Б. Определение группы крови с помощью цоликлонов (моноклональных антител). Определение группы крови моноклональными антителами


Б. Определение группы крови с помощью цоликлонов (моноклональных антител)

Используются стандартные наборы моноклональных антител высокой специфичности, содержащие реагенты (цоликлоны) анти-А, анти-В и анти-АВ. Для каждого определения группы крови достаточно применять по одной серии реагентов (цоликлонов) анти-А и анти-В.

На маркированную пластинку капают в три точки, исследуемые эритроциты (0,02 мл). Рядом с ними, под соответ­ствующими надписями, помещают цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной капле (0,1 мл) в соотношении 1:5... 1:6. После смешивания реагентов и крови стеклянными палочками (уголками предметных стекол), пластинку периодически покачивают, ход реакции наблюдают в течение 3 мин.

Оценка результата проводится по наличию агглютинации эритроцитов с соответствующим реагентом.

Возможны четыре варианта определения результатов:

а) Агглютинация во всех трех каплях цоликлонов – это значит, что исследуемые эритроциты содержат оба антигена (А и В) и кровь принадлежит к группе АВ (IV). В целях исключения панагглютинации, которая может наблюдаться у отдельных больных (миеломная болезнь, ожоговая болезнь), а также в пуповинной крови новорож­денных, в случае установления группы крови АВ (IV) необходимо провести контрольное исследование: одну каплю (0,1 мл) изотонического раствора натрия хлорида смешать с маленькой каплей (0,01 мл) исследуемой крови. Реакция агглютинации должнаотсутствовать.

б) Агглютинация с цоликлонами анти-А и анти-АВ – это означает, что исследуемые эритроциты содержат только антиген А и кровь принадлежит к группе А (II).

в) Агглютинация с цоликлонами анти-В и анти-АВ – это означает, что исследуемые эритроциты содержат только антиген В и кровь принадлежит к группе В (III).

г) Агглютинация отсутствует во всех трех каплях цоликлонов - это значит, что исследуемые эритроциты не содержат антигенов А и В, и кровь принадлежит к группе 0(I).

Оценка результатов определения групп крови при помощи цоликлонов приведена в таблице:

Группа крови

цоликлон «анти-A»

цоликлон «анти-B»

цоликлон «анти-АВ»

0(I)

-

-

-

A(II)

+

-

+

B(III)

-

+

+

AB(IV)

+

+

+

Знаком (+) обозначено наличие агглютинации, знаком (-) ее отсутствие.

При наличии агглютинации со всеми тремя реагентами (цоликлонами) необходимо исключить неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого, ещё одну каплю эритроцитов смешивают с каплей физиологического раствора. Кровь можно отнести к группе AB(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.

Подробные сведения по вопросу «Определение группы крови системы аво цоликлонами»

Цоликлоны изготавливают из водяночной (асцитной) жидкости лабораторных мышей – носителей «анти – А» и «анти – В» гибридом.

Цоликлон «анти – А»(красного цвета) представляет собой раствор антител «анти – А».

Цоликлон «анти – В»(синего цвета) представляет собой раствор «анти – В».

Цоликлон «анти – АВ»(неокрашенный)представляет собой смесь растворов антител «анти – А» и «анти – В» и предназначен для дополнительного контроля группы крови О(I).

Срок хранения- 2 года при температуре +2°…+6°

Вскрытый флакон можно хранитьв закрытом виде при температуре +20…+60в течение 21 дня (дату вскрытия флакона обязательно пишут на его этикетке).

Цоликлоны предназначены дляопределения групп крови человека системы АВ0 в реакциях гемагглютинации, они применяются взамен стандартных иммунных сывороток и параллельно с ними.

Цоликлоны предназначены для выявления в эритроцитах человека антигенов системы АВ0. Анализ может проводиться с кровью, как взятой в консервант, так и без консерванта, а также и с капиллярной кровью, взятой из пальца. Технология изготовления цоликлона исключает возможность его заражения патогенными для человека вирусами.

Определение группы крови проводится в помещении с хорошим освещением при температуре +150…+250на пластинке светлого однотонного цвета с чистой сухой обезжиренной поверхностью (возможно использование планшетов для определения групп крови). Также необходимы:

- одноразовые пастеровские пипетки для нанесения на пластинку капель исследуемой крови;

- палочки стеклянные (предметные стёкла) для смешивания цоликлонов с исследуемой кровью;

-пробирки с исследуемой кровью (в штативе).

