагностика асцита

Прежде всего, необходимо исключить другие возможные причины увеличения объема живота – ожирение, кисту яичника, беременность, опухоли брюшной полости и т. д. Для диагностики асцита и его причин проводится перкуссия и пальпация живота, УЗИ брюшной полости, УЗДГ венозных и лимфатических сосудов, МСКТ брюшной полости, сцинтиграфия печени, диагностическая лапароскопия, исследование асцитической жидкости.

Перкуссия живота при асците характеризуется притуплением звука, смещением границы тупости при изменениях положения тела. Прикладывание ладони к боковой поверхности живота позволяет ощутить толчки (симптом флюктуации) при постукивании пальцами по противоположной стенке живота. Обзорная рентгенография брюшной полости позволяет идентифицировать асцит при объеме свободной жидкости более 0,5 л.

Из лабораторный тестов при асците проводится исследование коагулограммы, биохимических проб печени, уровней IgA, IgM, IgG, общего анализа мочи. У пациентов с портальной гипертензией показано выполнение ЭГДС с целью обнаружения варикозно измененных вен пищевода или желудка. При рентгеноскопии грудной клетки может выявляться жидкость в плевральных полостях, высокое стояние дна диафрагмы, ограничение дыхательной экскурсии легких.

В ходе УЗИ органов брюшной полости при асците изучаются размеры, состояние тканей печени и селезенки, исключаются опухолевые процессы и поражения брюшины. Допплерография позволяет оценить кровоток в сосудах портальной системы. Гепатосцинтиграфия проводится для определения поглотительно-экскреторной функции печени, ее размеров и структуры, оценки выраженности цирротических изменений. С целью оценки состояния спленопортального русла проводится селективная ангиография – портография (спленопортография).

Всем пациентам с асцитом, выявленным впервые, выполняется диагностический лапароцентез для забора и исследования характера асцитической жидкости: определения плотности, клеточного состава, количества белка и бактериологического посева. При сложно дифференцируемых случаях асцита показано проведение диагностической лапароскопии или лапаротомии с прицельной биопсией брюшины.

Лечение асцита

Патогенетическое лечение асцита требует устранения причины его развития, т. е. первичной патологии. Для уменьшения проявлений асцита назначаются бессолевая диета, ограничение приема жидкости, мочегонные препараты (спиронолактон, фуросемид под прикрытием препаратов калия), проводится коррекция нарушений водно-электролитного обмена и снижение портальной гипертензии с помощью антагонистов рецепторов ангиотензина II и ингибиторов АПФ. Одновременно показано применение гепатопротекторов, внутривенное введение белковых препаратов (нативной плазмы, раствора альбумина).

При асците, резистентном к проводимой медикаментозной терапии, прибегают к абдоминальному парацентезу (лапароцентезу) – пункционному удалению жидкости из брюшной полости. За одну пункцию рекомендуется эвакуировать не более 4-6 л асцитической жидкости ввиду опасности развития коллапса. Частые повторные пункции создают условия для воспаления брюшины, образования спаек и повышают вероятность осложнений последующих сеансов лапароцентеза. Поэтому при массивных асцитах для длительной эвакуации жидкости производят установку постоянного перитонеального катетера.

К вмешательствам, обеспечивающим условия для путей прямого оттока перитонеальной жидкости, относятся перитонеовенозный шунт и частичная деперитонизация стенок брюшной полости. К косвенным вмешательствам при асците относятся операции, снижающие давление в портальной системе. В их число входят вмешательства с наложением различных портокавальных анастомозов (портокавальное шунтирование, трансъюгулярное внутрипеченочное портосистемное шунтирование, редукция селезеночного кровотока), лимфовенозное соустье. В некоторых случаях при рефрактерном асците производится спленэктомия. При резистентном асците может быть показана трансплантация печени.

Прогноз при асците

Наличие асцита существенно утяжеляет течение основного заболевания и ухудшает его прогноз. Осложнениями самого асцита могут стать спонтанный бактериальный перитонит, печеночная энцефалопатия, гепаторенальный синдром, кровотечения.

К неблагоприятным прогностическим факторам у пациентов с асцитом относят возраст старше 60 лет, гипотонию (ниже 80 мм рт. ст), почечную недостаточность, гепатоцеллюлярную карциному, сахарный диабет, цирроз печени, печеночноклеточную недостаточность и др. Двухлетняя выживаемость при асците составляет около 50%.

www.krasotaimedicina.ru

Способ получения моноклональных антител к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов

Изобретение касается получения биологически активных антител, связывающихся с живой клеткой. Препаратом мембранных белков церебральных эндотелиоцитов иммунизируют мышь линии Balb/C. Выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp2/0-Ag14, получают гибридомы, тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически и отбирают гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов. Из них выбирают гибридому, характеризующуюся наибольшим количеством антитело-продуцирующих гибридных клеток, синтезирующих антитела, относящиеся к классу иммуноглобулинов G, сохраняющие биологическую активность в сыворотке крови не менее 24 часов, выделяют моноклональные антитела из супернатанта выбранной гибридомы, в частности, методом аффинной хроматографии на протеин-G-агарозе. Способ по изобретению обеспечивает получение моноклональных антител к антигену церебральных эндотелиоцитов с высокой иммунохимической активностью, позволяющих визуализировать церебральные эндотелиоциты как ех vivo, так и в условиях in vitro и in vivo для характеристики сосудистой системы глиом. 1 з.п. ф-лы, 9 ил.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к проблеме получения биологически активных антител, связывающихся с живой клеткой.

Известны работы по получению поликлональных антител и моноклональных антител, визуализирующих капилляры головного мозга [Lin J.H. et al. 2002]. Наиболее селективный маркер церебральных эндотелиоцитов - ЕВА визуализируется антителами SMI-71 только на срезах мозга крысы (Sternberger L.A. et al. 1992). Подобным образом, антитела ОХ-26 окрашивают трансферриновый рецептор CD-71 только в микрососудах крысы (Pardridge at al. 2002). Получены моноклональные антитела, специфичные к инсулиновому рецептору церебральных микрососудов человека и различных видов животных. Известны также коммерческие препараты моноклональных антител к VEGF, FV для визуализации сосудов головного мозга [Zymed, USA]. Известно, что не все моноклональные антитела, полученные с целью визуализации церебральных эндотелиоцитов, могут применяться для визуализации живых клеток. Кроме того, в открытой печати приводятся противоречивые данные о кинетике аллогенных антител, вводимых в кровоток здоровым животным. Некоторые исследователи высказывают предположение о том, что аллогенные антитела при попадании в системный кровоток очень быстро теряют иммунохимическую активность вследствие взаимодействия с белками плазмы крови и элиминируются в результате захвата клетками печени и селезенки. При этом объективная оценка иммунохимической активности аллогенных антител в сосудистом русле подчас значительно ограничена вследствие методологических затруднений.

Задачей изобретения является получение биологически активных моноклональных антител к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов с высокой иммунохимической активностью, позволяющих визуализировать церебральные эндотелиоциты как ex vivo, так в условиях in vitro и in vivo.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения биологически активных моноклональных антител к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, связывающихся с живой клеткой.

Авторами установлено, что аблюминальный антиген церебральных эндотелиоцитов доступен для циркулирующей в крови наносистемы на основе специфичных моноклональных антител при развитии опухолевого процесса в головном мозге крыс (глиома С6). Полученная наносистема способна проникать через патологический гемато-энцефалический барьер из кровеносного русла в область глиомы, что позволяет визуализировать сосудистую систему глиомы С6.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Препаратом мембранных белков церебральных эндотелиоцитов иммунизируют мышь линии Balb/C. Выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp2/0-Ag14, получают гибридомы, тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически и отбирают гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов. Из них выбирают гибридому, характеризующуюся наибольшим количеством антитело-продуцирующих гибридных клеток, синтезирующих антитела, относящиеся к классу иммуноглобулинов G, сохраняющие биологическую активность в сыворотке крови не менее 24 часов, выделяют моноклональные антитела из супернатанта выбранной гибридомы.

В частности, выделение моноклональных антител из супернатанта выбранной гибридомы проводят методом аффинной хроматографии на протеин-G-агарозе.

Изобретение поясняется следующими фигурами.

На Фигуре 1 представлен диск-электрофорез солюбилизированного препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов крысы. А. - Маркеры молекулярной массы. Б. - Препарат мембранных белков (окрашивание кумасси G-250).

Фигура 2. Конфокальная лазерная микроскопия церебральных эндотелиоцитов на срезах головного мозга крысы с помощью анти-ВЕМР-1 антител.

