Статья: Иммунологические методы, основанные на взаимодействии антиген–антитело. Принципы взаимодействия антиген антитело


Антиген, взаимодействие с антителом - Справочник химика 21

    Реакции взаимодействия антигенов и антител осуществляются за счет слабых нековалентных взаимодействий. Эти реакции, происходящие в очень ограниченном пространстве, являются результатом структурной комплементарности антигенной детерминанты и участка антитела, причем сила взаимодействий зависит от комплементарности участков. Большая или меньшая сила взаимодействия выражается через сродство антитела к антигенной детерминанте. Когда речь идет об антителах иммунной сыворотки и антигенном белке, из-за присутствия в сыворотке специфических антител нескольких антигенных детерминантов разные [c.93]     Другим перспективным направлением в разработке амперометрических биосенсоров является создание устройств, основанных на иммунологических реакциях. Принцип иммунного анализа заключается во взаимодействии исследуемого вещества, называемого антигеном (АГ), со специфически связывающимся с ним антителом (АТ) с образованием комплекса АГ -АТ. При фиксированной концентрации антитела (антигена) равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена (антитела) зависит от его общей концентрации. Таким образом, неизвестную концентрацию антигена (антитела) можно определить при помощи фиксированного количества меченых антител (антигенов). Для этого антиген или антитело метят ферментами. Разработанные к настоящему времени иммуноферментные амперометрические датчики можно классифицировать следующим образом  [c.506]

    Высокая специфичность антител по отношению к антигену делает их гибким и действенным инструментом, который можно использовать для выявления, количественного определения и локализации множества разнообразных веществ, представляющих интерес для биолога. Но как можно обнаружить или измерить взаимодействие антитела с антигеном Начальная реакция связывания антигена с антителом-так называемая первичная реакция-может быть измерена многими различными способами. При радиоиммунном анализе, позволяющем определять даже ничтожные количества материала, известное количество радиоактивного антигена вместе со стандартным количеством антител добавляют к образцу, содержащему неизвестное количество того же антигена в нерадиоактивной форме. Немеченый антиген конкурирует с меченым за связывающие участки антител, и чем больше данного антигена в образце, тем меньше радиоактивного антигена будет связано с антителом. Свободный радиоактивный антиген можно отделить от связанного, а затем измерить количество того и другого с помощью ряда методов, использующих различия в свойствах свободных и связанных молекул один нз общих подходов состоит в осаждении (преципитации) комплексов антиген-антитело антителами к иммуноглобулинам (рнс. 17-28). [c.27]

    Ной пространственной конформации беЛковой молекулы и состоят из аминокислотных остатков, не расположенных последовательно в полипептидной цепи, но благодаря укладке последней пространственно сближенных. В отличие от них линейные детерминанты представляют собой пептидные сегменты из 5—8 аминокислотных остатков. При изучении антигенной структуры фермента определяют структуры его антигенных детерминант путем изучения взаимодействия антител с пептидными фрагментами фермента. [c.326]

    Работа такой системы — молекулярной машины — организована посредством прямых и обратных информационных потоков, посредством молекулярной сигнализации. В живой системе сигналами, их источниками, приемниками и преобразователями служат молекулы и надмолекулярные структуры. Узнавание сигнала определяется многоточечными слабыми взаимодействиями, имеющими кооперативный характер. В этой книге рассмотрен ряд явлений молекулярного узнавания — взаимодействие фермент — субстрат, взаимодействие комплементарных нуклеотидов, реализуемое в двойной спирали ДНК, в транскрипции, а также в трансляции (т. е. взаимодействие кодона с антикодоном). К тем же явлениям относится взаимодействие антитела с антигеном, в этой книге не рассмотренное. [c.608]

    Как функционируют иммуноглобулины Одна из реакций, агглютинация, происходит в результате взаимодействия поливалентного антитела с двумя клетками. Чаще, однако, взаимодействие антитела с антигеном вызьшает другие эффекты. Один из таких эффектов — связывание белка СЦ, входящего в состав комплемента (дополнение 5-Ж). Было установлено, что с белком lq связывается Сн2-домен Рс- [c.384]

    В организме животных и человека в ответ на введение полисахаридов или углеводсодержащих биополимеров — антигенов образуются антитела — соединения белковой природы — иммуноглобулины. Антигены и антитела имеют соответствующие друг другу участки молекул, вследствие чего происходит высокоспецифическое нековалентное взаимодействие этих веществ, приводящее к образованию осадков. [c.102]

    Защитная функция. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков. Высокая специфичность взаимодействия антител с антигенами (чужеродными веществами) по типу белок-белковое взаимодействие способствует узнаванию и нейтрализации биологического действия антигенов. Защитная функция белков проявляется и в способности ряда белков плазмы крови, в частности фибриногена, к свертыванию. В результате свертывания фибриногена образуется сгусток крови, предохраняющий от потери крови при ранениях. [c.21]

    Если антиген или антитело в качестве метки содержат электроактивную группу, то образование комплексов АГ-АТ, как правило, приводит к изменению скорости электрохимической реакции. Так, в присутствии антител ток окисления морфина, меченного ферроценом, уменьшается, а волна восстановления ацетата ртути, связанного с эстриолом, смещается к более отрицательным потенциалам. В качестве метки могут служить и ионы металлов, образующие комплексные соединения с хелатообразующими реагентами, пришитыми к белкам. В результате взаимодействия антител с мечеными антигенами ионы металлов высвобождаются и могут быть определены методом инверсионной вольтамперометрии. Одновременно можно определять несколько компонентов, используя в качестве метки различные ионы. [c.507]

    АНТИГЕНЫ, АНТИТЕЛА, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ [c.89]

    Рассмотрен подход к решению обратной структурной задачи, основанный на физической конформационной теории природных пептидов и белков, прежде всего оценке особой роли ближних взаимодействий в их структурной организации и использовании классификации пептидных структур на шейпы, формы и конформации. Показано, что можно добиться целенаправленного и контролируемого изменения структуры пептида за счет ближних взаимодействий простыми средствами, выработанными в процессе эволюции органического мира. Изложенный в книге подход к решению обратной задачи позволяет заранее, еще до синтеза и биологических испытаний целенаправленно конструировать модели искусственных аналогов, пространственные структуры которых отвечают низкоэнергетическим и физиологически активным конформационным состояниям природного пептида. Возможности теоретического моделирования искусственных аналогов продемонстрированы на конкретных примерах. Полученные результаты подтверждают необходимость его использования в изучении молекулярных механизмов функционирования пептидных гормонов, катализа ферментов, взаимодействий антител с антигенами и т.п. (см. гл. 17). [c.590]