Проведение исследования. Оценка результата:

Нанесите на планшет (пластинку) индивидуальными пипетками цоликлоны «анти–А», «анти–В» и «анти–АВ» по одной большой капле (0,1мл) под соответствующими надписями (при использовании неградуированных пипеток, 0,1мл – это одна полная капля).

Рядом с каждой каплей раствора антител нанесите маленькую (0,02мл) каплю исследуемой крови. Соотношение «цоликлон: кровь» соответствует соотношению «5:1». Смешайте каждую каплю цоликлона с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой. Наблюдайте за ходом реакции с цоликлонами, при лёгком покачивании пластинки (планшета). в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов цоликлонами обычно наступает в первые 3–5 секунд, но наблюдение следует вести 3 минут, ввиду более позднего появления агглютинации эритроцитов, содержащих слабые разновидности антигенов АилиВ.

Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным.

Положительный результат выражается в склеивании (агглютинации) эритроцитов. Агглютинаты видны невооружённым глазом в виде мелких красных зёрнышек, песчинок, быстро сливающихся в крупные хлопья, а капля быстро просветляется.

При отрицательной реакции, гемагглютинация не развивается, капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты (зёрнышки, песчинки, хлопья) в ней не обнаруживаются.

Объяснение результатов реакции исследуемой крови с цоликлонами представлено в таблице.

Результаты реакций с цоликлонами

Исследуемая кровь принадлежит к группе

контроль

цоликлон

цоликлон

цоликлон

физраствор

(соответствует сыворотке IV группы)

"анти – А"

(соответствует сыворотке III группы)

"анти - В"

(соответствует сыворотке II группы)

"анти - АВ"

(соответствует сыворотке I группы)

-

-

-

ОI

+

-

+

А(II)

-

+

+

В(III)

-

+

+

+

АВ (IV)

Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации.

Знаком минус (-) обозначено отсутствие агглютинации.

При положительной реакции агглютинации со всеми тремя цоликлонами, необходимо исключить неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов.

Для этого необходимо отдельно смешать одну большую (0,1мл) каплю физиологического раствора с маленькой (0,05–0,01мл) каплей исследуемой крови.

Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при отсутствии агглютинации исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе.

При наличии агглютинации, при этом контрольном исследовании, заключение о групповой принадлежности крови не делают, образец крови направляют в специализированную лабораторию.

Окончательно, групповую принадлежность крови (в системе АВ0) устанавливают в лаборатории перекрёстным способом – по результатам перекрёстного определения: антигеновАиВна эритроцитах,антител «анти–А»и«анти–В»в сыворотке.

studfiles.net

Определение групп крови моноклональными антителами — КиберПедия

Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию. Разработаны стандартные реагенты — моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов. Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непос­редственно перед исследованием.

Техника проведения реакции

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Оценка результатов проводится по наличию или отсутствию агглютинации (таб 3) При наличие агглютинации с цоликлонами анти-А и анти-В проводят контрольное исследование с физиологическим раствором. Реакция должна быть отрицательная.

Таб. 3. Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)

+ агглютинация; ─ агглютинация отсутствует.

Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делят на способы, применяемые в клинической практике, и лабораторные способы.

В клинических условиях (в приёмном покое, хирургическом отделении, операционной), где нет специального лабораторного оборудования, используют экспресс-методы определения Rho(D).

Экспресс-метод определения Rh-фактора стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева

Для исследования берут свежую несвернувшуюся кровь из пальца (или вены) непосредственно перед исследованием, или консервированную кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика. Исследование проводят в центрифужных пробирках объёмом 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы AB(IV), разведённую 33% раствором декстрана (ср. мол. масса 50 000-70 000). Затем в неё добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Пробирку наклоняют до горизонтального положения, слегка потряхивая, затем медленно вращают таким образом, чтобы содержимое ее растеклось по стенкам тонким слоем. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает её крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и чёткой агглютинации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путём одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Трактовка результатов. Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветлённой жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют следующие методы.

Реакция агглютинации на плоскости с помощью

Цоликлонов анти-D супер.

Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет. Наносят рядом маленькую каплю (0,02-0,03 мл) исследуемых эритроцитов. Тщательно смешивают реагент с эритроцитами стеклянной палочкой.

Через 10 - 20 с мягко покачивают пластинку. Несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 с, результаты реакции учитывают через 3 мин после смешивания.

При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус положительная, при отсутствии - как резус отрицательная.