Фигура 3. Накопление Анти-ВЕМР-1 в микрососудах мозга и печени (%) in vitro в зависимости от введенного количества меченых антител.

Фигура 4. Иммуногистохимическое окрашивание пиальных микрососудов Анти-ВЕМР-1. Увеличение 1×100.

Фигура 5. Иммунопероксидазное окрашивание микрососудов мозжечка с помощью анти-ВЕМР антител exvivo, увеличение 1×100.

Фигура 6. Распределение меченных I125 Анти-ВЕМР-1 в микрососудах мозга, печени и бессосудистой фракции мозга (in vitro).

Фигура 7. Распределение IgG в микрососудах мозга и печени (%) in vitro при различном количестве введенных меченых антител.

Фигура 8. Результаты лазерной конфокальной микроскопии визуализации церебральных эндотелиоцитов с помощью анти-ВЕМР-1 антител. По расположению ядра, окрашенного DAPI (синий цвет), антиген, к которому получены антитела, локализуется на аблюминальной поверхности церебральных эндотелиоцитов.

Фигура 9. Иммуногистохимический анализ срезов печени (А), легкого (Б, В) и почек (Г) с помощью анти-ВЕМР-1.

Способ осуществляется следующим образом.

В основу модификаций приготовления препаратов аблюминального антигена церебральных эндотелиоцитов, использованных в данной работе, положена методика Lidinsky et al. для мембранных белков микрососудов головного мозга. Основным требованием к модифицированным способам получения является максимальное сохранение антигенного спектра препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов с наибольшей экстракцией интегральных мембранных белков.

Используемая авторами методика получения препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов включает в себя следующие этапы.

1. Гомогенизация. К 50 г ткани головного мозга крысы добавляют 500 мл PBS, содержащего 5,5 mM глюкозу, 2 mM ЭДТА, 4 mM фенилметилсульфонилфлуорид и апротинин в дозе 0,5 Ед/мл и измельчают в гомогенизаторе ЕТА 0010 в течение 30 секунд на максимальной скорости.

2. Фильтрация. Полученный гомогенат однократно пропускают через сито с диаметром пор 360 µm, а затем полученный фильтрат - двукратно через сито с диаметром пор 160 µm. Полученный фильтрат центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин.

3. Градиентное центрифугирование в декстране. Осадок суспендируют в растворе декстрана Т-70 до конечной концентрации 15% (масса/об.), наслаивают по 10 мл на 25% раствор декстрана в пробирках по 50 мл и центрифугируют при 25000 g в течение 10 мин в бакетном роторе. Фракцию микрососудов, формировавших линию на интерфазе растворов декстрана различных плотностей, отбирают и повторно центрифугируют при 25000 g в течение 10 мин.

4. Осмотический лизис клеток. Препарат микрососудов суспендируют в 50 мл дистиллированной воды, перемешивают в течение 2 часов при 4°С и центрифугируют 15000 g в течение 10 мин. Процедуру повторяют дважды, отбирая осадок.

5. Сонификация. Осадок лизированных клеток растворяют в минимальном объеме h3O и озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе «G112SP1T» (Laboratory Supplies Co. Inc.) при частоте 80 кГц в течение 20 мин (3 раза) в охлажденной дистиллированной воде с детергентом Triton-Х100. Препарат центрифугируют при 25000 g в течение 10 мин и отбирают надосадок.

Полученной в результате градиентного центрифугирования в декстране и последующего осмотического лизиса очищенной фракцией мембран эндотелиоцитов проводят иммунизацию мыши Balb/c в количестве 20 мкг по общему белку. Подкожно в три точки вводят препарат мембранных белков церебральных эндотелиоцитов (20 мкг) с равным объемом полного адъюванта Фрейнда с интервалом 1 раз в 10 дней, с последующим 2-месячным перерывом. Затем повторяют цикл иммунизации и на 5-6-й день после второго цикла иммунизации вводят внутрибрюшинно 50 мкг препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. Эффективность иммунизации оценивают методом иммунодиффузии с тест-системой (экстракт мозга).

Гибридизацию проводят на 3-4-й день после последней инъекции препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов в соотношении клеток миеломы и В-лимфоцитов 1:10. Гибридные клоны отбирают на селективной среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Скрининг гибридом на продукцию специфичных антител проводят методами иммуногистохимии и иммуноцитохимии in vitro и in vivo. А именно, клетки гибридомы проводятся через серию реклонирований под контролем высокочувствительного иммуногистохимического метода на основе авидин-биотинового пероксидазного кита «ABC-Vectastain» (Vector Lab., USA) с усилением окрашивания DAB с помощью CoCl2 и лазерной конфокальной микроскопии с использованием вторичных флюоресцентных антител (Invitrogen, USA).

Из большого количества положительно реагирующих гибридом выбирают те, супернатанты которых содержали аффинные моноклональные антитела к мембранным антигенам эндотелиоцитов церебральных микрососудов, после чего проводятся последовательные серии реклонирования и анализа супернатантов для каждой из этих гибридом.

Отбирается одна гибридома, продуцирующая моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, характеризующаяся наибольшим процентом антитело-продуцирующих гибридных клеток с продукцией моноклональных антител, относящихся к классу G, сохраняющих биологическую активность в сыворотке крови лабораторного животного не менее 24 часов.

Отбор гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, проводится по результатам конфокальной микроскопии. Определение класса иммуноглобулинов осуществляется по результатам изотипирования с помощью коммерческих сывороток (Sigma, USA). Изучение биологической активности антител в сыворотке крови лабораторного животного проводится по результатам иммунохимического тестирования на срезах головного мозга крысы после 24-часовой циркуляции моноклональных антител, введенных в кровеносное русло крысы.

Для выполнения последующих экспериментов гибридные клетки выбранной гибридомы вводятся внутрибрюшинно мышам Balb/c для получения асцита. Асцит также проверяется методами иммуногистохимии и иммунофлюоресценции, положительные пробы объединяются и хранятся в холодильнике глубокого холода (-80°). Гибридные клетки из асцита отделяют центрифугированием и либо снова вводятся в мышь, либо стерильно замораживаются в жидком азоте в среде с ДМСО и нормальной сывороткой лошади.

Данная технология позволяет в любое время провести размораживание гибридных клеток и, после процедуры реклонирования, снова ввести их в мышь и получить асцит в неограниченном количестве (не менее 300 мл асцита со средней концентрацией MAb 4 мг/мл). Полученные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов названы авторами, как анти-ВЕМР-1 антитела.

Для проведения иммуногистохимического анализа на специфичность и/или последующего создания векторных иммунолипосом анти-ВЕМР-1 антитела выделяются из полученного асцита с помощью аффинной хроматографии на протеин-G агарозе. Фракцию IgG отбирают под контролем фотометра, концентрируют методом ультрафильтрации и хранят при -20° в растворе 50% глицерина. Иммунохимическая целостность антител контролируется иммуногистохимически на каждом этапе очистки и концентрирования. Чистота полученных анти-ВЕМР-1 антител оценивается в диск-электрофорезе в ПААГ с SDS.

На тканевую и видовую специфичность анти-ВЕМР-1 антитела проверяются методом иммуногистохимического анализа на срезах других органов крысы и срезах головного мозга других животных.

Для оценки специфичности взаимодействия анти-ВЕМР-1 антител с эндотелиальными антигенами церебральных микрососудов проводят радиоиммунное исследование накопления меченых анти-ВЕМР-1 антител в микрососудах печени и мозга in vitro. Анти-ВЕМР-1 антитела и неспецифические IgG мыши (контроль) конъюгируют с радиоактивным I125 Т-хлораминовым методом (Fraker P.J. и Speck J.C.Jr). Препараты меченных I125 антител отделяют от свободного йода и инкубируют с препаратом нативных микрососудов из свежеприготовленного гомогената мозга крысы. В качестве контроля используют меченые неспецифические иммуноглобулины G мыши (IgG-I125). Расчет вводимой дозы проводят по удельной радиоактивности белковых препаратов (СРМ/мкг), точность расчетов проверяют по определению радиоактивности в образцах (СРМ/мл) с известной концентрацией белка. После инкубации с мечеными антителами препараты трехкратно отмывают 50-кратным объемом PBS методом центрифугирования по 10 мин при 50000 g. После отмывки препараты помещают в γ-счетчик и определяют общую и удельную радиоактивность сырого вещества микрососудов.

Для доказательств возможности осуществления предложенного способа с достижением заявленного назначения и указанного технического результата приводим следующие данные.