    Реакция антиген — антитело. Если чужеродные тела попадают в кровяное русло, то в ответ обычно образуются специфические растворимые в сыворотке белки, называемые антителами. Любой субстрат, который может вызвать образование антитела, называется антигеном генерирующий антитело)-, в эту категорию попадают все патогенные микробы. Антигенами являются токсины—ядовитые продукты обмена некоторых бактерий. Антитело соединяется с антигеном и обезвреживает его. Такое взаимодействие [c.349]

    При введении в кровь человека чужеродных клеток или биополимеров (антигенов) происходит выработка антител, способных специфически связываться с введенными антигенами. При повторном введении антигена могут наблюдаться две различных реакции 1. Антиген взаимодействует с антителом и быстро удаляется из тока крови, в результате чего наблюдается невосприимчивость, например, к заражению бактериями данного вида (иммунитет). 2. Взаимодействие антитела с антигеном сопровождается выделением веществ, возбуждающих нервные окончания, в результате чего происходит резкое повышение чувствительности организма к данному антигену (анафилаксия). В некоторых случаях анафилаксия может приводить к смерти. Подробнее о явлениях иммунитета и анафилаксии см. .  [c.604]

    ИММУНОХИМИЯ — наука, изучающая химич. процессы, с к-рыми связана невосприимчивость организма к инфекционному заражению (и м м у н и -т 0 т), а также повышенная чувствительность к повторному введению в организм нек-рых веществ. Невосприимчивость может быть обусловлена врожденными особенностями организма (естественный иммунитет), а также создана искусственно (приобретенный иммунитет). Химич. основы естественного иммунитета могут существенно различаться в случае разных инфекций (напр., наличие у нек-рых организмов специальных ферментов, разрушающих биосубстраты бактерий наследственно закрепленная аномалия гемоглобина, пагубно влияющая на возбудителя малярии, и т. п.). Главным предметом изучения И. является приобретенный иммунитет, в основе к-рого лежит способность организма, в ответ на попадание в него ряда веществ антигенов) синтезировать специфич. белки — антитела, к-рые взаимодействуют именно с этими веществами или веществами, близкими к пим ио структуре. Основные проблемы И. изучение химич. природы антигенов, механизма биосинтеза антител, изучение взаимодействия между антигенами и антителами, создание химич. методов определения содержания антител и выделения их из сыворотки в чистом виде, изучение структуры антител. [c.111]

    Комплемент представляет собой сложный комплекс белков, состоящий из 20 взаимодействующих компонентов, обозначаемых С1, С2, СЗ и т. д. до С9, фактор В, фактор О и ряд регуляторных белков. Все они являются водорастворимыми белками с молекулярными массами от 24 000 до 400 000 (табл. 9), циркулирующими в крови и внеклеточной жидкости. Большинство этих белков являются неактивными вплоть до запуска системы в момент образования комплекса антиген — антитело. После активации комплемента его действие носит каскадный характер и представляет собой серию протеолитических реакций. Образно говоря, отношения между антителами и комплементом напоминают собой отношения между ключом зажигания и мотором взаимодействие антитела с антигеном включает мотор. [c.220]

    Путь от антигена к синтезу антитела-индуцируемый процесс. Однако этот феномен может быть объяснен и без ссылки на ламаркизм при помощи клональной селекционной теории, основные положения которой суммированы на рис. 39.2. Рекомбинация V- и С-генов, приводящая к образованию функционального гена, происходит в популяции незрелых В-лимфоцитов. Каждая клетка образует антитело только одной специфичности, что предполагает только одну перестройку в генах легких цепей и одну перестройку в генах тяжелых цепей. Разные клетки продуцируют разные антитела, поскольку при каждом новом акте реконструкции соединяются разные V- и С-гены. При появлении антигена клетка, вырабатывающая антитело, специфичное к данному антигену, стимулируется к делению, возможно, благодаря какому-то сигналу, поступающему с клеточной поверхности, где происходит взаимодействие антитела с антигеном. В результате последующих клеточных делений появляется большое число новых лимфоцитов, секретирующих данное антитело в таких огромных количествах, что оно может стать доминирующим в популяции антител. Следует заметить, что весь этот процесс происходит исключительно в соматических клетках и не затрагивает клетки зародышевой линии таким образом, ответ организма на антиген по наследству не передается. [c.504]

    Вопросы взаимодействия антител с антигенами [c.322]

    Изменения энтальпии всех изученных реакций антитело — антиген или антитело — гаптен, за исключением случая, приведенного в пункте , слишком малы, чтобы объяснить характеризующую эти взаимодействия прочность связей и тот факт, что реакция идет практически до полного завершения. Оче- [c.174]

    Взаимодействие между антигеном и антителом осуществляется посредством электростатических сил, возникающих между полярными группами. Этот вопрос уже рассматривался в гл. X, причем было подчеркнуто, что эти силы действуют только на очень небольших расстояниях, так как интенсивность их [c.345]

    Образовавшиеся антитела поступают в плазму крови и связываются там с молекулой антигена. Взаимодействие антител с антигеном осуществляется путем образования между ними нековалентных связей. Это взаимодействие аналогично образованию фермент-субстратного комплекса при ферментативном катализе, причем связывающий участок антитела соответствует активному центру фермента. Поскольку большинство антигенов являются высокомолекулярными соединениями, то к антигену одновременно присоединяется много антител. [c.109]

    Иммунохимия — раздел иммунологии, задачей которого является изучение строения, свойств и закономерностей взаимодействия антител и антигенов. [c.552]

    В некоторых случаях появление фермента в растворе является следствием специфического взаимодействия АГ-АТ Для этого фермент заключают внутрь липосом, к поверхности которых химически присоединен антиген Добавление антитела приводит к образованию комплексов АГ-АТ на липосоме и ее лизису, который сопровождается переходом фермента в раствор. Акгивность фермента служит мерой концентрации антигена 4 Время анализа около 15 мин, нижняя граница огфеделяемых концентрагцгй 10 моль/л. Кроме ферментов в липосомы могут быть включены и другие маркеры. [c.301]