Метод конглютинации с 10% желатином.

Используют реагенты, содержащие неполные поликлональные антитела (сыворотки анти-D) или неполные моноклональные антитела (цоликлоны анти-D).

В 2 пробирки вносят по 0,02 - 0,03 мл осадка эритроцитов, для чего выдавливают из пипетки небольшую каплю эритроцитов и касаются ею дна пробирки. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) желатина и 2 капли (0,1 мл) реагента, во вторую (контрольную) пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) желатина и 2 капли (0,1 мл) физиологического раствора.

Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, после чего их помещают в водяную баню на 15 мин или термостат на 30 мин при температуре +46 - 48°С. По истечении указанного времени в пробирки добавляют по 5 - 8 мл физиологического раствора и перемешивают содержимое путем 1 - 2-кратного переворачивания пробирок.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невооруженным глазом или через лупу. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о том, что исследуемый образец крови резус положительный, отсутствие агглютинации - о том, что испытуемая кровь резус отрицательная. В контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

cyberpedia.su

29

29 Методы определения групп крови и резус-фактора. Профилактика возможных ошибок

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток. В лунки планшета для определения групп крови последовательно наносят пипетками по одной крупной капле стандартной сыворотки групп 0(1), А(П), В(Ш) двух различных серий каждой группы. Затем наносят в каждую лупку по капле исследуемой крови, в 5 — 10 раз меньшую сыворотки. Сухими стеклянными палочками или путем покачивания планшета смешивают стандартные сыворотки и исследуемую кровь. Через 5 минут оценивают результат (табл. 2).

Таблица 2

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток

Группа исследуемой крови

Стандартные сыворотки

0(I)

А(II)

В (III)

0(I)

-

-

-

А(II)

+

-

+

В(III)

+

+

-

AB(IV)

+

+

+

Определение групп крови по стандартным эритроцитам. В лунки планшета наносят большие капли плазмы исследуемой крови. Рядом с каждой каплей плазмы последовательно наносят по небольшой капле стандартных эритроцитов групп 0(1), А(II), В(III). Капли перемешивают покачиванием планшета. Через 5 минут к каждой капле смеси добавляют по 1 капле физиологического раствора и учитывают результат.

Таблица 3

Определение групп крови с помощью стандартных эритроцитов

Группа исследуемой крови

Стандартные эритроциты

0(I)

А(II)

В (III)

0(I)

-

+

+

А(II)

-

-

+

В(III)

-

+

-

AB(IV)

-

-

-

Определение резус-фактора. На дно сухой пробирки наносят 1 большую каплю универсального реагента анти-резус, затем добавляют такую же каплю исследуемой крови. После встряхивания пробирки производят перемешивание сыворотки анти-резус и крови в течение 5 минут по стенкам пробирки, после чего добавляют 5 — 7 мл физиологического раствора. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии резус-фактора.

Определение групп крови с помощью цоликлонов. Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными сыворотками.

Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М. Цоликлоны изготовляются из асцитной жидкости мышей-носителей анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител.

Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5 — 10 мл. Цоликлон анти-А — желтого цвета, анти-В — синего, анти-АВ — бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия.

Техника определения групп крови. Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на пластине или планшете, определение производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15 — 25 X.

  1. Наносят на пластину или планшет индивидуальными пипетками цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.

  2. Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 — 0,03 мл).

  3. Смешивают кровь с реагентом, покачивая планшет.

  4. Наблюдают за ходом реакции с цоликлонами визуально при легком покачивании планшета в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые 3 — 5 секунд, но наблюдение следует вести 3 минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

  5. Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агтлютинаты видны в виде мелких красных агретатов, быстро смешивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

  6. Интерпретация результатов реакции агглютинации с цоликлонами представлена в табл. 4.

Таблица 4

Определение групп крови с помощью цоликлонов

Группа исследуемой крови

Стандартные эритроциты

Анти-А

Анти-В

Анти-АВ

0(I)

_

_

-

А(II)

+

-

+

В(III)

-

+

+

АВ(IV)

+

+

+

Примечание: знаком (+) обозначено наличие агглютинации, знаком (-) — се отсутствие

При положительном результате реакции агглютинации со всеми гремя цоликлонами необходимо исключить спонтанную неспецифическую аглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого смешивают на плоскости 1 каплю исследуемых эритроцитов с каплей физиологического раствора. Кровь можно отнести к группе AB(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.