ПРИМЕР 1

Для получения препарата мембранных белков головного мозга к 50 г ткани головного мозга крысы добавляли 500 мл PBS, содержащего 5,5 mM глюкозу, 2 mМ ЭДТА, 4 mM фенилметилсульфонилфлуорид и апротинин в дозе 0,5 Ед/мл и измельчали в гомогенизаторе ЕТА 0010 в течение 30 секунд на максимальной скорости. Полученный гомогенат однократно пропускали через сито с диаметром пор 360 µm, а затем полученный фильтрат - двукратно через сито с диаметром пор 160 µm. Фильтрат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Осадок суспендировали в растворе декстрана Т-70 до конечной концентрации 15% (масса/об.), наслаивали по 10 мл на 25% раствор декстрана в пробирках по 50 мл и центрифугировали при 25000 g в течение 10 мин в бакетном роторе. Фракцию микрососудов, формировавших линию на интерфазе растворов декстрана различных плотностей, отбирали и повторно центрифугировали при 25000 g в течение 10 мин. Препарат микрососудов суспендировали в 50 мл дистиллированной воды, перемешивали в течение 2 часов при 4°С и центрифугировали 15000 g в течение 10 мин. Процедуру повторяли дважды, отбирая осадок. Осадок лизированных клеток растворяли в минимальном объеме h3O и озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе «G112SP1T» (Laboratory Supplies Co. Inc.) при частоте 80 кГц в течение 20 мин (3 раза) в охлажденной дистиллированной воде с детергентом Triton-Х100. Препарат центрифугировали при 25000 g в течение 10 мин, отбирая надосадок. Полученный гетерогенный препарат мембранных белков микрососудов мозга был охарактеризован методом диск-электрофореза (Фигура 1).

Полученная в результате градиентного центрифугирования в декстране и последующего осмотического лизиса очищенная фракция мембран эндотелиоцитов была использована для иммунизации и последующего слияния, в результате которого были получены несколько гибридом, продуцирующих антитела, визуализирующие на срезах головного мозга крысы микрососуды. Под контролем иммунофлюоресцентного анализа с использованием конфокальной микроскопии анализа была отобрана гибридома, продуцирующая моноклональные антитела (анти-ВЕМР-1 антитела), специфичные к аблюминальному мембранному антигену эндотелиоцитов церебральных микрососудов.

Первоначально клетки выбранной гибридомы были проведены через серию реклонирований под контролем высокочувствительного иммуногистохимического метода в авторской модификации на основе авидин-биотинового пероксидазного кита «ABC-Vectastain» (Vector Lab., USA) с усилением окрашивания DAB с помощью СоСl2. После проведения седьмой процедуры реклонирования супернатанты из 97% лунок окрашивали эндотелиоциты микрососудов мозга с одинаковой интенсивностью, что свидетельствовало об устойчивой секреции гибридными клетками моноклональных антител. Таким образом, было получено более 50 положительно реагирующих субклонов, из которых отобрали один, продуцирующий максимальное количество высококачественных анти-ВЕМР-1-антител к аблюминальному мембранному антигену микрососудов головного мозга под контролем иммунофлюоресцентного анализа с применением лазерной конфокальной микроскопии (Фигура 8, Г).

Для получения асцита гибридные клетки выбранной гибридомы в количестве 2×106 ввели внутрибрюшинно мышам Balb/c. He менее чем 7 дней после внутрибрюшинного введения гибридных клеток у мышей отбирали асцит. По ходу сбора асцит также проверялся методами иммуногистохимии и иммунофлюоресценции, положительные пробы объединяли и хранили в холодильнике глубокого холода (-80°).

С целью проведения иммуногистохимического анализа на специфичность и в последующем для создания векторных иммунолипосом для работ in vivo анти-ВЕМР-1 антитела были выделены из асцита мышей, иммунизированных препаратом мембранных белков церебральных эндотелиоцитов методом аффинной хроматографии на протеин-G-агарозе. Выход анти-ВЕМР-1 антител в аффинной хроматографии составлял не менее 50%.

Фракцию IgG (анти-ВЕМР-1 антител) отбирали под контролем фотометра, концентрировали методом ультрафильтрации и хранили при -20° в растворе 50% глицерина. Иммунохимическая функциональность антител контролировалась иммуногистохимически на каждом этапе очистки и концентрирования. Чистота полученных анти-ВЕМР-1 антител была оценена в диск-электрофорезе в ПААГ с SDS и составляла не менее 90%.

В дальнейшем, получив очищенный препарат антител анти-ВЕМР-1, авторы показали наличие большого количества антигена в препарате мембранных белков микрососудов мозга методом вестерн-иммуноблота.

Иммуногистохимический и иммунофлюоресцентный анализ очищенного препарата анти-ВЕМР-1 показал, что они прекрасно связываются с аблюминальным мембранным антигеном эндотелиоцитов церебральных микрососудов на срезах головного мозга крысы. Окрашивание микрососудов хорошо визуализировалось на срезах головного мозга крысы при использовании разведений от 1:1000 до 1:100000. При больших разведениях (1:200000, 1:300000) также микрососуды визуализировались при иммуногистохимии на срезах головного мозга крысы, но интенсивность окрашивания микрососудов значительно падала. При разведениях менее 1:1000 резко увеличивалось тонирование фона вследствие неспецифической сорбции антител. Рекомендуемый рабочий диапазон разведений полученного препарата анти-ВЕМР-1 антител для иммуногистохимии и иммунофлюоресценции на срезах головного мозга составляет 1:5000-1:10000.

Наиболее выраженная иммуногистохимическая реакция наблюдалось в ростральных отделах неокортекса, в гипоталамусе, в области коры мозжечка и в продолговатом мозге. Визуализировались как мелкие микрососуды (8-10 мкм), так и довольно крупные элементы сосудистого русла (100 и более мкм).

Абсорбция первичных антител сухой плазмой крови и экстрактами органов и тканей не влияла на интенсивность окрашивания. В то же время абсорбция гомогенатом ткани головного мозга приводила к резкому снижению интенсивности окрашивания, вплоть до его исчезновения. Наряду с окрашиванием микрососудов паренхимы мозга наблюдалось интенсивное окрашивание сосудистой системы оболочек мозга (пиальных микрососудов) и микрососудов хориоидального сплетения (Фигура 4).

В дальнейшем анти-ВЕМР-1 антитела проверялись на тканевую специфичность с помощью иммуногистохимического анализа на срезах других органов. Согласно выбранной схеме все супернатанты и асциты от субклонов выбранной гибридомы, а затем и очищенные анти-ВЕМР-1 антитела из асцита проверяли на срезах печени, сердца, легких, почки и селезенки (Фигура 5).

Таким образом, проведенное исследование показало, что анти-ВЕМР-1 визуализируют аблюминальный мембранный антиген, экспрессирующийся на аблюминальной поверхности эндотелиоцитов микрососудов мозга и в значительно меньшей степени - в микрососудах, локализующихся в слизистой и мышечной оболочках крупных бронхов. Это позволяет говорить о высокой тканевой специфичности анти-ВЕМР-1 антител.

Видовую специфичность анти-ВЕМР-1 антител характеризовали с помощью иммунопероксидазного и иммунофлюоресцентного анализа на срезах мозга крысы, мыши, кролика, быка и человека. На срезах мозга мыши определялось окрашивание микрососудов как с помощью иммунопероксидазной, так и иммунофлюоресцентной методик визуализации. При этом интенсивность окрашивания была несколько ниже, чем аналогичная на срезах мозга крысы. Это свидетельствовало о перекрестной иммунохимической реакции анти-ВЕМР-1 антител с гомологичными эпитопами мыши и крысы. На срезах мозга кролика, быка и человека положительной иммуногистохимической реакции на какие-либо структуры не наблюдалось. Таким образом, было сделано заключение об ограниченной видовой специфичности анти-ВЕМР-1 антител.

Для оценки специфичности взаимодействия анти-ВЕМР-1 антител с эндотелиальными антигенами церебральных микрососудов было проведено радиоиммунное исследование накопления меченых Анти-ВЕМР-1 в микрососудах печени и мозга in vitro. С этой целью выделенные из асцита анти-ВЕМР-1 антитела и неспецифические IgG мыши (контроль) конъюгировали с радиоактивным I125. Йодирование проводили Т-хлораминовым методом в соответствии с процедурой, описанной Fraker P.J. и Speck J.C.Jr. Препараты меченных I125 антител отделяли от свободного йода на микроколонках с Sephadex G-50. Содержание общего белка в препаратах определяли при помощи бицинхониновой кислоты (ВСА Protein Assay reagent, «Pierce», США).

Препарат нативных микрососудов получали из свежеприготовленного гомогената мозга крысы путем ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте декстрана Т-70.