    Величина этого параметра определяет возможность применения тех или других антител. Иммуноанализ и гистохимические методы требуют антител с высоким сродством (/Ссв=Ю-э—чтобы комплексы антигена с антителами были очень прочными С другой стороны, имму-ноаффинная очистка лучше осуществляется с низкоаффинными антителами Ксв=10- —10- ), поскольку в этих условиях адсорбция и освобождение антитела проходят при относительно мягких условиях без повреждения антигена и антител и колонка может использоваться повторно. Анализ взаимодействия антител с антигеном проводят по методу Скэтчарда (см. с. 343) с использованием радиоиммунного анализа. [c.324]

    Ввиду поливалентности белковых антигенов, бивалентности антител и присутствия в иммунной сыворотке популяции антител, специфичных к разным антигенным детерминантам, реакция взаимодействия между антигеном и антителом создает комплекс, образование решетки которого зависит от соотношения количеств антигена и антител. На рисунке 4.2 Л показаны три экстремальные ситуации. Эта характерная особенность реакции антигена и антитела очень важна для принципов нескольких иммунохимических методов. [c.95]

    Защита организма от чужеродных биоиолимеров и, тем самым,, от инфекционных микроорганизмов осуществляется посредством клеточного и гуморального иммунитета (см. 17.9). Во втором случае иммунитет определяется взаимодействием антител (АТ) — особых белков, производимых лимфатическими клетками,— с чужеродными биополимерами, именуемыми в зтом случае антигенами (АГ). Иммунный ответ, т. е. появление антител в организме, есть результат узнавания антигенов определенными популяциями лимфоцитов. Процесс развивается на уровне организма, в нем участвуют различные клеточные узнающие системы, являющиеся обучающимися , так как они приобретают память об однажды введенном антигене и отвечают на его вторичное введение усиленной выработкой антител. [c.122]

    Изучение явления специфической преципитации, возникающей при взаимодействии антител с антигенами in vitro, в конце прошлого столетия привело к возникновению новой научной дисциплины — иммунохимии, которая включает изучение химических аспектов иммунитета, в первую очередь химии антигенов, антител и их взаимодействия. Высокая чувствительность и специфичность иммунологических реакций позволили применить их с большой пользой для исследования белков. Иммунохимия не только увеличила методические возможности изучения белков, но и создала новое направление их анализа. [c.15]

    Основу серологического исследования составляет иммунологическая реакция — специфическое взаимодействие антитела (АТ) с антигеном (АГ). Эту реакцию называют серологической, так как для ее постановки используют сыворотку (serum), содержащую антитела. [c.57]

    Для повышения чувствительности тестов антигены или антитела адсорбируют на эритроцитах (РНГА, РОНТА, РТОНГА, РГадсТО, РРГ), метят их ферментами (ИФА), радиоактивными изотопами (РИА, РПГ), флюорохромами (РИФ) или же используют принцип лизиса эритроцитов при взаимодействии антигенов и антител в присутствии комплемента (РСК, РРГ). [c.273]

    Взаимодействие антител с их антигенами сравнимо по специфичности со связыванием субстратов с ферментами. Константы диссоциации комплексов, как правило, находятся в инт ервале 10 5—10 8 моль/л [39]. Для выделения антител используются антигены или гаптены (химически модифицированные группы, выступающие в роли иммуноагентов после их присоединения к белкам или синтетическим полипептидам), против которых эти антитела. получены. В табл. 11.1 даны многочисленные примеры. [c.114]

    Ограниченные запасы витаминов и гормонов в- животных привели к развитию механизмов адсорбции, транспорта и консервации этих веществ в следовых количествах. В таких процессах важную роль играют специфические транспортные или связывающие белки, предотвращающие быстрое выведение витаминов и гормонов с мочой, которое происходило бы, если витамины и гормоны не были бы связаны в плазме в соответствующих комплексах. Связывающие белки присутствуют в очень низких концентрациях. Например, белки, прочно связывающие витамин В12, траноко баламины I и И, находятся в плазме крови человека в концентрациях соответственно 80 и 20 мг на 1000 л. Однако они обычно имеют высокое сродство к комплементарным витаминам и гормонам. Константы диссоциации этих комплексов находятся в интервале от 10 до 10 моль/л [35]. Из-за низких концентраций эти белки нельзя выделить классическими методами очистки наличие специфических взаимодействий с высоким сродством позволяет использовать аффинную хроматографию, которая допускает работу с большими объемами исходного материала. Как и для взаимодействий антитело — антиген, трудности заключаются в последующем выделении белка из комплекса с аффинными сорбентами. [c.124]

    Однако многие методы анализа основаны на торичнмх реакциях, т. е. ка-, ких-то последствиях первичного взаимодействия антитела с антигеном К этим вторичным реакциям относятся преципитация, агглютинация клеток и связывание комплемента. Последнюю реакцию можно использовать пото му, что компоненты системы комплемента связываются только с антителоц находящимся в комплексе с антигеном при этом исчезновение компоненто комплемента может служить мерой количества образующегося комплекса антиген-антитело. Однако чаще всего применяют реакцию преципитации антигена с антителом в жидкостях или гелях. Например, в методе Ухтермни антиген и антитело помещают в отдельные лункн, вырезанные в агаровом геле, Реагенты диффундируют из лунок до тех пор, пока не встречаются друг с другом в оптимальных соотношениях для образования преципитата, который становится видимым как непрозрачная полоса, рассеивающая свет (рис. 17-29).  [c.28]

    Очень тонкую дифференцировку сложных белковых смесей позволяет осуществить качественный иммунохимич. метод, основанный на выявлении преципитации в геле, где происходит взаимодействие антигенов и антител, диффундирующих навстречу друг другу. Еще большие возможности дает сочетание этого метола с электрофорезом в агаровом геле (тшуноэлектро-форетич. метод П. Грабаря). Последний метод позволяет выявить в сыворотке человека более 25 белковых фракций, различающихся по антигенным свойствам. [c.112]

