Перекрестно-реактивные антитела анти-il-17a/il-17f и способы их применения. Перекрестные антитела


Антитела связывают антиген нековалентно. - стр.3

Рис. 6. Схема строения активного центра антитела. FR — каркасные регионы, CDR — гипервариабельные регионы

Антитела связывают антиген нековалентно. Площадь контакта антигена и антитела оценивается в 700 А2. Силы, принимающие участие во взаимодействии антиген-антитело:

— электростатические взаимодействия, возникают между заряженными боковыми группировками аминокислот в виде солевых мостиков;

— водородные связи, возникают между электрическими диполями;

— силы Ван дер Вальса, формируются вследствие флуктуации электронных облаков вокруг противоположно поляризованных соседних атомов;

— гидрофобные взаимодействия, происходят в тех случаях, когда две гидрофобные поверхности стремятся сблизиться, вытесняя воду.

Высокие концентрации соли, низкие и высокие значения рН могут ослаблять и разрушать взаимодействие антиген-антитело.

Иммунный ответ на каждый отдельный антиген включает продукцию множества молекул антител, синтезируемых разными плазматическими клетками и имеющих разное строение активного центра и изотип. Вследствие различий в строении активных центров образующиеся антитела имеют разную специфичность и разный аффинитет.

Один клон плазматических клеток, являющихся потомством В-лимфоцитов, продуцирует антитела одной специфичности.

То есть работает закономерность один клон — один тип антител.

Специфичность — направленность против конкретного эпитопа какого-либо антигена.

Аффинитет (аффинность) — прочность связи одного антигенсвязывающего центра с индивидуальным эпитопом антигена. Обусловлен степенью пространственного соответствия (пространственной комплементарности) активного центра антитела и антигенного эпитопа. Мерой аффинитета служит константа равновесия реакции их взаимодействия.

Авидность антител — суммарная сила взаимодействия антитела с антигеном. Антитела содержат от двух до десяти антигенсвязывающих центров. Поливалентность антител существенно усиливает прочность их соединения с антигеном, поскольку для диссоциации образующихся комплексов необходим разрыв сразу всех связей. Применительно к физиологическим условиям более адекватно рассматривать авидность, а не аффинность антител.

Полный набор возможных антител называют антительным репертуаром. По разным оценкам, он включает от 1011 до 1016 молекул антител разного строения.

В отдельных случаях одни антитела могут распознавать вариабельные участки других антител, составляющие их активные центры. Поскольку нет двух В-клеточных клонов, продуцирующих антитела одной и той же специфичности, то разные вариабельные участки активных центров являются, по существу, маркерами разных клонов В-лимфоцитов. Такие участки называют идиотипами (idios (греч.) — собственный, частный). Идиотип — вариант уникального антигенсвязывающего участка молекулы иммуноглобулина. В организме могут нарабатываться антитела против собственных идиотипов, поскольку каждый новый идиотип является антигеном, с которым иммунная система никогда ранее не встречалась. Антиидиотипические антитела, с одной стороны, взаимодействуют с идиотипом, с другой стороны, сами являются новым антигеном для иммунной системы и могут вызывать иммунный ответ на собственный активный центр. Это приводит к возможному появлению антител уже к их идиотипу. Таким образом, формируется антиидиотипическая сеть, несущая иммунорегуляторные функции. В настоящее время этот эффект используется в практической иммунобиотехнологии и лечении некоторых заболеваний. За создание теории антиидиотипической сети Н. Йерне в 1984 году был удостоен Нобелевской премии.

2.3. Биологические функции антител

1. Нейтрализация вирусов.

— Связываются с вирусами, предотвращая их проникновение в клетку и последующую репликацию.

— Вызывают агрегацию вирусов с последующим поглощением фагоцитирующими клетками.

— Взаимодействуют с клеточными рецепторами вирусов, ингибируя связывание вирусов с клеточной поверхностью.

— Блокируют межклеточное проникновение вирусов.

— Обладают ферментативными свойствами.

Антитела особенно эффективны в тех случаях, когда вирусу для достижения клеток-мишеней необходимо пройти через кровоток. Тогда эффективными могут быть даже относительно низкие концентрации антител в крови. Поэтому наиболее очевидный защитный эффект антител наблюдается при инфекциях с длительным инкубационным периодом, когда вирус, прежде чем достичь клеток-мишеней, должен пройти через кровоток, где может быть нейтрализован даже очень небольшим количеством специфических антител.

2. Нейтрализация токсинов.

Циркулирующие в крови продукты бактериального происхождения и другие экзотоксины (например, фосфолипаза пчелиного яда) связываются направленными против них антителами. Антитело, присоединившись вблизи активного центра токсина, может блокировать его взаимодействие с субстратом. Даже связываясь с токсином на некотором расстоянии от его активного центра, антитела могут подавить токсичность в результате аллостерических конформационных изменений. В комплексе с антителами токсин теряет способность к диффузии в тканях и может стать объектом фагоцитоза.

3. Опсонизация бактерий.

Опсонизация — связывание антител с антигенами поверхности бактерий. В результате опсонизации бактерии становятся объектом интенсивного поглощения фагоцитирующими клетками. Действие антител усиливается белками системы комплемента, которые также связываются с бактериальной поверхностью. (Белки системы комплемента могут и самостоятельно опсонизировать бактерии.) На фагоцитирующих клетках имеются рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов и рецепторы для белков комплемента.