Определение резус-фактора с помощью цоликлона. В лупку планшета наносят 1 большую каплю цоликлона анти-Д-суперт рядом наносят 1 маленькую каплю исследуемой крови.

Покачивая планшет, смешивают кровь с цоликлоном. За ходом реакции наблюдают в течение 3 минут. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии резус-фактора.

studfiles.net

Определение группы крови системы ав0 моноклональными антителами

Принимая во внимание высокую активность и авидность реагентов Цоликлон, а также полную их стандартность, для каждого определения группы крови достаточно применять по одной серии реагентованти-Аианти-В. Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на планшет или пластинку по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с каплями антител наносят исследуемую кровь по одной маленькой капле (0,01 мл). После смешивания реагентов и крови за реакцией агглютинации наблюдают в течение2,5 мин. Оценка результатов реакции агглютинации с Цоликлонами анти-А и анти-В представлена в таблице 2, в которую также включены результаты определения агглютининов сыворотке (плазме) доноров с помощью стандартных эритроцитов

Таблица 2

Реакция исследуемых эритроцитов с цоликлонами

Исследуемая кровь принадлежит к группе

анти-А

анти-В

-

-

0(I)

+

-

A(II)

-

+

B(III)

+

+

AB(IV)

  1. Агглютинации нет (-) ни с Цоликлоном анти-А, ни с Цоликлоном анти-В. Следовательно, исследуемые эритроциты не содержат антигенов А и В, и кровь принадлежит к группе 0 (I). Это подтверждается наличием агглютининов α и β в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами групп А (II) и В (III).

  2. Агглютинация (+) наблюдается только с Цоликлоном анти-А. Следовательно, исследуемые эритроциты содержат только антиген А, и кровь принадлежит к группе А(II). Это подтверждается наличием агглютининов β в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами группы В(III).

  3. Агглютинация (+) наблюдается только с Цоликлоном анти-В. Следовательно, исследуемые эритроциты содержат только антиген В, и кровь принадлежит к группе В (III). Это подтверждается наличием агглютининов α в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами группы А(II).

  4. Агглютинация (+) наблюдается как с Цоликлоном анти-А, так и с Цоликлоном анти-В. Следовательно, исследуемые эритроциты содержат оба антигена (А и В), и кровь принадлежит к группе АВ(IV). Это подтверждается отсутствием агглютининов α и β в исследуемой сыворотке (плазме) по результатам отрицательной реакции агглютинации со стандартными эритроцитами групп А (II) и В (III).

С целью исключения аутоагглютинации, которая может наблюдаться у некоторых больных (миеломная болезнь, ожоговая болезнь), а также в пуповинной крови новорожденных, в случае установления группы крови АВ (IV) необходимо произвести контрольное исследование: одну каплю (0,1 мл) изотонического раствора хлористого натрия смешать с маленькой каплей (0,01 мл) исследуемой крови. Реакция агглютинации должна ОТСУТСТВОВАТЬ.

Определение групп крови системы аво перекрестным способом.

Для выполнения этого способа требуется то же оснащение, что и для определения групп крови с помощью стандартных сывороток. Дополнительно надо иметь стандартные эритроциты группы А(II), В(III). Стандартные эритроциты готовятся из крови резус-отрицательных доноров. Требования, предъявляемые к этикеткам и условия те же, что для стандартных сывороток. Длительность хранения 2-3 суток при температуре +4о - +8о С.

Техника определения следующая: к нанесенным в два ряда стандартным сывороткам снизу дополнительно наносят ряд стандартных эритроцитов А (II), В (III). От исследуемого кровь забирается в пробирку. Ей дают отстояться. Затем к стандартным эритроцитам добавляют сыворотку исследуемой крови, а в стандартные сыворотки вносят эритроциты исследуемой крови. Наблюдение за реакцией проводят в течение 5-ти минут. Через 3 минуты в каждую каплю, где наступила агглютинация, добавляют каплю физиологического раствора, продолжая наблюдение до истечения 5-ти минут. Результаты реакций, полученные при помощи стандартных эритроцитов и стандартных сывороток должны совпадать, т.е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов, соответствующих одной и той же группе крови.

studfiles.net

Определение групп крови перекрёстным способом

Способ наиболее часто используют в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.

Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.

Необходимое оснащение

Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для её проведения необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови: 0(I), А(II), B(III). Стандартные эритроциты приготавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8 °С. Срок годности 2-3 дня.

Методика проведения реакции

1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 мин для получения сыворотки.