    В заключение остановимся на реакции химических гаптенов и комплексных антигенов с химической детерминантой с антителами. Известно, что взаимодействие антигена с антителом обусловливается силами, действующими только на очень близком расстоянии. Так, например, активный центр антитела превосходит по своим размерам гаптенную детерминанту всего на 0,3—0,5 нм. На таком расстоянии связь мож т быть обусловлена гидрофобным взаимодействием, электростатическими силами, силами ван дер Ваальса, водородными связями или диполь-дипольным взаимодействием. Каждому гаптену в зависимости от его структуры свойственны те или иные типы связей (табл. 8). При взаимодействии антител против р-азобензойной кислоты со специфичными антителами константа связывания равна 1,0. Если уменьшить (замена гексилом) или полностью исключить (замена ме-тильной группой) гидрофобные взаимодействия, обусловленные бензольным кольцом, то константа связывания уменьшается в 500—1000 раз. Если ослабить электростатические силы, связанные с отрицательным зарядом карбоксильной группы, введением добавочных радикалов в бензольное кольцо или заменой карбоксила на АзОз, то константа связывания также уменьшается в 7—1000 раз. [c.47]

    Книга принадлежит перу крупнейшего американско- го ученого В. Бойда. В основу книги положен материал лекций, прочитанных автором в Москве. Несмотря на небольшой объем, в ней рассмотрены все главные разделы иммунохимии химия антител, антигены и условия антигенности, группы крови и гемоагглютиногены, механизм взаимодействия антител с антигеном. [c.4]

    Имея дело с поливалентными антигенами, которые могут соединяться одновременно с несколькими молекулами антител, мы сталкиваемся с фактом чрезвычайного усложнения математического описания реакции, которое необходимо по возможности упростить, вводя некоторые допущения. Самое простое из них заключается в том, что свободная энергия соединения молекулы антитела с взаимодействующим участком антигена одинакова для всех этих участков и не зависит от числа ранее присоединенных к антигену молекул антител. С помощью этого допущения, которое едва ли является строгим, но которое, конечно, может быть использовано как первое приближение, можно легко разрешить задачу, что и сделали Линдерстром-Ланг [16], фон Муральт [17], Фаулер [8], Вимен [24] и Клотц [15]. Если мы обозначим константу ассоциации для образования единичной связи Ат — Аг через К и количество взаимодействующих участков на молекуле антигена (или на клетке) через т, то мы найдем отношение г, т. е. число молекул антител, соединенных с молекулой антигена  [c.169]

    К вопросу, какой полимер следует считать химически реакционноспособным, можно подходить с различных точек зрения. Если прибегнуть к образному сравнению, то эти точки зрения взаимосвязаны, подобно полимерным цепям в сшитом полимере. Так, исходя, например, из поливинилгидрохинонов, путем аналогий соотношений между обобщенной кислотно-основной к обобщенной окислительно-восстановительной химией, мы возвращаемся к области поликислот, полиоснований и вообще ионообменников= Но может возникнуть также вопрос, как прочно реакционноспособная группа должна быть связана с полимерной цепью, чтобы полимер мог называться химически реакционноспособным, в отличие, например, от адсорбции или даже своего рода раствора активной группы в отдельной мицелле, образованной свернувшейся в клубок цепью полимера. Поиски ответа на такой вопрос, как и на любой другой, относящийся к пограничной области химического и физического взаимодействия, вводят нас непосредственно в область химии природных соединений — энзимов, витаминов, антигенов и антител — и в то же время в исследование соединений включения, молекулярных комплексов и во всю увлекательную область исследования влияния сочетания модельной группы (или, в общем, реакционноспособной группы) с субстратом на ее свойства. [c.239]

    В ходе биологической эволюции организмы животных и растений выработали специальные факторы собственной защиты против вирусов, бактерий, простейших организмов и других патогенных факторов с целью сохранения своей целостности и биохимической индивидуальности. Способность организмов идентифицировать, нейтрализовать и удалять чужеродные ему химические соединения с целью обеспечения собственной целостности называется иммунитетом (от лат. ттипШз — освобождение, избавление от чего-либо). Синонимы иммунитета — невосприимчивость, сопротивляемость, резистентность. Наука об иммунитете — иммунология наряду с изучением общебиологических основ иммунитета занимается исследованием химического строения, свойств и закономерностей взаимодействия антител и антигенов. Данная область иммунологии называется иммунохимией. [c.484]

    Процесс взаимодействия антитело—антиген отличается высокой селективностью (рис. 18.3), что наглядно демонстрируется в опытах с синтетическими антигенами. Низкомолекулярные вещества сами по себе не индуцируют синтез антител, но после их присоединения к молекуле белка стимулируется образование антител как к белку, так и к присоединенному низкомолекулярному веществу. Если в роли последнего выступают сходные по химической природе вещества, например пара-, мета-и ор о-изомеры бензойной кислоты, то по отношению к каждому из них синтезируются специфические антитела, не реагирующие с другими изомерами. Избирательность взаимодействия обусловлена строгой компле-ментарностью между структурой активного центра антитела и структурой некоторого участка антигена. [c.487]

    Сродство антитела отражает силу взаимодействия антигенной детерминанты с отдельным антиген-связывающим участком, каким бы ни было число таких участков. В отличие от этого общая авидность антитела по отношению к мультивалентному антигену (такому, как полимер с повторяющимися субъединицами) характеризует суммарную силу" взаимодействия всех связывающих участков антитела, вместе взятых. Когда мультивалентный антиген взаимодействует более чем с одним антиген-связываюшим участком антитела, сила связывания резко возрастает для того чтобы антиген и антитело могли диссоциировать, все их связи друг с другом должны быть разорваны одновременно. Поэтому типичная молекула IgG при вовлечении в реакцию обоих антиген-связывающих участков будет связываться с мультивалентным антигеном по меньшей мере в 1000 раз сильнее, чем в случае, когда вовлечен лишь один участок. [c.237]