4. Активация системы комплемента.

Связываясь с поверхностью клеток, антитела классов IgM и IgG приобретают способность инициировать классический путь активации комплемента. Активация приводит к отложению белков системы комплемента на поверхности бактериальных клеток, образованию пор в мембране и гибели клеток с последующим привлечением к месту событий фагоцитов и поглощением клеток фагоцитами.

5. Антителозависимая клеточная цитотоксичность.

Антитела, связавшиеся с чужеродными антигенами на поверхности клеток, приобретают способность взаимодействовать с Fc-рецепторами на мембране цитотоксических клеток (естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты). Примерами мембранных чужеродных антигенов могут служить вирусные белки, появляющиеся на поверхности вирусинфицированных клеток. В результате взаимодействия антигена с антителом и Fc-рецептором образуется мостик, сближающий клетку-мишень и цитотоксическую клетку. После сближения цитотоксическая клетка убивает клетку-мишень.

6. Защита от паразитов.

Существуют паразиты, слишком крупные, чтобы их можно было уничтожить путем фагоцитоза, например гельминты. Выделяемые паразитом антигены могут взаимодействовать с IgE, связанными через соответствующий рецептор с тучными клетками. В результате такого взаимодействия тучные клетки выбрасывают медиаторы, привлекающие эозинофилы. Последние уничтожают или нейтрализуют гельминтов путем выброса во внеклеточное пространство специфических эффекторных молекул.

7. Иммунорегуляторная функция.

Антиидиотипические антитела взаимодействуют с активными центрами других антител (идиотипами) и осуществляют регуляцию гуморального иммунного ответа, подавляя их активность.

8. Проникновение через плаценту.

В эмбриональный период и первые несколько месяцев жизни, когда собственная иммунная система ребенка еще недостаточно развита, защиту от инфекций обеспечивают материнские антитела, проникающие через плаценту или поступающие с молозивом и всасывающиеся в кишечнике. Через плаценту в кровь плода поступают антитела класса IgG.

Основные классы иммуноглобулинов грудного молока — это IgG и секреторный IgA. Они не всасываются в кишечнике, а остаются в нем, защищая слизистые оболочки. Эти антитела направлены к бактериальным и вирусным антигенам, часто попадающим в кишечник.

2.4. Поликлональные и моноклональные антитела

Сыворотку крови, содержащую антитела к какому-либо антигену, называют антисывороткой. Антисыворотка, как правило, поликлональна, поскольку содержит антитела, продуцируемые разными клонами плазматических клеток. Антисыворотку обычно получают путем иммунизации организма каким-либо антигеном.

Поликлональная антисыворотка может быть моноспецифической, то есть содержащей антитела к разным эпитопам одного и того же антигена. Например, выпускают поликлональные моноспецифические антисыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов М, G, А человека. Каждая такая антисыворотка содержит поликлональные антитела, направленные к различным эпитопам какой-либо цепи иммуноглобулинов.

Моноклональные антитела продуцируются одним клоном плазмоцитов. Разработан метод получения больших количеств моноклональных антител с помощью, так называемой гибридомной технологии, являющейся одной из составляющих клеточной инженерии (рис. 7).

Рис. 7. Основные этапы получения моноклональных антител (МКА)

Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующими антитела одной специфичности. Гибридомы получают путем слияния нормальных плазматических клеток, продуцирующих антитела, с опухолевыми В-лимфоцитами. Затем гибридомы отбирают в культуральной среде, не способной поддерживать рост родительских клеток. С помощью последовательных разведений и пересевов получают одиночные гибридные клетки и их клоны, способные неограниченно долго размножаться в условиях in vitro и продуцировать антитела. Клеточные линии, полученные из таких клеток, называют гибридомами. Используя различные методы культивирования гибридом, нарабатывают большие количества моноклональных антител.

Моноклональные антитела идентичны по своему строению, то есть относятся к одному и тому же классу, изотипу, аллотипу, имеют одинаковые активные центры, обладают одной и той же специфичностью, взаимодействуют с одним и тем же эпитопом антигена с одинаковой аффинностью.

Моноклональные антитела могут нарабатываться в неограниченных количествах и используются в качестве стандартных реагентов в иммунодиагностике, а также в качестве терапевтических антител. За создание гибридомной технологии Келер и Мильштейн в 1984 году получили Нобелевскую премию.

2.5. Перекрестно-реагирующие антитела

Существует два типа перекрестной реактивности антител.

— Антитела, направленные против какого-либо антигена одного вида животных, могут реагировать с антигенами другого вида. Причиной такой перекрестной реактивности является консервативность гомологичных биологических структур, например, белков, сохраняющих свою аминокислотную последовательность неизменной в процессе эволюции. Так, известен высоко консервативный белок, называемый Thy-1 антигеном и характерный для клеток тимуса позвоночных. Моноклональные антитела, взаимодействующие с Thy-1 антигеном человека, реагируют с Thy-1 антигеном земноводных и пресмыкающихся.

— Антитела, взаимодействующие со стереохимически сходными эпитопами, имеющими разную природу. Так, стрептококки несут антигены, конформационно сходные с антигенами сердечных клапанов. В результате, у лиц, перенесших стрептококковую ангину, может развиться ревматизм сердца вследствие наработки в организме перекрестно реагирующих антител к собственным антигенам. Такие антитела называют также аутоантителами, то есть антителами, направленными против собственных антигенов. В здоровом организме аутоантитела обычно присутствуют в следовых количествах.