Взвесь микрососудов разделили на равные аликвоты и проинкубировали в течение 12 часов с мечеными анти-ВЕМР-1 антителами (анти-ВЕМР-1-I125). В качестве контроля использовались меченые неспецифические иммуноглобулины G мыши (IgG-I125). Расчет вводимой дозы проводили по удельной радиоактивности белковых препаратов (СРМ/мкг), точность расчета проверяли путем непосредственного определения радиоактивности в образцах (СРМ/мл) с известной концентрацией белка. Удельная радиоактивность белковых препаратов существенно не отличалась: в различных сериях эксперимента колебания удельной радиоактивности для анти-ВЕМР-1-I125 и для IgG-I125 не выходили за пределы 3-5·105 СРМ/мкг. В этой связи стандартизацию вводимой дозы в опыте и в контроле проводили по общему белку. Оценивались следующие концентрации меченых антител: 50, 10, 5 и 1 мкг на аликвоту микрососудов. Все пробы исследовали в дублях.

После инкубации с мечеными антителами препараты трехкратно отмывали не менее чем 50-кратным объемом PBS с центрифугированием по 10 мин при 50000 g на каждом этапе отмывки. Полученный осадок помещали в γ-счетчик и определяли общую и удельную радиоактивность сырого вещества микрососудов. Результаты исследования представлены на гистограммах (Фигура 6, Фигура 7).

Было обнаружено достоверное накопление меченых анти-ВЕМР-1 антител в микрососудах мозга крысы. При этом наблюдался обратный дозозависимый эффект. При исходной концентрации анти-ВЕМР-1 антител 50 мкг/пробу соотношение радиоактивности мозг/печень составляло примерно 3:1. При уменьшении количества введенных антител степень специфического взаимодействия значительно возрастала и при концентрации 1 мкг/пробу в исходном препарате соотношение мозг/печень было около 20:1.

В контроле с мечеными неспецифическими IgG мыши эффекта захвата антител микрососудами мозга не наблюдалось. Независимо от введенного количества белка накопление метки в мозге колебалось от 2,12 до 4,1% от введенной дозы (Фигура 3). Накопление IgG-I125 в печеночных и церебральных микрососудах существенно не отличалось.

При сравнении захвата микрососудами мозга анти-ВЕМР-1-I125 антител и IgG-I125 также был выявлен эффект достоверно большего накопления первых, максимально выраженный при исходной концентрации антител 1 мкг/пробу. При дальнейшем повышении концентрации анти-ВЕМР-1-I125 происходило насыщение микрососудов антителами и доля захваченных антител от введенной дозы снижалась.

Полученные данные были воспроизведены в экспериментах in vitro на препаратах выделенных церебральных микрососудов несколько раз. В качестве второго контроля, кроме микрососудов печени, использовался препарат бессосудистой фракции мозга крысы. Суммарные данные всех экспериментов представлены на гистограмме (Фигура 6).

Накопление меченых анти-ВЕМР-1 антител в пересчете на вес сырого вещества церебральных микрососудов составило 19,79%/100 мг, что в 27 раз превышает их накопление в микрососудах печени и в 11,5 раз в бессосудистой фракции мозга. Накопление неспецифических IgG в церебральных микрососудах при этом составило 1,03%/100 мг.

Следующий эксперимент с использованием полученных авторами и очищенных анти-ВЕМР-1 антител проводился с оценкой иммунохимической активности и кинетики антител после введения в кровеносное русло лабораторного животного. Здоровым крысам (8) под кетаминовым наркозом в бедренную вену вводили по 1 мг анти-ВЕМР-1 антител (3 крысы), анти-GFAP-антител (3 крысы) и неспецифических IgG мыши (2 крысы). Через 10 и 30 минут, 1, 2, 3 и 12 часов из противоположной бедренной вены забирали 0,3 мл крови, центрифугировали и инкубировали полученную сыворотку крови со срезами головного мозга крысы (в качестве первичных антител) в разведениях 1:100, 1:500 и 1:1000. Результаты исследования представлены на Фигуре 5.

Инкубация с крысиной сывороткой, содержащей неспецифические IgG крысы, ни в одном из 3-х случаев не привела к окрашиванию срезов мозга крысы. В отличие от IgG, инкубация с образцами сыворотки, содержащей специфические моноклональные антитела, приводила к окрашиванию срезов мозга крысы. Последнее свидетельствует о способности длительно циркулировать в крови без потери иммунохимической активности.

Следующий эксперимент был проведен для оценки иммунохимической активности анти-ВЕМР-1 антител после введения в кровеносное русло крыс с экспериментальной глиомой С6. Трем крысам в бедренную вену было введено по 1 мг анти-ВЕМР-1 антител, ковалентно связанных с липосомальными наноконтейнерами, содержащими гадолиний DTPA, после чего через 24 часа циркуляции иммунолипосом в кровотоке проводили МРТ исследование головного мозга. Результаты МРТ сканирования по накоплению диагностической метки в местах экспресии ВЕМР-1 свидетельствует о способности анти-ВЕМР-1 антител длительно циркулировать в крови (не менее 24 часов) без потери иммунохимической активности и достигать антигена мишени живой клетки (аблюминальной поверхности церебральных эндотелиоцитов).

Таким образом, полученные авторами моноклональные анти-ВЕМР-1 антитела, вводимые в кровоток живой крысы, сохраняют иммунохимическую активность в плазме крови по крайней мере в течение не менее 24 часов после инъекции и способны достигнуть антигена мишени.

Предложенный способ может быть использован для получения аналогов у человека. Иммуногистохимический анализ эндотелиальных антигенов с помощью моноклональных антител, полученных предложенным авторами способом, может применяться в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo для характеристики сосудистой системы глиом.

1. Способ получения моноклональных антител к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, при котором получают препарат мембранных белков церебральных эндотелиоцитов, иммунизируют им мышь линии Balb/C, выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp2/0-Ag14, получают гибридомы, тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически и отбирают гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, из них выбирают гибридому, характеризующуюся наибольшим количеством антителопродуцирующих гибридных клеток, синтезирующих антитела, относящиеся к классу иммуноглобулинов G, сохраняющие биологическую активность в сыворотке крови не менее 24 ч, выделяют моноклональные антитела из супернатанта выбранной гибридомы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение моноклональных антител из супернатанта выбранной гибридомы проводят методом аффинной хроматографии на протеин-G-агарозе.

www.findpatent.ru

Получение и выделение антител - Справочник химика 21

    Применение моноклональных антител. Практическое использование МкАТ исключительно многообразное — в медицине И ветеринарии (в целях диагностики, терапии), в биотехнологии для получения, выделения и очистки специфических продуктов, в исследованиях фундаментальных и прикладных проблем. Так, например, стволовые клетки костного мозга не обладают какими- [c.579]     Получение гамма-глобулина. Большинство антител против инфекционных болезней найдено в гамма-глобулине плазмы человека [22, 13]. Основные стадии процесса его выделения показаны на рис. 3. Дифференциальной экстракцией гамма-глобулина ацетатом цинка при pH = 5,6 и последующим изо-электрическим осаждением при pH = 7,2 легко отделить его от других протеинов плазмы. [c.614]

    Независимо от того, как был получен клон ДНК, сначала его секвенируют (определяют нуклеотидную последовательность), определив таким образом положение всех открытых рамок считывания и удобных сайтов рестрикции. Установив нуклеотидную последовательность ДНК, можно предсказать молекулярную массу гибридного белка и оценить степень деградации выделенного продукта. Далее, при необходимости можно повторить генноинженерные эксперименты или перейти к выделению гибридных белков и получению специфических антител. [c.142]

    Такие продукты, как интерферон, моноклональные антитела, антигены, вирусы и гормоны, могут извлекаться как непрерывным, так и периодическим способом. Были исследованы процессы с применением мембранных реакторов, в которых использовались панкреатические клетки для синтеза инсулина, а также для получения других белковых гормонов и энзимов. Периодический способ давно применялся для выращивания бактерий и дрожжевых клеток ферментацией. Основной стадией непрерывной ферментации является выделение токсичных продуктов. Легче всего эта операция осуществляется путем рециркуляции клеток через блок полых волокон [26]. [c.96]

    После получения у иммунизированной мыши четкого специфического иммунного ответа на встроенный фрагмент можно начать подготовку к проведению слияния. Несмотря на наличие многочисленных эмпирических данных о решающих факторах, от которых зависит успех слияния, оно все-таки не всегда проходит со стабильно положительным результатом, и стоит провести несколько повторных слияний. Наибольших усилий в подобных экспериментах требуют клонирование, выделение антител и их характеристика поэтому рекомендуется исследовать полученные при слиянии клоны лишь в тех случаях, когда есть много здоровых растущих клонов (100 и более). [c.187]