    Г ипотеза совместного узнавания МНС дала по меиьшей мере возможные ответы на многие вопросы, первоначально возникшие в связи с экспериментами по трансплантации органов, однако она породила новую проблему каким образом весьма небольшое число разных молекул МНС данного животного (менее двух десятков) может связываться с набором разных пептидов, достаточно широким для того, чтобы обеспечить ответ Т-клеток практически па любой белковой антиген Взаимодействия антигена с антителом и с гликопротеинами МНС класса 1 стали попятпы в результате рентгеноструктурного анализа этих молекул. Такие исследования необходимо теперь распрострапить на взаимодействие между комплексом МНС-антиген и Т-клеточным рецептором. Технология рекомбинантных ДНК должна в скором времени обеспечить достаточные количества Т-клеточных рецепторов в растворимой форме, что сделает проекты гакого рола реальными. В результате работ с использовапием рекомбинантных ДНК уже было показано, что все эти белки - молекулы МНС, Т-клеточные рецепторы и антитела - имеют давнюю обшую историю. [c.281]

chem21.info

Статья - Иммунологические методы, основанные на взаимодействии антиген–антитело

ГОУ ВПО

(КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)

Биологический факультет

Кафедра генетики

Реферат для большого практикума по молекулярной

генетике и иммунохимии

Тема: Иммунологические методы, основанные

на взаимодействии антиген – антитело

Преподаватель

д.м.н. А.В. Шабалдин

Работу выполнила

ст. 5 курса

биологического факультета

Лунина А.А.

КЕМЕРОВО 2007

Содержание
Введение

1. Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони

Принцип

Проведение иммунодиффузии

Оценка результатов

Определение титра

Область применения

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

Принцип

Проведение иммунодиффузии

3. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

Принцип

Проведение исследования

Оценка метода

4. Нефелометрия

Принцип метода

Проведение исследования

Оценка метода

5. Иммунодот и иммуноспот

6. Список литературы

Введение

В современное время широко используют методы, основанные на взаимодействии антиген – антитело. К данным методам относятся методы иммунодиффузии, нефелометрии, иммунодот и иммуноспот. Они широко используются для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными. Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных.

1. Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони

1.1. Принцип

В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации.

1.2. Проведение иммунодиффузии

Расплавляют агар (1,5 г) на водяной бане в 100 мл одного из предлагаемых растворителей (0,15 М раствор NaCl, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1). Горячий агарозный гель разливают по 3 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально.

Чтобы усилить сцепление геля с поверхностью стекла, предметные стекла рекомендуется покрыть агаровой пленкой. Для этого на стекло наносят 1%-ный водный агаровый золь и высушивают при 70°С.

В зависимости от задачи иммунохимического анализа для вырезания лунок в геля применяют либо специальные штампы разного профиля, либо инъекционные иглы, металлические или стеклянные трубочки с разными краями. Лунки для антигенов и антисыворотки располагают на расстоянии не менее 4 и не более 10 мм.

Заполнив лунки соответствующими растворами, пластинки помещают во влажную камеру. Иммунодиффузию можно проводить при 4, 20 и 37°С. Она длится не менее 24ч и может продолжаться до 6-7 дней. Образование новых линий преципитации следует наблюдать ежедневно. Продолжительность иммунодиффузии зависит от конкретной задачи исследования и от ряда других факторов. Результаты иммунодиффузии учитывают непосредственно на влажном препарате или сначала удаляют непреципитировавшие белки. Для этого препараты 2-3 раза погружают на 12 ч в ванночку с 0,15 М раствором NaCl, затем поверхность геля накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде, и высушивают при комнатной температуре. Высушенные препараты окрашивают, например амидо-черным 10В, и учитывают результаты иммунодиффузии.

1.3. Оценка результатов

Число линий преципитации

У разных антигенов часто бывают сходные коэффициенты диффузии. Поэтому в многокомпонентных системах антиген-антитело в одном и том же участке геля могут появиться преципитаты разной специфичности, образующие одну линию преципитации. В других случаях концентрации антигенов и антител и их соотношения могут оказаться настолько неблагоприятными, что заметной преципитации просто не произойдет. Поэтому число видимых линий преципитации обычно меньше числа систем антиген-антитело и лишь в лучшем случае равно ему.

Расположение преципитатов между лунками

При оптимальном соотношении между антигеном и антителом линия преципитации располагается почти посередине между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунки другого реагента. Относительная концентрация реагентов в месте первоначальной преципитации может изменится, например из-за дополнительного поступления одного из них; тогда происходит сдвиг фронта преципитации, но часть иммунных агрегатов, особенно на стороне избытка антител остается в прежнем положении, и их можно обнаружить в виде вуали или отдельной зоны преципитации. Возможность подобных явлений заставляет при длительной иммунодиффузии ежедневно просматривать препараты.

Взаимное расположение линий преципитации: сравнительный анализ

Для выявления полной или частичной идентичности в геле обычно вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из низ помещают сравниваемые растворы антигенов, а в третью – антисыворотку.

Если линии полностью сливаются, то антигены полностью идентичны. Если линии пересекаются, то антигены не идентичны. Если одна из линий длиннее другой, и выходя из нее образует шпору, то антигены частично идентичны. Оба антигена имеют некоторые общие детерминанты, но у одного антигена имеются детерминанты, которых нет у второго, именно они образуют шпору. Если две линии преципитации пересекаются, частично сливаясь, антигены имеют как одинаковые, так и различные детерминанты.

1.4. Определение титра

Готовят последовательные двукратные разведения изучаемого антигена и равные объемы каждого разведения вносят в лунки, расположенные по периферии той лунки, в которой антисыворотка (стандартный объем). При оценке результатов иммунодиффузии учитывают:

1. расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферических лунок;

2. последнее разведение антигена, которое еще дает видимый преципитат;

3. интенсивность и ширину полос преципитации.

Последнее разведение антигена, дающее преципитат, считают его титром. Подобным образом можно титровать содержание антител в антисыворотке.

1.5. Область применения

Качественный анализ, например для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными.

Метод обладает высокой специфичностью, при количественных вариантах иммунодиффузии ошибка метода составляет 3-7%.

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

2.1. Принцип

Гель, содержащий антисыворотку, помещают в стеклянные трубки или пробирки. Трубки вертикально погружают в раствор антигена, и в пробирках раствор антигена наслаивают на гель. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и, соединившись со специфическими антителами, образуют с ними беловато-мутные преципитаты. Число линий преципитации зависит от числа реагирующих систем антиген-антитело. Чем продолжительнее диффузия, тем дальше фронт преципитации каждой линии удаляется от границы, разделяющей гель и жидкость. Расстояние, которое он проходит за определенное время при строго постоянной концентрации антисыворотки в геле, зависит только от концентрации диффундирующего антигена. При постоянных условия опыта (температура, серия антисыворотки и ее концентрация в геле, концентрация самого геля) с помощью простой линейной иммунодиффузии можно определять количество антигена.