Наличие эффекта перекрестного реагирования создает определенные трудности в оценке диагностической специфичности.

2.6. Механизмы образования иммуноглобулинов

Иммуноглобулины отличаются от других белков исключительным полиморфизмом. Полиморфизм проявляется в наличии разных изотопов, аллотипов иммуноглобулинов, а также в разнообразии активных центров антител (идиотипов), определяющих их специфичность по отношению к антигенным детерминантам.

Позвоночные в течение жизни способны создавать огромное количество вариантов антител, направленных против разных антигенов. Потенциальное разнообразие антител характеризуется цифрой, равной примерно 1016. Геном позвоночных состоит из нескольких десятков тысяч генов. Так, в составе генома человека присутствует всего 23,5 тысячи генов. Если исходить из основной догмы молекулярной биологии «один ген — один белок», то этого количества генов совершенно недостаточно для того, чтобы обеспечить синтез колоссального числа различных иммуноглобулинов. Однако природа нашла поразительный выход из положения, использовав прием, который характерен только для лимфоцитов.

Во всех клетках, кроме созревающих В-лимфоцитов, кодирующая легкие и тяжелые цепи ДНК находится в так называемой «зародышевой конфигурации». Такую конфигурацию называют также генами зародышевой линии, или гаметными генами.

Тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов кодируются набором кодирующих нуклеотидных последовательностей, названных генными сегментами и разделенных друг от друга некодирующими участками ДНК. Генные сегменты являются предшественниками функционально активных генов и представляют собой экзоны, перемежающие с интронами. В ходе В-клеточного созревания эти генные сегменты перестраиваются и особым образом соединяются вместе, давая функционально активные гены цепей иммуноглобулинов.

У человека и мыши существует три группы генных сегментов, обеспечивающих синтез всего многообразия тяжелых цепей иммуноглобулинов: V (variable — вариабельный), D (diversity — обеспечивающий разнообразие) и J (joining — соединительный). 14-я хромосома человека содержит 51 VH-сегмент, 27 DH-сегментов и 6 JH-сегментов. Сегменты расположены последовательно группами от 5' к 3' концу. V-сегмент кодирует 95-96 аминокислотных остатков, D и J сегменты — 12-14 аминокислотных остатков. К 3'-концу примыкает серия C-генных сегментов, кодирующих константные домены (рис. 8).

Аналогичным образом выглядит зародышевая конфигурация ДНК, кодирующей легкие цепи. Так, ДНК, кодирующая каппа-цепи иммуноглобулина человека, состоит из примерно 40 Vκ-сегментов, пяти Jκ сегментов и одного C-генного сегмента. D-сегменты в ДНК, кодирующей легкие цепи, отсутствуют.

Зародышевая конфигурация ДНК обеспечивает колоссальное разнообразие активных центров иммуноглобулинов благодаря тому, что в созревающих В-лимфоцитах генные сегменты подвергаются перестройке. В ходе такой перестройки случайным образом объединяется по одному V, D и J сегменту (V и J сегменты для легких цепей). Каждый В-лимфоцит получает собственный набор объединенных сегментов. Природа в данном случае играет в биологический конструктор, добиваясь поразительных результатов.

Весь путь созревания В-лимфоцита от незрелой клетки-предшественницы до антителосекретирующей плазматической клетки можно разделить на несколько этапов.

1. Соматическая рекомбинация — перестройка (реаранжировка) генных сегментов, кодирующих вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Это первый этап на пути к синтезу антител и ключевой момент формирования функциональных вариабельных областей легких и тяжелых цепей. Соматическая рекомбинация идет на ранних этапах созревания В-лимфоцитов в костном мозге с участием специализированных ферментов. В результате соматической рекомбинации объединяются генные сегменты, кодирующие вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Объединенные экзоны, кодирующие V-домен, остаются при этом разделены интроном с генными сегментами, кодирующими константные домены. Соматической рекомбинации в ходе созревания В-лимфоцитов сначала подвергаются генные сегменты тяжелой цепи, затем - генные сегменты легких цепей.

Наличие множества генных сегментов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов, и их реаранжировка являются основной причиной полиморфизма активных центров антител. Дополнительным источником разнообразия формирующихся активных центров являются включение вставок между сегментами (так называемые P и N-вставки), вариации в соединении сегментов, приводящие к потере или появлению новых нуклеотидов и, соответственно, к сдвигу рамки считывания, комбинации V-доменов легких и тяжелых цепей при сборке полной молекулы иммуноглобулина и, наконец, соматические гипермутации, происходящие позднее в более зрелых В-клетках.

В перестроенных генах гипервариабельные участки V-доменов иммуноглобулинов кодируются последовательностями, находящимися на границе между сегментами. Гипервариабельность этих участков связана с тем, что дополнительные механизмы формирования разнообразия затрагивают именно эти районы нуклеотидной последовательности.

Перестройка генов легких и тяжелых цепей происходит только в одной из двух гомологичных хромосом. Это обеспечивает аллельное исключение в отношении продуцируемых клеткой антител. В итоге одна В-клетка и ее потомство способны продуцировать только иммуноглобулины, имеющие идентичные активные центры.