    Получение и выделение антител [c.153]

    Проблема получения специфических антител при отсутствии чистого антигена была решена с разработкой технологии получения моноклональных антител (МКА) [9], позволяющей выделять антитела к индивидуальным компонентам любой сложной смеси антигенов [10]. Очень скоро МКА были использованы в аффинной хроматографии — вначале для очистки антигенов клеточной поверхности [И, 12], а затем для выделения множества других белков [13, 14]. [c.165]

    Все белки, изученные до сих пор, обладают антигенными св-вами. У белков различают линейные детерминанты, построенные из аминокислотных остатков, расположенных рядом в одном участке полипептидной цепи, и конформационные, к-рые слагаются из аминокислотных остатков разных участков одной или большего числа полипептидных цепей. Антитела, полученные при иммунизации данного животного определенным белком, могут реагировать, хотя и с небольшим сродством, с нек-рыми пептидами, выделенными из гидролизата зтого белка. Такие пептиды, построенные из 5-7 остатков, часто располагаются на изгибах или выступающих отрезках пептидной цепи и, очевидно, являются детерминантами или их частями. Однако в иных условиях, напр, при иммунизации др. вида животного, могут образовываться антитела к иным участкам молекулы того же белкового А. Практически вся пов-сть белковых молекул обладает антигенными св-вами, она, т. обр., представляет собой сумму перекрывающихся детерминант, каждая из к-рых может вызывать иммунную р-цию или не вызывать ее в конкретных условиях. Последние определяются различиями в строении между белковым А, и собственными белками организма, а также регуляторными иммунными механизмами, находящимися под генетич. контролем. По-видимому, почти все детерминанты белков конформационно зависимы. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, антигенные детерминанты обладают повыш. подвижностью. [c.174]

    С помощью иммунохимического метода, включающего анализ специфических преципитатов для различных компонентов групповых веществ [48], было доказано, что значительная часть группового вещества действительно соединяется с антителом, и, следовательно, групповая активность не связана с неизвестными примесями, находящимися в выделенных препаратах. Метод преципитации также можно использовать для получения данных о чистоте и гомогенности изолированных групповых веществ [29]. [c.171]

    В силу того что растворимость антигена ТТГ и антител к нему достаточно близки, для получения специфических антител из иммунной сыворотки был применен иммуносорбент — аминоцеллюлоза, и выделение антител к ТТГ проводили по. методу, разработанному Гурвичем в Институте микробиологии и эпидемиологии им. Н. Ф. Гамалея [107, 108]. Иммунизация проводилась стандартизованным импортным тиреотропным гормоном с биологической активностью 5 USP/ is .  [c.517]

    Для решения вопроса о том, являются ли антитела сывороточными глобулинами или же они только связаны с этой фракцией, можно использовать специфические методы очистки антител. Обычно эти методы включают два основных этапа 1) образование преципитата антиген—антитело и 2) диссоциацию преципитата и выделение чистого антитела. Первые успешные опыты этого рода были предприняты Фелтоном [42], который преципи-тировал антигенные полисахариды пневмококков соответствующей иммунной сывороткой, а затем разлагал преципитат, обрабатывая его гидроокисью бария. При такой обработке антитела переходят в раствор, нерастворимые же бариевые соли полисахаридов остаются в осадке. Гейдельбергер и его сотрудники успешно расщепляли подобные преципитаты, обрабатывая их концентрированными растворами хлористого натрия [43, 44]. В лаборатории автора для получения чистых антител преципитаты азобелков обрабатывались разведенными кислотами в присутствии нейтральных солей. При этом большая часть антител отщеплялась и переходила в раствор, а антиген и недиссоцииро-ванная часть антител оставались в осадке [45]. Растворы антител, полученные при помощи этих методов, содержат глобулины, не отличающиеся по свойствам от описанных выше нормальных глобулинов. Дальнейшие исследования показали, что больше 90% выделенных подобным образом глобулинов осаждается соответствующим антигеном. Это весьма убедительно подтверждает, что данные глобулины действительно идентичны с настоящими антителами. [c.336]

    Для выделения различных мембранных структур используется и аффинная хроматография. Принцип этого метода заключается в способности выделяемого вещества специфически связываться с лигандом, пришитым к нерастворимому носителю, при пропускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (агарозные гели), активируемые путем связывания различных лигандов кофакторов, ингибиторов, субстратов мембранных белков-ферментов, лектинов в случае выделения гликопротеинов гормонов, бромциана, конканавалина А — соответственно при получении мембран, антител или целых клеток, Элюирование исследуемого вещества осуществляют в условиях диссоциации комплекса лиганд — вещество и сохранения нативной структуры выделяемого соединения. [c.221]

    Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы (рис. 43) иммунизация животных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор продуцирующих специфические антитела клонов, клонирование и реклонирование, массовая наработка гибридомных клеток, получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела, и выделение этих антител. Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3—4 мес. [c.96]

    На первом этапе работы от мышей, иммунизированных опеределенным антигеном (АГ), получали суммарную, недифференцированную популяцию Т-клеток, содержащую самые различные клоны (на рис. цифры 1 -6). Второй этап состоял в выделении отдельных клонов Т-клеток, среди которых были и специфичные к использованному антигену (на рис. в качестве примера приведено четыре клона, один из которых — клон 3, — специфически реагирует с антигеном). Третий этап работы включал получение моноклональных антител (мАТ) к антигенреактивно-му клону. Задача этого этапа — получение моноклональных антител, способных реагировать только с клоном, использованным для иммунизации. В то же время перекрестная реакция мАТ говорит об общей специфике антигенреактивного клона и непримированных клонов (верхняя таблица). Отсутствие перекрестной реактивности мАТ указывает на наличие у положительно реагирующего примирован-ного клона особой специфичности — предположительно, антигенраспознающего рецептора. Подтверждением подобного предположения является реакция задержки взаимодействия мАТ с соответствующим клоном в присутствии использованного антигена (нижняя таблица). Получение мАТ к антигенраспознающему рецептору Т-клеток создало условия для его полноценного изучения [c.101]

    Для понимания многих биологических явлений необходимо выделение субпопуляций клеток, находящихся на различных стадиях дифференцировки и в различных формах специализации. Разделение клеток особенно важно для изучения иммунной системы, состоящей из множества клеток, обладающих специфическими фенотипами и функциями. Основные методы основываются на наличии специфических компонентов на поверхности выделяемых клеток, например рецепторов лектинов, антигенов, иммуноглобулинов. Их развитию в большой степени способствовала возможность получения моноклональных антител против детерминант клеточной поверхности. [c.243]

    Растения дают большое количество биомассы, а выращивание их не составляет труда, поэтому разумно было попытаться создать трансгенные растения, способные синтезировать коммерчески ценные белки и химикаты. В отличие от рекомбинантных бактерий, которых культивируют в больших биореакторах (при этом необходимы высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование), для выращивания сельскохозяйственных культур не нужно больших средств и квалифицированных рабочих. Основная проблема, которая может возникнуть при использовании растений в качестве биореакторов, будет связана с выделением продукта введенного гена из массы растительной ткани и сравнительной стоимостью производства нужного белка с помощью трансгенных растений и микроорганизмов. Уже созданы экспериментальные установки по получению с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов антител и полимера поли-Р-гидроксибутира-та, из которого можно изготавливать материал, подверженный биодеградации. [c.412]

    Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

    Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]

    Обычно молекулы антител содержат по два идентичных центра связывания. С использованием техники получения моноклональных антител удалось создать уникальную конструкцию, которая представляет собой молекулу антитела с двумя неидентичными центрами связывания (Martinis et al., 1982) (рис. 24-7). Было проведено слияние клеток гибридомы, продуцирующей мышиные моноклональные антитела против кислой фосфатазы простаты (КФП), с клетками селезенки мыши, иммунизированной поверхностным антигеном вируса гепатита В. Выделенные моноклоны обладали способностью связываться одновременно с обоими антигенами. Антитела, продуцируемые одним из клонов, удалось разделить хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе на 3 фракции. Было показано, что одна из этих фракций содержит антитела, специфичные только к КФП, другая — антитела, специфичные к поверхностным антигенам вируса гепатита В, [c.396]