2. На маркированную тарелку пипеткой наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними - по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.

3. Дальнейшие мероприятия проводят аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.

Таблица 6-3. Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом

Трактовка результатов

Оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами - табл. 6-3).

Особенность трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами - эритроциты группы 0(I) считают контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

Результат перекрёстного способа считают достоверным, только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Определение групп крови моноклональными антителами

Необходимое оснащение

Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию.

Гибридома - клеточный гибрид, образованный путём слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.

Таблица 6-4. Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)

Разработаны стандартные реагенты - моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов.

Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непосредственно перед исследованием.

Техника проведения реакции

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Трактовка результатов

Оценка результатов очень проста (табл. 6-4).

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от стандартных изогемагглютинирующих сывороток, получаемых из донорской крови.

studfiles.net

Определение групп крови перекрёстным способом

Способ наиболее часто используют в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.

Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.

Необходимое оснащение

Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для её проведения необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови: 0(I), А(II), B(III). Стандартные эритроциты приготавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8 °С. Срок годности 2-3 дня.

Методика проведения реакции

1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 мин для получения сыворотки.

2. На маркированную тарелку пипеткой наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними - по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.

3. Дальнейшие мероприятия проводят аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.

Таблица 6-3. Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом

Трактовка результатов

Оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами - табл. 6-3).

Особенность трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами - эритроциты группы 0(I) считают контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

Результат перекрёстного способа считают достоверным, только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Определение групп крови моноклональными антителами

Необходимое оснащение

Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию.

Гибридома - клеточный гибрид, образованный путём слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.

Таблица 6-4. Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)

Разработаны стандартные реагенты - моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов.

Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непосредственно перед исследованием.

Техника проведения реакции

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Трактовка результатов

Оценка результатов очень проста (табл. 6-4).

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от стандартных изогемагглютинирующих сывороток, получаемых из донорской крови.

studfiles.net

Определения группы крови и резус-фактора цоликлонами

ЦоликлоныЦоликлоныЦоликлоны – моноклинальные антитела, которые были получены из крови мышей с помощью генной инженерии и используются для определения группы крови системы АВО и резус-фактора.

Цоликлоны, в противовес стандартным сывороткам, отличаются высокой активностью и авидностью (временем наступления, а также выраженностью склеивания (реакции агглютинации).

Основные цоликлоны:

  • Анти-A;
  • Анти-B;
  • Анти-AB;
  • Анти-0 и т.д.

По цоликлонам определяют резус-фактор и группы крови.

Техника определения групп с помощью цоликлонов

Определение данным методом производится в лабораторных условиях. Температура воздуха должна находиться в пределах +15 – + 25 градусов по Цельсию. Исследование должно проводиться при достаточно хорошем освещении.

реагентыреагентыРеагенты необходимо хранить плотно закрытыми, так как при высыхании значительно снижается активность антител. Нельзя использовать содержащие хлопья и мутные реагенты. Для каждого из реагентов требуется отдельная пипетка.

Анализ проводится на белой тарелке или планшете с хорошо смачиваемой поверхностью. Благодаря высокой активности и авидности цоликлонов, есть возможно применение по серии реагентов анти-A и анти-B.

На планшете нужно сделать надписи с названиям антигенов анти-A/анти-B. Далее снизу от соответствующих надписей капают примерно 0,1 миллилитр цоликлонов. У реагента анти-A цвет желтовато-розовый, у анти-B – синий.

Определение групп кровиОпределение групп кровиОпределение групп крови

Возле моноклональных антител капают по одной капле крови, смешивают ее уголком предметного стекла или стеклянной палочкой с реагентами. Перед дальнейшим смешиванием пар капель необходимо тщательно промыть и насухо вытереть стекло или палочку.

Наблюдение за процессом агглютинацией ведут в течение 2,5 минут, при этом тарелку или планшет нужно слегка покачивать. По истечении времени оценивают результат. Стоит отметить, что наблюдения за агглютинацией не требуют каких-либо специальных приспособлений.

Агглютинаты достаточно хорошо видны даже невооруженным глазом, быстро сливаясь и образуя большие хлопья. В случае, если не происходит склеивания, капля реагента приобретает равномерную окраску красного цвета.

к содержанию ↑

Расшифровка результатов

Таблица сопоставления группы крови и цоликлона позволяет разобраться в результатах.