Не каждая рекомбинация является продуктивной. Подсчитано, что в результате только одной из трех рекомбинаций формируется функционально активный ген. Если перестройка сегментов ДНК одной хромосомы является непродуктивной, то возможность перестроить генные сегменты получает вторая хромосома. Неудачные попытки перестройки генов приводят к смерти в костном мозге 90% созревающих клеток. Смерть происходит путем апоптоза.

Существование отдельных генных сегментов, кодирующих V и С регионы иммуноглобулинов, и реаранжировку генов в процессе созревания В-клеток обнаружили в 1976 году Тонегава и Хозуми. За открытие механизмов формирования разнообразия антител Тонегава в 1987 году получил Нобелевскую премию.

2. Синтез цепей иммуноглобулинов. Перестроенный ген тяжелой цепи в созревающем В-лимфоците (про-B клетка) содержит объединенные V, D, J сегменты, соединенные на 3'-конце с генными сегментами, кодирующими константные домены иммуноглобулинов разных изотипов. Последовательность расположения таких сегментов от 3' к 5' концу ДНК выглядит следующим образом: μ, δ, γ1-4, ε, α. Самым близким набором генных сегментов являются сегменты, кодирующие константные домены мю-цепи.

Первичный транскрипт РНК содержит нуклеотидные последовательности, включающие некодирующие интроны и генные сегменты, кодирующие домены иммуноглобулинов. Первичный транскрипт процессируется с удалением всех участков нуклеотидной последовательности кроме тех, которые кодируют вариабельный и константные домены мю-цепи.

Образовавшаяся матричная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму, где происходит синтез мю-цепей на полирибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Мю-цепи после синтеза заякореваются на мембране эндоплазматического ретикулюма и объединяются с суррогатным полипептидом, заменяющим им легкую цепь. Затем происходит перестройка гена легкой цепи. На этой стадии В-лимфоцит представляет собой пре-B клетку.

Как тяжелые, так и легкие цепи подвергаются гликозилированию сначала в цистернах эндоплазматического ретикулюма, а затем в аппарате Гольджи, где одновременно происходит сортировка белков и перенос через систему везикул на поверхностную мембрану.

Синтез легкой цепи приводит к появлению на мембране лимфоцита полноценного мембранного IgM и к переходу В-лимфоцита в стадию незрелой B-клетки.

Созревание в зрелую наивную B-клетку сопровождается одновременным появлением на клетке мембранного IgM и IgD. Они имеют один и тот же активный центр, но разные константные домены, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК. Обе формы мембранного иммуноглобулина входят в состав В-клеточных рецепторов. В-лимфоцит, экспрессирующий (несущий на мембране) B-клеточный рецептор, выходит из костного мозга и приобретает способность активироваться при встрече с антигеном, взаимодействующим с активным центром иммуноглобулина.

3. Дополнительные модификации. Зрелые наивные В-клетки мигрируют в лимфоузлы и другие лимфоидные органы, где в результате встречи с антигеном происходит их активация. Активация приводит к трем дополнительным событиям, затрагивающим перестроенные гены иммуноглобулинов и характер их экспрессии:

— Переключение изотипа. Путем альтернативного сплайсинга матричной РНК генные сегменты, кодирующие мю-цепи и дельта-цепи, удаляются. На их место перемещаются сегменты, кодирующие константные домены тяжелых цепей других изотипов. В результате взамен иммуноглобулинов классов М и D В-клетки начинают синтезировать иммуноглобулины класса G, А или Е. Такие иммуноглобулины имеют тот же активный центр (вариабельный домен), но принадлежат к другому изотипу. Каждый В-лимфоцит в этом случае синтезирует иммуноглобулины только одного изотипа. Переключение изотипов регулируется цитокинами.

— Образование растворимых иммуноглобулинов (антител). Активация В-лимфоцитов приводит к их превращению в плазматические клетки — конечный этап дифференцировки В-клеток. Плазматические клетки теряют способность продуцировать мембранную форму иммуноглобулинов, но начинают синтез растворимых иммуноглобулинов. На 3'-конце каждой группы генных сегментов, кодирующих константные домены тяжелых цепей разных изотипов, имеются дополнительные кодирующие последовательности, определяющие принадлежность синтезируемого белкового продукта к растворимой или мембранной форме.

Если в результате альтернативного сплайсинга матричной РНК к сегменту, кодирующему последний константный домен, присоединяется дополнительный экзон, определяющий присоединение к С-концу белковой цепи группы гидрофильных аминокислот (S), то образуется растворимый иммуноглобулин. Если в этом участке остается экзон, кодирующий последовательность, состоящую из гидрофобных аминокислот (М), то образуется мембранная форма (рис. 9). Таким образом, антитела можно рассматривать как растворимую форму мембранных иммуноглобулинов.

— Соматические гипермутации. Затрагивают только гипервариабельные участки, кодирующие V-домены. Происходят в зародышевых (терминальных) центрах лимфоузлов, где концентрируются активированные В-клетки. Скорость соматических гипермутаций составляет 10-3 на одну пару нуклеотидов за одно клеточное деление. Нормальная скорость мутаций составляет 10-8-10-9 на пару нуклеотидов за одно клеточное деление. То есть скорость мутаций вариабельных участков в генах легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов на несколько порядков превышает нормальный темп мутаций. Одна мутация возникает в среднем за два клеточных деления. Клетки делятся каждые 6 часов. Механизм соматических гипермутаций остается неизвестным.