    В 20-40-е гг. получили развитие физ.-хим. методы анализа Б. Седиментациоиными и диффузионными методами были определены мол. массы многих Б., получены данные о сферич. форме молекул глобулярных Б. (Т. Сведберг, 1926), выполнены первые рентгеноструктурные анализы аминокислот и пептидов (Дж. Д. Бернал, 1931), разработаны хроматографич. методы анализа (А. Мартин, Р. Синг, 1944). Существенно расширились представления о функциональной роли Б. был выделен первый белковый гормон-инсулин (Ф. Бантинг, Ч. Г. Бест, i922 антитела были идентифицированы как фракция у-глобулинов (1939) и тем самым обнаружена новая ф-ция Б.-защитная. Важным этапом явилось открытие ферментативной ф-ции мышечного миозина (В.А. Энгельгардт, М. Н. Любимова, 1939) и получение первьк кристаллич. ферментов (уреазы-Дж. Б. Самнер, 1926 пепсина-Дж.X. Нортроп, 1929 лизоцима-Э. П. Абрахам, Р. Робинсон, 1937). [c.248]

    Неогликопротеинами называются гли ко протеины, полученные химическим синтезом, а именно ковалентным присоединением моно- или олигосахаридов к белкам. Такие искусственные биополимеры могут использоваться для выяснения роли углеводных цепей гликопротеинов, получения антител к углеводным детерминантам заданной структуры, выделения и изучения специфичности лектинов. [c.490]

    Особый интерес представляет общий метод выделения триптофансодержащих пептидов, разработанный на примере сывороточного альбумина человека и цитохрома с лошади [50]. Остатки триптофана в белках количественно модифицировали с использованием высокоспецифичного реагента, 2,4-динитрофенил-сульфинилхлорида, проводили триптический гидролиз, после чего соответствующие пептиды избирательно извлекали на колонке с фиксированными анти-ДНФ-антителами. Получение сор- [c.416]

    Первые прямые данные о перестройке ДНК в процессе развития В-клеток были получены в 1976 г. в экспериментах, в которых ДНК из ранних мышиных эмбрионов, неспособных к выработке антител, сравнивали с ДНК из клеток мышиной миеломы, вырабатывающих антитела. Эти два вида ДНК переваривали рестрикционной нуклеазой и полученные фрагменты гибридизо-вали с радиоактивными последовательностями ДНК, приготовленными путем копирования in vitro V- или С-последовательности молекул информационной РНК для L-цепей, выделенной из клеток миеломы (см. разд. 4.5.3). Как показали результаты этих опытов, специфические V- и С-кодирующие последовательности находились у эмбрионов в разных рестрикционных фрагментах ДНК, а в клетках миеломы-в одном и том же рестрикционном фрагменте (рис. 17-39). Таким образом, у зародыша, где гены иммуноглобулинов не экспрессируются, последовательности ДНК, кодирующие V- и С-области той или иной цепи, локализуются в различных участках генома между тем в клетке миеломы, где уже образуются цепи иммуноглобулинов, эти две последовательности соединены вместе. [c.37]

    В настоящее время при помощи хроматографии производят полное удаление солей из воды (получение дистиллированной воды без перегонки), разделение сложных смесей аминокислот и гидролизатов белков (см. рис. 56), разделение сложных смесей фосфоса-харидов, пуриновых и пиримидиновых оснований (рис. 57), фракционирование белков (цитохрома, рибонуклеазы, инсулина и др.), фракционирование нуклеиновых кислот и различных полимеров, отделение пепсина, трипсина, алкогольдегидрогеназы, очистку антител, выделение стрептомицина, хлортетрациклина, полимиксина и других антибиотиков, а также алкалоидов, гормонов, антигиста-минных веществ. Большой интерес представляет также терапевтическое использование ионообменных смол для регулирования состава ионной среды в желудочно-кишечном тракте и для диагностических целей. [c.116]

    Эти признаки еще не были воспроизведены полностью во фракционированной системе реконструкции, но некоторый успех в идентификации отдельных компонентов был достигнут. Из ооцитов Xenopus выделен белок сборки. Это пентамер, содержащий идентичные субъединицы по 29000 дальтон. Это белок, преобладающий в ооцитах, и локализован он в нуклеоплазме. Антитела, полученные против этого белка, реагируют с белками нуклеоплазмы многих эукариот. Следовательно, можно предположить, что этот белок соответствует эволюционно какой-то универсальной функции, закрепленной в процессе эволюции. Он был назван нуклеоплазмином. [c.372]

    ДОЛЖНЫ отсутствовать даже следы гликонротеина. Это сужает использование метода, но нмеется одна область, в которой он оказался особенно полезным. Слизистые выделения содержат в дополнение к эпителиальным гликопротеинам или гликопротеин-белковым комплексам все нормальные белки сыворотки, иногда в весьма значительных количествах [18, 60, 85—87]. Антисыворотка к сыворотке тех же самых видов, из которых были получены эпителиальные гликонротеины, но опыту автора, не вступает в перекрестную реакцию с эпителиальными гликопротеинами. Таким образом можно определить незначительные следы этих возможных примесей в гликонротеинах, полученных из слизистых выделений. Один гликопротеин, а именно у-глобу-лин, иммунологически уникален в том отношении, что его гомогенность иногда молшо оценить как для антигена, так и для антитела в некоторых системах возможны очень сложные пробы [88]. Иммунологическая гомогенность 7-глобулиновых антител рассмотрена Исликером [89]. [c.55]

    В табл. 26.8 приведены иммунологические расстояния между человеком, человекообразными обезьянами и низшими обезьянами Старого Света. Были отдельно получены антитела на альбумины, выделенные из тканей человека, шимпанзе (Pan troglodytes) и гиббона (Hylobates lar). Затем эти антитела реагировали с альбуминами, выделенными из тканей человека, шести видов человекообразных обезьян и шести видов обезьян Старого Света. Филогения, полученная на основе данных этой таблицы, изображена на рис. 26.13. [c.230]

    Электрофорез окажется, повидимому, наиболее полезным в области биохимии в качестве метода очистки белков, антител, ферментов, гормонов, вирусов и т. п. При изучении антител, концентрация которых допускает их наблюдение на диаграммах, можно установить расположение и концентрацию антител путем сравнения изображений, полученных до и после осаждения антител специфическими антигенами. Этот случай изучали ва гиперим-мунной лошадиной и кроличьей сыворотках [55—57]. Однако в большинстве случаев концентрация антител лежит ниже предела чувствительности прибора. В таких случаях необходимо прибегать к исследованию выделенных проб (см. стр. 360) при помощи методов дополнительной фиксации, агглютинации, нейтрализации и т. п. [58—60]. [c.377]

    Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

    Линии клеток, продуцирующих моноклональные антитела, обычно получают от грызунов, например мышей и крыс, дающих хороший иммунный ответ на иммуноген. Готовят суспензию клеток селезенки этих животных и вызывают их слияние с мие-ломными клетками. Полученные в результате слияния клетки обладают свойствами и тех, и других родительских клеток, сочетая в себе способность к неограниченному размножению, свой-ствеипую миеломным родительским клеткам, со способностью продуцировать специфические антитела, присущей В-лимфоци-там селезенки. Выделение клона клеток, продуцирующих одно антитело, позволяет нарабатывать эти моноклональные антитела в больших количествах. [c.180]

    Выделение гибридных белков, содержащих -галактозида-зу, было детально описано в предыдущей главе. Для иммунизации мышей требуются относительно небольшие количества антигена, поэтому его можно наработать любым методом. Хотя белковый материал, полученный в результате препаративного ДСН-электрофореза в ПААГ, не всегда обладает такими имму-ногенными свойствами, которые присущи большинству нативных препаратов, он имеет то преимущество, что вызываемый им иммунный ответ обусловлен устойчивыми к денатурации эпитопами. Используемый нами метод выделения нерастворимых гибридных белков приведен в табл. 6.4. Моноклональные антитела к таким эпитопам часто удается с успехом использовать в последующем детальном иммунохимическом анализе белковых антигенов. Наличие абсолютно чистого иммуногена не требует- [c.180]

    Знание того, где находится фитохром в растении, конечно,, помогло бы нам понять механизм его действия, и для получения этой информации было использовано несколько методов. Самые подробные данные о распределении фитохрома на уровне световой микроскопии получены нами с помощью метода иммуноцитохимии— с использованием антител, синтезируемых в организме животного после введения ему в кровь чужеродного белка. Кролики, которым вводят выделенный из растительной ткани фитохром, синтезируют антифитохромный иммуноглобулин. Это вещество после очистки специфически связывается с фитохромоМ в срезах растительной ткани. Присутствие здесь иммуноглобулина можно выявить благодаря связыванию другого его конца с ферментом пероксидазой, при действии которого на субстрат образуется нерастворимый окрашенный продукт. Распределение фитохрома в молодых побегах ячменя, выясненное этим методом, показано на рис. 11.15. [c.349]

chem21.info

Асцит брюшной полости при онкологии: сколько живут, причины, лечение

Асцит или по-другому водянка – патологическое скопление слизистой жидкости в брюшной области. Количество ее может превышать 20 литров. Асцит брюшной полости возникает при циррозном поражении печени (75%), а также при онкологии (10%) и при сердечной недостаточности (5%). Внешне болезнь проявляется тем, что живот значительно увеличивается в размерах и прогрессирующим нарастанием веса. Лечение заболевания чаще всего осуществляется хирургическим путем, больному проводится лапароцентез (откачка жидкости специальным аппаратом).