2.2. Проведение иммунодиффузии

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки, стандартные растворы антигенов и рабочий стандарт, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1. Специальный агар Noble; стеклянные капилляры для определения гематокрита длиной около 50 мм, с внутренним диаметром 1-1,5 мм; измерительная лупа с точностью до 0,1 мм.

В стеклянные капилляры насасывают и выдувают обратно 1%-ный горячий золь агара на воде. Затем капилляры высушивают при 70°С. Образовавшаяся агаровая пленка усиливает сцепление геля со стеклом и препятствует образованию щелей, в которые мог бы проникнуть антиген.

В 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендируют 2 г сухого агара и нагревают на водяной бане до расплавления. Агар охлаждают до 48°С и смешивают с равным объемом подогретой до 48°С антисыворотки. В эту смесь погружают капилляры, с тем чтобы она заполнила их на 2-3 см. Когда гель затвердеет, капилляры готовы к употреблению.

Капилляры погружают в растворы антигенов, но перед погружением капилляров в антиген следует довести температуру всех реагентов до нужной величины, например до 4°С. Реакция длится 48 ч. Затем измеряют расстояние, которое прошел фронт преципитации в каждом капилляре.

Для того, чтобы антиген мог диффундировать в гель, содержащий антитела, он должен быть в избытке. Скорость миграции преципитата К можно вычислить, разделив расстояние h, на квадратный корень из времени диффузии t.

При постоянном времени диффузии между логарифмом концентрации антигена и расстоянием, которое проходит фронт преципитации, существует прямая линейная зависимость. Наклон калибровочной кривой прямо пропорционален квадрату коэффициента диффузии антигена и обратно пропорционален концентрации антител в геле и вязкости геля.

Оценка метода

Критическим фактором является температура. Продолжительность инкубации зависит от величины диффундирующих молекул, чаще всего длится 12, 24 или 48 часов.

3. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

3.1. Принцип

На ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий антитела. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации.

3.2. Проведение исследования

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки; стандартные растворы антигенов; рабочий стандарт; веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1; агар; рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, кюветы для элюции из комплекта для электрофореза; измерительный инструмент с точностью до 0,1 мм; микрошприц.

Нагревают 1,5 г агара до полного расплавления в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяной бане и, охладив до 48°С, смешивают в нужной пропорции с антисывороткой, подогретой до той же температуры. Смесь разливают по 2 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. Золь должен равномерно распределиться по поверхности стекла. Чтобы усилить сцепление геля со стеклом, рекомендуется предварительно покрыть стекло тонкой агаровой пленкой.

В пластинке геля вырезают лунки, рассчитанные на 2 мкл антигенного раствора каждая. После внесения антигена пластинки геля помещают во влажную камеру и проводят иммунодиффузию при комнатной температуре. Кольца преципитации можно измерять прямо на влажной пластинке. Если преципитаты видны недостаточно четко, то сначала элюируют непреципитировавшие белки в двух сменах 0,15 М раствора NaCl по 12 ч, затем гель высушивают и окрашивают красителями, например амидо-черным, и высушивают вновь.

Площадь, занимаемая преципитатом к концу диффузии, прямо пропорциональна исходной концентрации антигена в лунке. Для построения калибровочной кривой берут либо площадь преципитата как функцию концентрации антигена, либо логарифм диаметра преципитата как функцию логарифма концентрации антигена:

S=K*QAГ +S0,

где S – площадь преципитата, включая S0, S0– площадь стартовой лунки и QAГ — количество антигена.

Наклон К полученной прямой обратно пропорционален концентрации антител в геле. Уменьшив содержание антисыворотки в агаре, можно увеличить К. В результате возрастет диаметр преципитата, что повысит чувствительность и экономность метода. Оптимальная концентрация антисыворотки в геле зависит прежде всего от титра антител.

Результаты иммунодиффузии существенно не зависят от температуры. Опыт может быть поставлен при 4, 20 или 37°С. Следует избегать только резких (более 5°) колебаний температуры.

Необходимая продолжительность иммунодиффузии зависит от природы изучаемого антигена. Первый ориентировочный замер преципитатов можно сделать уже через 24 ч.

3.3. Оценка метода

В пределах своей чувствительности радиальная иммунодиффузия пригодна для количественного определения любого антигена, если имеются соответствующие моноспецифические антисыворотки и чистые или стандартные антигены, чтобы построить калибровочную кривую для данной системы.

При помощи этого метода чаще определяют белковые антигены, например белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, секретов желез. Радиальная иммунодиффузия пригодна также для сравнительного качественного и количественного анализа иммунохимически близких белков.

4. Нефелометрия

4.1. Принцип метода

Раствор антигена смешивают с соответствующей моноспецифической антисывороткой и смесь инкубируют. При этом образуются иммунные агрегаты, способные рассеивать проходящий свет. Интенсивность рассеивания или поглощения проходящего света прямо пропорциональна количеству комплексов антиген-антитело, и ее можно измерять фотометрически.

Если объемы реагентов, разведение антисыворотки, время и температура инкубации постоянны и единственной переменной величиной является концентрация антигена, то последнюю можно определить по кривой экстинкции. Чтобы построить такую кривую, с антисывороткой инкубируют растворы антигена возрастающей концентрации. Сначала с увеличением концентрации антигена кривая экстинкции идет вверх, затем, после некоторого максимума, снижается. При постоянном количестве антител подъем концентрации антигена увеличивает не только количество, но и величину иммунных агрегатов. При оптимальном соотношении антигена и антител количество и размер иммунных агрегатов достигает максимума. Область оптимальных соотношений называют зоной эквивалентности. Дальнейший подъем концентрации антигена ведет к уменьшению агрегатов.

4.2. Проведение исследования

Реагенты и приборы

Забуференный фосфатами раствор NaCl. 11,9 г Na2 HPO4 ·2h3 O растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl; 9,1 г Kh3 PO4 растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl. Получается буфер с pH 7,5.