Соматические гипермутации лежат в основе феномена аффинного созревания антител. В зародышевых центрах лимфоузлов происходит отбор и размножение В-лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины с повышенной аффинностью, возникающей вследствие активного мутационного процесса.

3. МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Многие иммунологические методы построены на взаимодействии антиген-антитело. С помощью таких методов можно выявлять как антитела, так и антигены. Определение может быть качественным и количественным. Эта группа методов не требует большого количества материала для анализа (микроанализ). Объем анализируемого материала в наиболее совершенных методах составляет 0,1 мл, а чувствительность достигает десятых долей нанограмма на миллилитр.

3.1. Иммунопреципитация

Метод основан на поливалентности антител. За счет наличия нескольких активных центров в составе иммуноглобулинов они могут взаимодействовать с одинаковыми эпитопами на нескольких антигенах. В результате образуются видимые глазом и выпадающие в осадок агрегаты (преципитат). Если антиген содержит несколько эпитопов, то с ним связывается несколько антител, что увеличивает массу агрегата. Различают иммунопреципитацию в растворе и преципитацию в геле.

Иммунопреципитация в растворе является первым из разработанных методов иммунологического анализа и наименее чувствительным (рис. 10).

Существует количественный вариант иммунопреципитации в растворе, основанный на измерении мутности раствора с помощью нефелометрии.

Иммунопреципитация в геле позволяет определять антитела и антигены с более высокой чувствительностью, которая, однако, недостаточно высока по сравнению с современными методами иммунологического анализа. В качестве геля обычно используют тонкий слой агар-агара или агарозы. Антигены и антитела, нанесенные в лунки на некотором расстоянии друг от друга, диффундируют в толще геля. В месте их встречи образуется видимая глазом полоса (рис. 11).

Таким способом можно определить наличие или отсутствие в пробе антигена или антител. В первом случае в одну из лунок наносят антитела, направленные против искомого антигена. Во вторую — тестируемую пробу. Если образуется полоса преципитата, то в тестируемом образце имеется искомый антиген. При определении антител используют раствор антигена, к которому должны быть направлены искомые антитела. Метод может быть использован для определения веществ, находящихся в концентрации от 10 мкг/мл и выше. Ранее иммунопреципитация широко применялась в лабораторной практике, однако в настоящее время не используется в связи с относительно низкой чувствительностью.

Для методов, основанных на преципитации, важной является соотносительная концентрация взаимодействующих компонентов. Если концентрация одного из компонентов реакции намного превышает концентрацию второго, то преципитат может не выпадать вследствие быстрого истощения одного из компонентов и невозможности образования полноценного преципитата.

refdb.ru

Перекрестная реактивность - Справочник химика 21

    Групповой специфический антиген отсутствует. Некоторые типоспецифические антигены обладают определенной перекрестной реактивностью. [c.133]

    Перекрестная реактивность с другими антигенами [c.91]

    Специфичность моноклональных антител. Основным свойством, на котором основано применение моноклональных антител в иммуноанализе, является высокая специфичность взаимодействия. Поликлональные антисыворотки часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным и даже невозможным [c.170]

    Количественная оценка степени перекрестной реактивности антигенов. В ряде случаев трудно бывает достичь абсолютной специфичности взаимодействия моноклональных антител с антигеном, но такие антитела, тем не менее, могут быть использованы в иммуноанализе при условии, что концентрация перекрестно реагирующих антигенов в анализируемых образцах невелика. [c.172]

    Оценивая значение оптического поглощения раствора субстрата после внесения его в лунки микроплаты, выявляют те концентрации конкурирующих антигенов, которые ингибируют на 50% связывание моноклональных антител с иммобилизованным на полистироле антигеном. Степень перекрестной реактивности оценивают отношением /50 перекрестно реагирующего антигена к /50 исходного чем оно больше, тем меньше степень перекрестной реактивности. [c.173]

    Понятие перекрестной реактивности может быть применено и к антигенам. Перекрестно-реагирующий антиген — это такой антиген, который связывается с антителами, образование которых было индуцировано различными молекулами, обладающими с этим антигеном общими детерминантами. Однако такие соображения ничего не добавляют к концепции перекрестной реактивности. [c.21]

    Применяя МКА к антигенам клеточной поверхности, необходимо учитывать, к каким детерминантам — белковым или углеводным — они специфичны. Каждый антиген обычно имеет уникальные белковые детерминанты, но даже в тех случаях, когда существует перекрестная реактивность с посторонними молекулами, аффинность антител к ним будет слишком низка, чтобы вызвать какие-либо затруднения. Углеводные же детерминанты, наоборот, часто бывают одинаковы у целого ряда гликопротеинов и гликолипидов, поэтому с помощью антител к углеводным частям антигенов клеточной поверхности нельзя добиться нужной степени очистки. Правда, при использовании МКА к гликопротеинам млекопитающих эта проблема не возникает. Среди таких МКА преобладают антитела к белковым детерминантам, возможно, потому что большинство углеводных структур многих видов млекопитающих весьма сходны друг с другом и поэтому не вызывают иммунного ответа у иммунизируемого животного. Однако в природе встречаются и чрезвычайно иммуногенные углеводы. Например, большинство МКА к гликопротеину миксомицет связываются с углеводной детерминантой. общей для множества различных мембранных молекул [19]. [c.173]