жидкость между органами

 

Причины развития заболевания

Скопление жидкости в брюшной полости происходит в каждом организме по-разному. Для того чтобы лучше понимать сам механизм, нужно немного разобраться в анатомии человека.

Внутри брюшная полость покрыта оболочкой из соединительной ткани, которая некоторые органы обволакивает полностью, а некоторые частично или не касается вовсе. Эта ткань обеспечивает нормальную работу всех органов, потому как из нее выделяется специальная жидкость, которая не позволяется органам склеиваться. В течение суток она неоднократно выделяется и всасывается, то есть регулярно обновляется.

Асцит вызывает нарушения основной функции брюшной полости: выделение и обратное всасывание жидкости, а также барьерная защита от различных вредных веществ.

болевой синдром

Цирроз является главной причиной появления асцита:

  • печенью синтезируется меньшее количество белка;
  • здоровые печеночные клетки постепенно замещаются соединительными;
  • уменьшение количества белка-альбумина приводит к снижению плазменного давления;
  • жидкость покидает стенки сосудов и попадает в полость тела и ткани.

Цирроз печени провоцирует повышение гидростатического давления. Жидкость не может находиться в стенках сосудов и выдавливается наружу – развивается асцит.

Пытаясь уменьшить давление в сосудах, в организме усиливается лимфоотток, но лимфатическая система не успевает выполнять свою работу – происходит значительное повышение давления. Жидкость, попадающая в брюшную полость, какое-то время всасывается, но затем и это перестает происходить.

Онкологические или воспалительные заболевания приводят к тому, что брюшина начинает выделять слишком большое количество жидкости, которую обратно всасывать не получается, нарушается лимфоотток.

Основные причины возникновения асцита:

  1. Проблемы с печенью.
  2. Острые и хронические сердечные заболевания.
  3. Повреждения слизистой оболочки брюшной полости, вследствие перитонита различной этиологии и злокачественного образования.
  4. Болезни мочеполовой системы, в том числе почечная недостаточность и мочекаменная болезнь.
  5. Заболевания пищеварительного тракта.
  6. Белковая недостаточность.
  7. Аутоиммунные заболевания, например, красная волчанка.
  8. Серьезные нарушения питания: голодания.
  9. Асцит брюшной полости у только что родившихся детей является результатом гемолитической болезни плода.

Симптоматика заболевания

Асцит может развиваться долго: от 1 месяца до полугода, а может возникнуть спонтанно в результате тромбоза воротной вены. Первые симптомы заболевания возникают, когда жидкость в брюшной полости скапливается в количестве около 1 тыс. мл.

Симптомы:

  • вздутие живота и повышенное газообразование;
  • распирающие ощущение в животе;
  • абдоминальная боль в брюшной области;
  • изжога;
  • увеличение размеров живота, выпячивание пупка;
  • увеличение веса;
  • патологически учащенное сердцебиение и отдышка;
  • сложности при попытке наклониться;
  • отек нижних конечностей;
  • возможна пупочная грыжа, геморрой, выпадение прямой кишки.

увеличение живота

Когда человек находится в положении стоя живот имеет округлую форму, но в положении лежа он как бы растекается. На коже появляются глубокие растяжки. Увеличивающиеся давление делает вены по бокам живота очень заметными.

Портальная гипертензия вызывает такие симптомы, как тошнота, рвота, желтуха, происходит это из-за блокады подпеченочных сосудов.

Асцит на фоне туберкулезного перитонита проявляется снижением веса, интоксикацией, повышением температуры. Определяются увеличенные лимфоузлы вдоль кишечника.

Асцит при сердечной недостаточности сопровождается отеками стоп и голеней, акроцианозом, болью справой стороны грудной клетки.

Повышение температуры тела не является прямым симптомом заболевания, но возникает при некоторых заболеваниях, провоцирующих асцит:

  1. Перитонит;
  2. Панкреатит
  3. Цирроз;
  4. Злокачественные опухоли.

Если причиной заболевания служит микседема, то температура, наоборот, может быть значительно ниже нормы – около 35 градусов. Связано это с тем, что щитовидная железа вырабатывает недостаточное количество гормонов, в итоге снижается метаболизм и способность организма выделять тепло.

Фактора риска

Некоторые люди подвержены заболеванию больше других. Лица, входящие в группу риска:

  1. Люди, принимающие в течении длительного времени спиртосодержащие напитки и наркотические средства.
  2. Люди, подвергшиеся переливанию крови.
  3. Страдающие от гепатитов, необязательно вирусной природы.
  4. Имеющие значительное превышение веса.
  5. Страдающие от сахарного диабета второго типа.
  6. Имеющие повышенный уровень холестерина в крови.

образование цирроза

Классификация асцита

Классифицируется заболевание в зависимости от того сколько жидкости находится в животе, наличия инфицирования и ответной реакции на проведение лечебной терапии.

Количество жидкости подразделяет болезнь на три типа:

  1. Начальная стадия асцита с небольшим количеством жидкости (не более 1,5 литра).
  2. Вторая стадия с умеренным содержанием жидкости в брюшной полости. Сопровождается отеками и увеличением живота в объемах. Больной страдает от нехватки кислорода при незначительной физической активности, изжоги, запоров и чувства тяжести в животе.
  3. Третья стадия с большим количеством жидкости или массивная водянка. Кожа на животе сильно растягивает и истончается, сквозь нее хорошо заметны вены брюшины. Больной страдает от сердечной недостаточности и нехватки воздуха. Жидкость в брюшной полости может инфицироваться и начнется перитонит. Высока вероятность летального исхода.

В зависимости от наличия инфекции или ее отсутствия болезнь делится на 3 стадии:

  1. Стерильный асцит. Изученная жидкость показывает отсутствие бактерий.
  2. Инфицированный асцит. Проведенный анализ показывает наличие бактерий.
  3. Спонтанный перитонит.

Вариант ответа на начало лечения позволяет разделить болезнь на два типа:

  1. Заболевание поддающиеся медикаментозному лечению.
  2. Заболевание, возникающее вторично и не поддающиеся медикаментозному лечению.

Диагностика заболевания

Для постановки диагноза требуется проведения комплекса различных процедур, по результатам которого можно с точностью сказать о количестве жидкости внутри брюшной полости и присоединении различных осложнений.

  1. Осмотр – в зависимости от того в каком положении находится человек, при постукивающих движения можно обнаружить притупление звука. При толчках в бок одной ладонью, вторая ладонь, фиксирующая живот, ощущает заметные и колебания жидкости внутри.
  2. Рентгенографическое исследование – позволяет обнаружить асцит с количеством жидкости больше пол-литра. При обнаружении в легких туберкулеза можно сделать предварительный вывод, что заболевание имеет туберкулезную этиологию. При обнаружении плеврита и расширения границ сердца можно предположить, что причиной заболевания послужила сердечная недостаточность.
  3. Ультразвуковое исследование – позволяет определить наличие асцита, а также обнаружить цирроз печени или наличие злокачественных опухолей в брюшной полости. Помогает оценить проходимость крови по венам и сосудам. Исследование грудной области позволяет обнаружить заболевания сердца.
  4. Лапароскопия – пункция брюшной полости, позволяющая взять жидкость для проведения лабораторного исследования с целью определения причин заболевания.
  5. Гепатосцинтиграфия – позволяет определить степень пораженности и яркость выраженность изменений в печени, вызванных циррозом.
  6. МРТ и КТ – позволяют определить все места, где находится жидкость, что сделать другими средствами не удалось.
  7. Ангиография – рентгенографическое исследование, проводимое наряду с введением контрастного вещества. Позволяет определить локализацию пораженных сосудов.
  8. Коагулограмма – исследование крови, позволяющие определить скорость ее свертываемости.
  9. Лабораторно определяются показатели: глобулины, альбумины, мочевина, креатин, натрий, калий.
  10. 10. Выявление уровня α-фетопротеина проводится для диагностики онкологических заболеваний печени, способных привести к асциту.