Моноспецифические антисыворотки.

Стандартные растворы. Используются стандартные сыворотки с известным содержанием белков или стандартные растворы, приготовленные из чистых белков.

Рабочий стандарт, если требуется определить содержание различных белков в сыворотке или сывороточных белков в других жидкостях организма.

Стандартные растворы, исследуемые образцы и антисыворотки разводят забуференным раствором NaCl с pH 7,5. Определение антигенов производят с кроличьими антисыворотками в разведении 1:5-1:20. Для построения кривой экстинкции сначала готовят серию разведений антигена от 0,5 до 10 мг на 100 мл. К последним разведениям стандартной сыворотки или раствора чистого белка прибавляют равный объем разбавленной антисыворотки, перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20°С) на 2 ч. После этого определяют экстинкцию растворов в проходящем свете при 450 нм в микрокювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (буфер + антисыворотка). С исследуемым образцом поступают так же, как со стандартными растворами. Определяют его экстинкцию и по восходящей части кривой устанавливают концентрацию антигена. Если приходится исследовать мутные или окрашенные растворы антигенов, следует предварительно измерить их собственную экстинкцию, чтобы учесть ее при оценке результатов. Затем с учетом разведения исходного материала вычисляют концентрацию исследуемого антигена.

Полную уверенность в том, что полученная величина экстинкции соответствует области избытка антител, дает исследование, проведенное с несколькими разведениями антигена. Условия инкубации должны быть строго постоянными. Для фотометрии следует выбирать длину волны, лежащую за пределами областей поглощения гемоглобина (400 – 420 нм). Необходимо также учитывать спектр собственного поглощения реагентов и их смеси до образования иммунных агрегатов.

4.3. Оценка метода

Преимущества нефелометрии – относительная простота и быстрота процедуры, а также возможность ее автоматизации. Однако этот метод предъявляет особые требования к качеству антисыворотки. Она должна содержать достаточно антител, чтобы в разведении антител не менее 1:5 обеспечить величину максимальной экстинкции выше 0,2. Антисыворотка должна быть прозрачной.

5. Иммунодот и иммуноспот

Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных. Однако этот метод имеет ряд недостатков. В модифицированном варианте для адсорбции различных антигенов используют нитроцеллюлозные фильтры. Такую модификацию называют dot-ELISA (точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В dot-ELISA минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку в виде серии точек. Преципитирующие хромогенные субстраты на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют цветные пятна. Фильтры с результатами анализа могут храниться в темноте в течение многих лет без потери окраски.

В dot-ELISA можно применять различные препараты антигенов. На нитроцеллюлозных мембранах можно сорбировать как жизнеспособные или фиксированные формалином простейшие, так и супернатанты, полученные после разрушения клеток.

Пятно антигена наносят в объеме от 0,1 до 3 мкл. В случае препаратов солюбизированных антигенов предпочтительнее использовать мембраны с малым диаметром пор. При применении целых клеток величина пор не играет большой роли.

Все стадии инкубации и промывки выполняют при комнатной температуре. Сначала диски с антигеном обрабатывают блокирующим раствором (3 – 5%-ный раствор очищенного бычьего сывороточного альбумина в солевом триэтаноламиновом буферном растворе). Можно успешно применять и цельную лошадиную сыворотку или 1%-ный раствор нормальной сыворотки кролика в фосфатном буферном растворе с NaCl. При обнаружении антител 50 мкл сыворотки в 1%-ном растворе БСА-СТБ инкубируют на диске. Антитела специфически связываются с антигеном, сорбированном на диске. Затем диски трижды промывают в растворе детергента (0,05%-ный раствор нонидета Р-40 в СТБ, 0,05%-ный раствор твина-20 в солевом растворе трис- НCl). После промывки диски инкубируют с 50 мкл конъюгата аффинно очищенных антивидовых антител с ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза).

После отмывки несвязавшегося материала добавляют преципитирующий хромогенный субстрат. При окислении субстрата ферментом в присутствии пероксида водорода образуется четкое пятно.

При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, затем проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом.

В двухсайтовом dot-ELISA при определении антигенов сначала на подложку наносят специфические антитела. Антигены в пробе связываются с антителами. Потом добавляют меченые специфические антитела против другого эпитопа антигена и проводят реакцию с преципитирующим субстратом. Для таких методик характерна высокая специфичность.

Важным преимуществом метода dot-ELISA является возможность его применения для самых разнообразных медицинских целей. Все модификации dot-ELISA отличаются экономичным расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием для регистрации результатов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. Новые методы иммуноанализа. – М.: Мир, 1991. – С.116.

2. Иммунологические методы. Под ред. Х.Фримеля. – М.: Мир, 1979. – С. 31 – 55.

www.ronl.ru

Иммунологические методы, основанные на взаимодействии антиген–антитело

ГОУ ВПО

(КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)

Биологический факультет

Кафедра генетики

генетике и иммунохимии

Тема: Иммунологические методы, основанные

на взаимодействии антиген – антитело

Преподаватель

д.м.н. А.В. Шабалдин

Работу выполнила

ст. 5 курса

биологического факультета

Лунина А.А.

КЕМЕРОВО 2007

Содержание
Введение

1. Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони

Принцип

Проведение иммунодиффузии

Оценка результатов

Определение титра

Область применения

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

Принцип

Проведение иммунодиффузии

3. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

Принцип

Проведение исследования

Оценка метода

4. Нефелометрия

Принцип метода

Проведение исследования

Оценка метода

5. Иммунодот и иммуноспот

6. Список литературы

Введение

В современное время широко используют методы, основанные на взаимодействии антиген – антитело. К данным методам относятся методы иммунодиффузии, нефелометрии, иммунодот и иммуноспот. Они широко используются для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными. Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных.

В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации.

1.2. Проведение иммунодиффузии

Расплавляют агар (1,5 г) на водяной бане в 100 мл одного из предлагаемых растворителей (0,15 М раствор NaCl, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1). Горячий агарозный гель разливают по 3 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально.

Чтобы усилить сцепление геля с поверхностью стекла, предметные стекла рекомендуется покрыть агаровой пленкой. Для этого на стекло наносят 1%-ный водный агаровый золь и высушивают при 70°С.