    В отличие от этого неистощенные или не полностью истощенные сыворотки часто окрашивают значительный процент клеток. Возможные объяснения такой перекрестной реактивности рассмотрены в разд. VI, В. [c.315]

    Реакциям антиген-антитело свойственна высокая специфичность. Например, противокоревые антитела связываются с вирусами кори и создают иммунитет к этому заболеванию, но не способны связаться с вирусами других видов, в частности с вирусами полиомиелита, и не защищают от них организм. Специфичность антисыворотки суммарно отражает специфичность содержащихся в ней антител, в популяции которых может присутствовать множество паратопов, способных связываться с различными эпитопами или даже с разными частями одного и того же эпитопа рис. 9.8). Однако, если антиген А имеет общие эпитопы с антигеном Б, часть антител, специфичных к А, будет реагировать также и с Б. Этот феномен назван перекрестной реактивностью. [c.153]

    Специфичность, перекрестная реактивность и отсутствие реакции [c.153]

    Специфичность и перекрестная реактивность [c.154]

    Перекрестная реактивность. Способность двух разных антигенов вызывать одинаковую реакцию за счет имеющихся у них общих или сходных детерминант. [c.561]

    Истинную специфичность антител, полученных Ландштейнером, можно продемонстрировать простым лабораторным опытом. Например, было обнаружено, что антитела к гаптену А не могут быть удалены из антисыворотки реакциями с гаптена-ми В, С, О, Е, О, Н... и т. д. Другими словами, антитела к гаптену А специфичны и не имеют сродства (или имеют очень слабое сродство) ко всему ряду рассматриваемых гаптенов. Однако в более чувствительных тестах — реакциях преципитации — можно наблюдать картину перекрестной реактивности (рис. 3.3). На рисунке знак минус (—) означает, что нет заметного осаждения один или несколько знаков плюс (от + до +++) указывают на интенсивность осаждения и означают присутствие нерастворимого комплекса антиген—антитело очень слабое осаждение обозначается ( ). По-видимому, антигены О и С как-то связаны с А. И в самом деле, Ландштейнер смог показать, что О и О имеют с А общую молекулярную структуру. [c.73]

    Перекрестная реактивность антител [c.22]

    В сыворотке иммунизированных животных всегда накапливаются продукты, секретируемые многими клонами В-лимфоцитов. Сывороточные антитела при любых схемах иммунизации представляют собой смесь молекул антител, гетерогенных по специфичности, аффинности и классовой принадлежности, вследствие чего имеется неизбежная перекрестная реактивность иммунных сывороток с разными антигенами. Перекрестная реактивность делает трудным или невозможным идентификацию уникальных антигенов. Моноклональные антитела, в отличие от поликлональных, являются продуктами потомков всего лишь одной В-клетки, и поэтому препараты моноклональных антител имеют особые свойства, вытекающие из небывалой степени биохимической гомогенности моноклональные антитела высокоспецифичны. Они направлены против одной и той же антигенной детерминанты моноклональные антитела стабильны как эталоны в отношении специфичности и аффинности (прочности связи с антигеном). Исследователь может целенаправленно подобрать моноклон, вырабатывающий антитела только нужного сорта , т. е. класса, подкласса, специфичности, аффинитета. [c.309]

    Несмотря на многочисленные исследования, химический механизм возникновения пристрастия к алкоголю изучен плохо [105, 106]. Как и в случае пристрастия к морфину, при алкоголизме повышается толерантность, а отсутствие спирта вызывает болезненное состояние (синдром абстиненции). Основной путь обмена этанола (как всосавшегося в кишечнике, так и образующегося в небольших количествах эндогенно) — это протекающее в печени окисление в химически активный аце-тальдегид >. Последний окисляется далее в ацетат. В основе многих теорий алкоголизма лежит предположение, что влечение к алкоголю (а также, вероятно, и эйфорическое состояние, возникающее у некоторых льющих) обусловлено нарушением обмена этанола в ткани мозга. Существует точка зрения, например, что при взаимодействии ацетальдеги--да с нейромедиаторами образуются алкалоиды аналогичное предположение высказывалось для объяснения механизма развития некоторых психических расстройств (рис. 14-25). Однако совершенно четко показано, что перекрестной реактивности в отношении морфина и этанола у мышей с экспериментальной наркоманией не возникает [107], так что в настоящее время ацетальдегид не рассматривается уже как агент, [c.346]

    Время от времени публикуются наблюдения о якобы присущей самому трипсину химотриптической активности по-видимому, в настоящее время имеются достаточные возможности для установления перекрестной реактивности. Недавние исследования [27] неспедифических реакций этих двух ферментов дают возможность определять незначительные примеси одного из них в препарате другого. [c.124]

    Уже давно отмечено, что для поверхностных антигенов виру классифицированных как вирусы гриппа, характерно полное утствие перекрестной активности. Однако все вирусы, клас фицированные как вирусы гриппа типа А, обладали перекр( но-реактивными внутренними компонентами — матричным нуклеокапсидным белками. Морфология (рис. 43), строение и г дессы репликации вирусов гриппа В и С подобны таковым вирусов гриппа А. Однако не наблюдалось никакой антиген перекрестной реактивности между этими вирусами, поэтому были охарактеризованы как совершенно не связанные между ой антигенные серотипы. Морфология вирионов гриппа А i неразличима при исследовании с помощью электронной миг копии с другой стороны, вирионы гриппа С обладают некс рыми отчетливыми структурными отличиями, которые детал рассматриваются в разделе III. [c.272]