ЦоликлонI положительнаяI отрицательнаяII положительнаяII отрицательнаяIII положительнаяIII отрицательнаяIV положительнаяIV отрицательная
Анти-А++++
Анти-В++++
Анти-D++++
  1. Если отсутствует агглютинация (с анти-A и анти-B), эритроциты не содержат антигенов A и Б. Это I группа крови;
  2. Если есть агглютинация только с анти-A, эритроциты содержат лишь антиген A, что характеризует II группу крови;
  3. Если агглютинация только с анти-B, красные клетки содержат антиген B, что характеризует III группу;
  4. Если наблюдается агглютинация c обоими цоликлонамми анти-A и анти-B, эритроциты содержат оба антигена. С целью исключения аутоагглютинации необходимо провести контрольную процедуру: в этом случае смешивают 0,1 миллилитр изотонического раствора хлорида натрия и 0,01 миллилитр исследуемой крови. Если реакция агглютинации отсутствует, определяется IV группа.
Расшифровка результатовРасшифровка результатовРасшифровка результатовк содержанию ↑

Определение резус-фактора

Для определения резус-фактора наносят на планшет большую каплю анти-D-супе, возле нее – маленькую каплю (меньше в десять раз) исследуемой крови. Производят смешивание и оценивают полученный результат. Если реакция агглютинации началась, данная методика определяет кровь как резус-положительную, если резус-фактор отрицательный – агглютинации нет.

Определение резус-фактораОпределение резус-фактораОпределение резус-факторак содержанию ↑

Препараты цоликлонов

Выделяют эритротест-цоликлон анти-D.

Существуют три разновидности:

  • анти-D-цоликлонанти-D-цоликлонОбычный анти-D-цоликлон. При его добавлении развивается реакция непрямой агглютинации;
  • Супер. Вызывает прямую агглютинацию;
  • Препарат анти-D-микс, имеющий в составе компоненты обычного и супер цоликлона анти-D). С их помощью можно как выявить группу крови, так и определить резус-принадлежность крови.

Отличие других растворов состоит в названии, поскольку входящие в их состав антитела – иммуноглобулины М и G – предоставляют возможность только произвести типизацию крови по антигенам АВ0. Различие заключается исключительно в механизме слипания эритроцитов (агглютинация прямая/непрямая).

У каждого из этих препаратов есть свои собственные особенности использования и срок годности. Однако наибольшей популярностью в лабораторной клинической диагностике пользуются только 3 вышеуказанных препарата (анти-А, анти-В, анти-D).

к содержанию ↑

Как определить группу в случае неверной трактовки результатов анализа

Иногда возможно получение недостоверных, ложных результатов. К примеру, если при добавлении к препарату крови изменился их цвет или если агглютинация наблюдается во всех ячейках планшетки.

Чтобы предотвратить такие результаты, если выполняется определение группы цоликлонами, алгоритм действий предусматривает определенные правила. Сначала следует посмотреть на срок обращения цоликлонов. Недопустимо использовать реагенты, у которых истек срок годности.

планшеткапланшеткаОбязательно нужно соблюдать и все условия правильного проведения процедуры. Помещение должно иметь хорошо оборудованное рабочее место с температурным режимом и достаточным освещением. Если инструкция к препарату содержит указания и касательно требуемой влажности, следует учитывать и данный фактор.

Немалое значение имеет и чистота планшетки, так как ее загрязнение может привести к возникновению ошибок в исследовании и, как следствие, к получению неверных результатов.

к содержанию ↑

Где можно провести анализ?

Определение группы цоликлонами постепенно приобретает все большую популярность. Если раньше эта процедура проводилась исключительно в специализированных стационарах (к примеру, только в отделениях гематологии и хирургии), то сейчас процедура доступна почти в любой достаточно оборудованной лаборатории.

Методика цоликлонов находит применение и в поликлиниках. Там ее включают различные методы экспресс-определения группы крови, проводимые с целью скорейшего выставления пациенту диагноза.

На платной основе проведение этой услуги предлагают и многие центры косметологии и частной медицины. Бесплатно данная процедура, как было сказано выше, проводится по направлению терапевта или лечащего врача.

проведение анализапроведение анализаЕсли отсутствует возможность обратиться за анализом крови в поликлинику, исследование можно провести и самостоятельно при наличии набора препаратов и специальной планшетки. Однако необходимо помнить, что для получения достоверных результатов требуется соблюдать условия процедуры, в особенности это касается стерильности.

к содержанию ↑

Видео

moyakrov.info


Смотрите также