Лечение асцитического синдрома

Асцит брюшной полости чаще всего является проявлением другого заболевания, поэтому лечение подбирается исходя из стадии и тяжести основой болезни. Современной медицине доступно два способа терапии: консервативная и хирургическая (лапароцентез). Большинству пациентов назначается второй способ лечения, так как он считается наиболее эффективным, при этом он значительно снижает риск рецидива и неблагоприятный последствий.

Консервативная терапия используется чаще всего, когда больному уже помочь нельзя и целью врачей является облегчение состояния и максимальное улучшения качества жизни. Такое лечение назначается в тяжелых случаях цирроза печени и на поздних стадиях рака.

Оба варианта лечения не являются безобидными, поэтому вариант терапии подбирается всегда индивидуально.

Лечение консервативным путем

Лекарственная терапия проводится комплексная. Препараты назначаются для того чтобы выводить асцитическая жидкость выводилась из организма, для этого необходимо: уменьшить поступление натрия в организм, обеспечить обильное его выведение с мочой.

Больной ежедневно должен получать не менее 3 г соли. Полный отказ от нее ухудшает белковый обмен в организме. Используются диуретические средства.

Фармакология не имеет в своем арсенале ни одно средство, которое бы полностью соответствовало требованиям врачей. Наиболее сильный диуретик Лазикс вымывает калий из организма, поэтому в дополнение больному назначаются препараты, например, Панангин или Оротат калия, которые восстанавливают его уровень.

Используются и калийсберегающие мочегонные средства, к ним относится Верошпирон, но и он обладает неприятными побочными эффектами. При выборе подходящего лекарственного средства необходимо учитывать особенности организма и его состояние.

Мочегонные средства целесообразно использовать для лечения асцита при наличии отеков, так как они выводят жидкость не только из брюшной полости, но и из других тканей.

При циррозе печени часто используются такие препараты, как Фозинопрл, Каптоприл, Эналаприл. Они усиливают выведение натрия с мочой, при этом не затрагивая калий.

После того как отечность конечностей спадет, стоит уменьшить потребление поваренной соли.

На время лечения заболевания рекомендуется соблюдать постельный режим и уменьшить количество потребляемой жидкости. При улучшении состояния допустимо ведение полупостельного режима.

Когда консервативное неэффективно или нецелесообразно проводится лапароцентез.

Оперативное вмешательство

Хирургическое лечения заключается в выведение избыточной жидкости путем проколола живота. Подобная процедура называется лапароцентез. Назначается она при значительном наполнении брюшной полости при асците жидкостью. Процедура проводится под местной анестезией, больной при этом находится в положении сидя.

выкачивание жидкости

Во время проведения парацентеза в нижней части живота больному делает прокол, через который будут отсасывать жидкость. Процедура может быть выполнена за один раз, а может быть установлен специальный катетер на несколько дней, подобные решения принимает врач исходя из состояния больного и тяжести заболевания.

Если количество жидкости превышает 7 литров, то лапароцентез проводится в несколько этапов, так как возрастает риск осложнений – резкое падение давление и остановка сердца.

Асцит и онкология

Асцит в тандеме с раковым заболеванием состояние само по себе опасное, но, помимо этого, он может стать причиной и других последствий:

  1. Дыхательная недостаточность.
  2. Непроходимость кишечника.
  3. Спонтанный перитонит.
  4. Гидроторакс.
  5. Выпадение прямой кишки.
  6. Гепаторенальный синдром.

Наличие одного из перечисленных осложнений требует скорейшего лечения. Несвоевременно начатая терапия может привести к смерти больного.

Профилактические мероприятия

Профилактика асцита заключается в предупреждении болезней его вызывающих. При наличии проблем с сердцем, почками или печенью необходимо регулярно проходить осмотр у врача и при необходимости своевременно проходить лечение. Важно вовремя лечить заболевания инфекционного характера, не злоупотреблять алкоголем, следить за питанием и физической активностью.

С особой внимательностью к своему здоровью стоит относиться людям после 50 лет и имеющим какие-либо хронические заболевания. Так, развитие асцита в возрасте после 60 лет, на фоне гипотонии, сахарного диабета, почечной и сердечной недостаточности значительно снижают риск на благоприятный исход заболевания. Двухлетняя выживаемость в столь зрелом возрасте при асците брюшной полости составляет 50%.

kiwka.ru

Асцит: причины, симптомы, лечение

Асцит (водянка брюшной полости) это осложнения различного рода состояний и заболеваний.

Асцит проявляется накоплением жидкости внутри брюшной полости. Вследствие этого увеличивается объем живота, возникают субъективно неприятные симптомы и вторичные нарушения в работе органов брюшной полости.

Такое состояние требует неотложного вмешательства врачей, особенно при быстром накоплении жидкости.

Причины

В основе развития асцита всегда лежит патология, так как нормальные условия функционирования брюшной полости не подразумевают выделения большого количество жидкости.

Незначительное количество выделяется лишь в брюшине, чтобы петли кишечника свободно скользили друг относительно друга и не склеивались, формируя спайки. Затем эта жидкость обратно всасывается.

При нарушении нормальной работы этого механизма страдает функция секреции жидкости и функция ее обратного всасывания. Это приводит к формированию асцита и накоплению избытка жидкости внутри живота.

Причины асцита у взрослых

Зачастую асцит является типичным симптомом портальной гипертензии, цирроза печени, гепатитов, тромбоза печеночных вен.

Процесс может возникать при раке крови и заболеваниях крови неопухолевой природы, при пороках сердца с нарушением кровообращения и застойной сердечной недостаточностью.

Могут вызвать асцит проблемы с лимфообращением, проблемы с щитовидной железой и почками.

Симптомы асцита

Симптомы асцита во многом зависят от причины, от количества жидкости и скорости ее образования.

Проявления могут нарастать постепенно, а могут возникать внезапно, в течение нескольких дней или даже часов.

При асците отмечается увеличение размеров живота и невозможность застегнуть брюки или ремни, прибавка в весе.

Возникают ощущения распирающих болей, изжога и отрыжка, тошнота, метеоризм.

По мере увеличения живота, он выглядит как беременный, с выпячиванием пупка и натяжением кожи. В вертикальном положении живот отвисает, в горизонтальном -  распластывается по бокам, выступая со стороны ребер.

При большом объеме живота возникает сильная одышка с отеками рук и ног, может быть нарушено передвижения, затруднены наклоны.

Могут возникать геморрой, грыжи, выпадать прямая кишка, развивается варикоцеле.

В зависимости от причины проявляются также общие симптомы болезни –

  • лихорадка,
  • явления токсикоза,
  • похудение на фоне увеличения объема живота,
  • расширение подкожных вен на животе,
  • синюшность конечностей.

В среднем в брюшной полости может скопиться от 5 до 20-ти литров жидкости.

 

асцит фотоФото: асцит брюшной полости

Методы диагностики

Основа диагностики – указания на увеличение живота, связанное с болезнями. Также первые данные можно получить при прощупывании живота и его перкуссии - выявляются типичные проявления.

Необходимо выполнение УЗИ брюшной полости и крупных сосудов, исследование печени, диагностическая лапароскопия и пункция брюшной полости (парацентез) с забором жидкости на анализ.

Для выяснения причины асцита назначают анализы крови и мочи, биохимию крови и иммунологические исследования. Дополнительно могут понадобиться рентген грудной клетки и эзофагоскопия пищевода. 

Методы лечения асцита

Лечением асцита занимаются терапевты, хирурги и врачи различных специализаций, в зависимости от причины, его вызвавшей.

Назначается

  • диета с ограничением соли и жидкости,
  • прием мочегонных средств (лазикс, верошпирон) в сочетании с калий-содержащими препаратами (аспаркам).

Если причина асцита - гипертензия в системе воротной вены, то применяются препараты для ее снижения, гепатопротекторы (лив-52, эссенциале), введения плазмы или альбумина.

Если объем жидкости не уменьшается, применяют лапароцентез (прокол брюшной стенки и удаление избытка жидкости).

При большом объеме экссудата нельзя за раз удалять более 5 литров. Если жидкость прибывает быстро, устанавливают перитонеальные катетеры, чтобы не было спаек и инфицирования брюшины.

Течение и прогноз

Асцит существенно осложняет течение основного заболевания и считается прогностически неблагоприятным признаком.

Асцит может осложниться перитонитом, кровотечением, отказом печени и селезенки, поражением мозга из-за отека.

В среднем процент летальности больных с выраженным асцитом до 50%.

www.diagnos.ru


Смотрите также