    Белок М1 вируса гриппа В содержит 248 аминокислот, включая инициирующий метионин, хотя матричный белок вируса A/Udorn/72 включает 252 аминокислоты [44]. Из 248 аминокислот белка М1 вируса гриппа В 63 являются общими с белками обоих вирусов, но они располагаются с промежутками и нет последовательности из более чем трех последовательных гомологичных аминокислот. Подобные наблюдения может объяснить отсутствие иммунологической перекрестной реактивности между двумя белками [105], несмотря на наличие 25% аминокислотной гомологии. [c.280]

    На первом этапе работы от мышей, иммунизированных опеределенным антигеном (АГ), получали суммарную, недифференцированную популяцию Т-клеток, содержащую самые различные клоны (на рис. цифры 1 -6). Второй этап состоял в выделении отдельных клонов Т-клеток, среди которых были и специфичные к использованному антигену (на рис. в качестве примера приведено четыре клона, один из которых — клон 3, — специфически реагирует с антигеном). Третий этап работы включал получение моноклональных антител (мАТ) к антигенреактивно-му клону. Задача этого этапа — получение моноклональных антител, способных реагировать только с клоном, использованным для иммунизации. В то же время перекрестная реакция мАТ говорит об общей специфике антигенреактивного клона и непримированных клонов (верхняя таблица). Отсутствие перекрестной реактивности мАТ указывает на наличие у положительно реагирующего примирован-ного клона особой специфичности — предположительно, антигенраспознающего рецептора. Подтверждением подобного предположения является реакция задержки взаимодействия мАТ с соответствующим клоном в присутствии использованного антигена (нижняя таблица). Получение мАТ к антигенраспознающему рецептору Т-клеток создало условия для его полноценного изучения [c.101]

    Антигенная специфичность гаптенов сильно зависит от их химической структуры. Так, введение дополнительных групп может сильно исказить антигенный портрет того или иного соединения. Например, тироксин и трийодтиронин отличаются только одним остатком I, чего вполне достаточно, чтобы антитела против этих гормонов сильно различались перекрестной реактивностью. Классическими примерами стали исследования с пара-, орто- и мета-аминобензойной кислотами, которые практически не дают перекрестных реакций при сопоставимых концентрациях. [c.16]

    В очень редких случаях может наблюдаться перекрестная реактивность моноклональных антител по отношению к неродственным антигенам. Это связано со сходным пространственным распределением зарядов, полярности и гидрофобности на отдельных участках таких молекул. Подобная ситуация реализуется, например, при взаимодействии эндорфинов и алкалоидов с одними и теми же клеточными рецепторами. Однако по отношению к моноклональным антителам перекрестная реактивность подобного рода наблюдается крайне редко. Размеры структур, распознаваемых моноклональными антителами, меньше, и распознаются они точнее, чем структуры, распознаваемые смесью поликлональных антител. Учитывая то, что антигенсвязывающий центр антител имеет полицентровую структуру, необходимо помнить, что направленность моноклональных антител к одному эпитопу и высокая специфичность не исключает возможности их перекрестной реактивности с эпитопами схожей химической структуры, хотя при этом обычно наблюдается различие констант связывания. [c.170]

    Как тест на определение АГ в области средней чувствительности соперничает с ELISA и ИРМА. Результаты менее точны в связи с субъективной оценкой конечной точки титрования. Может использоваться для определения перекрестной реактивности АГ [c.25]

    II. Выделение IgG. 5 мл инактивированной сыворотки, полученной от повторно иммунизированного кролика, разделяют, как описано выше. В этом случае четыре образца, соответствующие середине второго элюируемого пика (IgG), обладающие агглютинирующей активностью, собирают, смешивают вместе и нагружают на эритроциты. По нашему опыту, антисыворотка, полученная таким образом, обладает незначительной перекрестной реактивностью с легкими цепями, которую можно устранить абсорбцией с помощью эритроцитов, нагруженных антителами другого класса. [c.54]

    Смешанная культура лимфоцитов (СКЛ) с ограниченным числом отвечающих клеток позволяет непосредственно определить частоту предшественников ЦТЛ (ЦТЛ-П) при ответе на разнообразные антигены клеточной поверхности — главные и минорные антигены гистосовместнмости, опухолевые антигены, антигены клеток, конъюгированных с гаптенами илн зараженных вирусами. Получив этн данные, можно так дозировать количество отвечающих клеток, чтобы иа одну культуру приходилось не больше одной клетки ЦТЛ-П. Потомство клоиа, полученное в результате совместного культивирования ЦТЛ-П с клетками-стимуляторами, можно затем использовать для изучения перекрестной реактивности и специфичности ЦТЛ, происшедших от одной клетки-предшественника. [c.249]

    Мы описали применение метода лимитирующих разведений для изучения ответа ЦТЛ на суспензию клеток-мишеней одного типа. Одиако этот метод может быть использован и для других целей, напрнмер для определения специфичности ЦТЛ и их перекрестной реактивности с различными суспензиями клеток-мишеней, для оценки активности ЦТЛ при разных условиях, для сравнения частот пролиферирующих и цитотоксических клетОк-предшественпнков нли для определения взаимоотношений между генерацией активных ЦТЛ н клеток памяти. В этих случаях содержимое лунок после первичной СКЛ дробится на фракции для последующего раздельного анализа. [c.263]