В зависимости от задачи иммунохимического анализа для вырезания лунок в геля применяют либо специальные штампы разного профиля, либо инъекционные иглы, металлические или стеклянные трубочки с разными краями. Лунки для антигенов и антисыворотки располагают на расстоянии не менее 4 и не более 10 мм.

Заполнив лунки соответствующими растворами, пластинки помещают во влажную камеру. Иммунодиффузию можно проводить при 4, 20 и 37°С. Она длится не менее 24ч и может продолжаться до 6-7 дней. Образование новых линий преципитации следует наблюдать ежедневно. Продолжительность иммунодиффузии зависит от конкретной задачи исследования и от ряда других факторов. Результаты иммунодиффузии учитывают непосредственно на влажном препарате или сначала удаляют непреципитировавшие белки. Для этого препараты 2-3 раза погружают на 12 ч в ванночку с 0,15 М раствором NaCl, затем поверхность геля накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде, и высушивают при комнатной температуре. Высушенные препараты окрашивают, например амидо-черным 10В, и учитывают результаты иммунодиффузии.

1.3. Оценка результатов

Число линий преципитации

У разных антигенов часто бывают сходные коэффициенты диффузии. Поэтому в многокомпонентных системах антиген-антитело в одном и том же участке геля могут появиться преципитаты разной специфичности, образующие одну линию преципитации. В других случаях концентрации антигенов и антител и их соотношения могут оказаться настолько неблагоприятными, что заметной преципитации просто не произойдет. Поэтому число видимых линий преципитации обычно меньше числа систем антиген-антитело и лишь в лучшем случае равно ему.

Расположение преципитатов между лунками

При оптимальном соотношении между антигеном и антителом линия преципитации располагается почти посередине между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунки другого реагента. Относительная концентрация реагентов в месте первоначальной преципитации может изменится, например из-за дополнительного поступления одного из них; тогда происходит сдвиг фронта преципитации, но часть иммунных агрегатов, особенно на стороне избытка антител остается в прежнем положении, и их можно обнаружить в виде вуали или отдельной зоны преципитации. Возможность подобных явлений заставляет при длительной иммунодиффузии ежедневно просматривать препараты.

Взаимное расположение линий преципитации: сравнительный анализ

Для выявления полной или частичной идентичности в геле обычно вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из низ помещают сравниваемые растворы антигенов, а в третью – антисыворотку.

Если линии полностью сливаются, то антигены полностью идентичны. Если линии пересекаются, то антигены не идентичны. Если одна из линий длиннее другой, и выходя из нее образует шпору, то антигены частично идентичны. Оба антигена имеют некоторые общие детерминанты, но у одного антигена имеются детерминанты, которых нет у второго, именно они образуют шпору. Если две линии преципитации пересекаются, частично сливаясь, антигены имеют как одинаковые, так и различные детерминанты.

1.4. Определение титра

Готовят последовательные двукратные разведения изучаемого антигена и равные объемы каждого разведения вносят в лунки, расположенные по периферии той лунки, в которой антисыворотка (стандартный объем). При оценке результатов иммунодиффузии учитывают:

1. расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферических лунок;

2. последнее разведение антигена, которое еще дает видимый преципитат;

3. интенсивность и ширину полос преципитации.

Последнее разведение антигена, дающее преципитат, считают его титром. Подобным образом можно титровать содержание антител в антисыворотке.

1.5. Область применения

Качественный анализ, например для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными.

Метод обладает высокой специфичностью, при количественных вариантах иммунодиффузии ошибка метода составляет 3-7%.

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

2.1. Принцип

Гель, содержащий антисыворотку, помещают в стеклянные трубки или пробирки. Трубки вертикально погружают в раствор антигена, и в пробирках раствор антигена наслаивают на гель. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и, соединившись со специфическими антителами, образуют с ними беловато-мутные преципитаты. Число линий преципитации зависит от числа реагирующих систем антиген-антитело. Чем продолжительнее диффузия, тем дальше фронт преципитации каждой линии удаляется от границы, разделяющей гель и жидкость. Расстояние, которое он проходит за определенное время при строго постоянной концентрации антисыворотки в геле, зависит только от концентрации диффундирующего антигена. При постоянных условия опыта (температура, серия антисыворотки и ее концентрация в геле, концентрация самого геля) с помощью простой линейной иммунодиффузии можно определять количество антигена.

2.2. Проведение иммунодиффузии

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки, стандартные растворы антигенов и рабочий стандарт, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1. Специальный агар Noble; стеклянные капилляры для определения гематокрита длиной около 50 мм, с внутренним диаметром 1-1,5 мм; измерительная лупа с точностью до 0,1 мм.

В стеклянные капилляры насасывают и выдувают обратно 1%-ный горячий золь агара на воде. Затем капилляры высушивают при 70°С. Образовавшаяся агаровая пленка усиливает сцепление геля со стеклом и препятствует образованию щелей, в которые мог бы проникнуть антиген.

В 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендируют 2 г сухого агара и нагревают на водяной бане до расплавления. Агар охлаждают до 48°С и смешивают с равным объемом подогретой до 48°С антисыворотки. В эту смесь погружают капилляры, с тем чтобы она заполнила их на 2-3 см. Когда гель затвердеет, капилляры готовы к употреблению.

Капилляры погружают в растворы антигенов, но перед погружением капилляров в антиген следует довести температуру всех реагентов до нужной величины, например до 4°С. Реакция длится 48 ч. Затем измеряют расстояние, которое прошел фронт преципитации в каждом капилляре.

Для того, чтобы антиген мог диффундировать в гель, содержащий антитела, он должен быть в избытке. Скорость миграции преципитата К можно вычислить, разделив расстояние h, на квадратный корень из времени диффузии t.

При постоянном времени диффузии между логарифмом концентрации антигена и расстоянием, которое проходит фронт преципитации, существует прямая линейная зависимость. Наклон калибровочной кривой прямо пропорционален квадрату коэффициента диффузии антигена и обратно пропорционален концентрации антител в геле и вязкости геля.

Оценка метода

Критическим фактором является температура. Продолжительность инкубации зависит от величины диффундирующих молекул, чаще всего длится 12, 24 или 48 часов.

mirznanii.com


Смотрите также