    Цитотоксический титр каждой антисыворотки и ее перекрестную реактивность определяют с помощью микрометода в реакции лимфоцитолиза по исключению красителя (Frelinger et al., [c.304]

    После обработки мазка аллоантисывороткой к клеткам линии, отличной от стимулирующих и отвечающих клеток, число таких Т-бластов обычно слегка повышается (дополнительно на 2—4%), Этот эффект наблюдается даже после истощения антисыворотки стимулирующими и отвечающими клетками и объясняется скорее всего остаточной перекрестной реактивностью антисыворотки или же неспецифическим захватом клетками иммуноглобулина из этой антисыворотки. Хотя общее число бластов, флуоресцирующих без обработки аллоантисывороткой, может достигать 6,9%, гипериммунная антисыворотка, выявляющая аллоантигены стимулирующих клеток, окрашивает в 9,2—11,8 раз больше Т-бластов, чем антисыворотка к третьей, неродственной линии. [c.315]

    Набор аллелей всех генов главного комплекса в одной хромосоме называется гаплотипом. У каждого вида два локуса контролируют серологически определимые антигены лимфоцитов. Это классические локусы Н-2К п H-2D у мыши и HLA-A (старое название LA) и HLA-B (старое название FOUR) у человека. Как у мыши, так и у человека недавно открыт третий локус соответственно H-2G и HLA- (старое название AJ). Различают так называемые частные и общие серологически определимые специфичности (антигены). Частные антигены встречаются только в одном гаплотипе Н-2 и в производных от него рекомбинантах общие специфичности отражают перекрестную реактивность между несколькими частными. [c.207]

    Эти ОПЫТЫ обнаруживают широчайший полиморфизм антигенов-мишеней, распознаваемых цитотоксическими клетками. Перекрестная реактивность мутантных антигенов была продемонстрирована также in vivo (Apt е. а., 1975) мыши Н-2 и сенсибилизированные инъекцией [c.213]

chem21.info

Перекрестно-реактивные антитела анти-il-17ail-17f и способы их применения

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Рассмотрены выделенное моноклональное антитело, которое связывает IL-17F и IL-17A человека или обезьяны Cynomolgus, и его антигенсвязывающий фрагмент. Предложены: фармацевтические композиции, содержащие антитело по изобретению, а также способ облегчения проявлений клинического симптома, связанного с ревматоидным артритом, болезнью Крона, псориазом, рассеянным склерозом, хронической обструктивной болезнью легких или астмой, и способ облегчения симптомов аутоиммунного заболевания, воспалительного нарушения или нарушения клеточной пролиферации, основанные на использовании антитела по изобретению. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в лечении заболеваний, связанных с IL-17F и IL-17A. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 9 пр., 7 табл.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело включает:(a) последовательность VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:57, 60, 69 или 85;(b) последовательность VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:58, 61, 70, 86, 93 или 94;(c) последовательность VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:59, 62, 71, 73, 87 или 95;(d) последовательность VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:96, 104 или 110;(e) последовательность VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97 или 105; и(f) последовательность VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:98, 99, 106 или 111,где указанное антитело или его фрагмент связывается с IL-17A и IL-17F человека или обезьяны Cynomolgus.

2. Антитело по п.1, где антитело представляет собой полностью человеческое антитело.

3. Антитело по п.1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или его фрагмент также связывается с гетеродимерным комплексом IL-17A/IL-17F.

4. Антитело по п.1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело представляет собой изотип IgG.

5. Антитело по п.1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело представляет собой изотип IgG1.

6. Антитело по п.1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2, 6, 18, 38, 52 и 54, и/или вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:4, 12, 22, 40 и 56.

7. Антитело по п.1, где антитело содержит последовательность VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, последовательность VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:86, последовательность VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:87, последовательность VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:110, последовательность VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97, и последовательность VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:111.

8. Антитело по п.1, где антитело содержит последовательность VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:85, последовательность VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:94, последовательность VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:95, последовательность VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:110, последовательность VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:97, и последовательность VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:111.

9. Антитело по п.1, где антитело содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:38 и вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:40.

10. Антитело по п.1, где антитело содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:54 и вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:40.

11. Фармацевтическая композиция для облегчения проявлений клинического симптома, связанного с ревматоидным артритом, болезнью Крона, псориазом, рассеянным склерозом, хронической обструктивной болезнью легких, астмой, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 и носитель.

12. Фармацевтическая композиция для облегчения симптомов аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или клеточной пролиферации, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 и носитель.

13. Способ облегчения проявлений клинического симптома, связанного с ревматоидным артритом, болезнью Крона, псориазом, рассеянным склерозом, хронической обструктивной болезнью легких или астмой у субъекта, где способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 в количестве, достаточном для облегчения проявлений клинического симптома, связанного с ревматоидным артритом, болезнью Крона, псориазом, рассеянным склерозом, хронической обструктивной болезнью легких или астмой.

14. Способ по п.13, в котором указанным субъектом является человек.

15. Способ облегчения симптома аутоиммунного заболевания, воспалительного нарушения или нарушения клеточной пролиферации, при этом способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 в количестве, достаточном для облегчения симптома аутоиммунного заболевания, воспалительного нарушения или нарушения клеточной пролиферации у субъекта.

16. Способ по п.15, в котором указанным субъектом является человек.

www.findpatent.ru


Смотрите также