Тест-эритроциты ID-DiaСell 5 % для скрининга антиэритроцитарных антител методом конглютинации с желатином. Определение антиэритроцитарных антител


Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител.

Гелевая технология в микропробирках была предложена Y.Lapierreв 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле «сефадекс», помещенном в микропробирки. Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов.

Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат).

Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые и вариантные антигены), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.

Принцип гелевого теста.

Забуференный декстрановый гель SephadexG100superfineможет быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками – в отличие от стандартных серологических методик – с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста.

Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

  1. нейтральный, не содержащий специфических антител, – применяется для поиска и идентификации антител солевым и ферментным методами, холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента;

  2. специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека, - применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл и т.д.;

  3. антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента, - применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста (реакция Кумбса) при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента.

Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером пор геля, и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще – положительный результат. Фиксированная агглютинация в геле позволяет легко оценивать результат реакции, а наличие контрольной микропробирки в диагностической карте подтверждает достоверность полученных данных.

В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:

- сильноположительный (++++) – образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;

- положительный (+++) – агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;

- слабоположительный (++) – агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;

- очень слабоположительный (+) – агглютинаты располагаются в нижней трети геля;

- отрицательный (-) – эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.

studfiles.net

Тест-эритроциты ID-DiaСell 5 % для скрининга антиэритроцитарных антител методом конглютинации с желатином

Главная | Новости | Тест-эритроциты ID-DiaСell 5 % для скрининга антиэритроцитарных антител методом конглютинации с желатином

Тест-эритроциты ID-DiaCell I-I-III предназначены только для in vitro диагностики антител к антигенам эритроцитов. Готовы к использованию. Каждый образец эритроцитов представляет собой 5 % взвесь эритроцитов крови человека, полученных от одного донора, флаконы по 10 мл. Предлагаем для ознакомления краткую инструкцию по применению ID-DiaСell 5 %, подробная инструкция может быть вам отправлена при необходимости.

Проведение скрининга антиэритроцитарных антител

Перед употреблением выдержать тест-эритроциты и исследуемые образцы до достижения комнатной температуры. Осторожно встряхнуть флакон со стандартными эритроцитами до получения гомогенной взвеси.

  • В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
  • В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) тест-эритроцитов.
  • Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10 % раствора желатина, подогретого до разжижения. Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойства застудневать при температуре 4 - 8 °С желатин не пригоден.
  • После этого во все пробирки вводят по 1 - 2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46 - 48 °С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 мин.
  • В пробирки по извлечение из водяной бани наливают 5 - 8 мл изотонического раствора NaCl. Содержимое пробирок перемешивают путем одно-двукратного перевертывания и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

Интерпретация результатов

Результат реакции просматривают на свет. Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать. Для этого каплю содержимого пробирки помещают с помощью стеклянной палочки на предметное стекло и просматривают под малым увеличением. Наличие агглютинации в пробирках с образцами тест-эритроцитов ID-DiaCell указывает на содержание в испытуемой сыворотке антител. Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что антитела к антигенам эритроцитов не выявлены.

Титрование сыворотки, содержащей антитела

  • В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
  • Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NaCl.
  • В первую пробирку этой же пипеткой вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания две капли переносят во вторую, из второй - в третью, из третьей - в четвертую и так до последней пробирки, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения сывороток от 1:2 до 1:1024.
  • Во все пробирки добавляют по две капли тест-эритроцитов ID-DiaCell, с которыми получен положительный результат при скрининге антител, а также по 2 капли желатина.
  • Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при температуре 46 - 48 °С на 10 мин. или в суховоздушный термостат на 30 мин.
  • По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по 5 - 8 мл изотонического раствора NaCl и наблюдают результат. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимается за титр выявленных антител.

Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжать разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.

www.isoseroclon.ru

"Алгоритмы исследования антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител

УтверждаюПервый заместительМинистра здравоохраненияРоссийской ФедерацииА.И.ВЯЛКОВ17 мая 2000 г.СогласованоНачальник Управлениянаучно-исследовательскихмедицинских учрежденийС.Б.ТКАЧЕНКО17 мая 2000 г.АЛГОРИТМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИГЕНОВ ЭРИТРОЦИТОВ ИАНТИЭРИТРОЦИТАРНЫХ АНТИТЕЛ В СЛОЖНОДИАГНОСТИРУЕМЫХСЛУЧАЯХМЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИN 99/181АННОТАЦИЯМетодические рекомендации содержат алгоритмы, позволяющие провести диагностику сложновыявляемых вариантов антигенов эритроцитов (при исследовании группы крови и резус-принадлежности), а также исследование сывороток доноров и реципиентов на наличие антител к антигенам эритроцитов. Материал составлен с учетом международных требований, предъявляемых к иммуногематологическим исследованиям эритроцитов. Предложены новые варианты выявления причин положительных реакций при постановке пробы на совместимость перед гемотрансфузией. Материал иллюстрирован схемами.Методические рекомендации предназначены для врачей и лаборантов СПК и лечебно-профилактических учреждений, занимающихся иммуногематологическими исследованиями крови доноров и реципиентов.Организация-разработчик: Российский НИИ гематологии и трансфузиологии г. Санкт-Петербург.Авторы: д.б.н. Минеева Н.В., врач Бодрова Н.Н., Гордеева Н.Ф., Андреева А.В., Артамонова В.Ю., Гетманец О.Н.ВВЕДЕНИЕОшибки при определении группы крови, резус-принадлежности, исследовании антител к антигенам эритроцитов доноров и реципиентов могут явиться причиной возникновения посттрансфузионных осложнений гемолитического типа. Поэтому достоверная диагностика антигенов и антиэритроцитарных антител очень важна.Ошибки в типировании антигенов эритроцитов могут быть обусловлены как техническими погрешностями и индивидуальными особенностями исследуемой крови, так и недостаточно высоким качеством применяемых реактивов. В настоящих методических рекомендациях подробно изложены ошибки, возникающие при исследовании антигенов эритроцитов и постановке пробы на совместимость, обусловленные индивидуальными особенностями исследуемой крови.Антигены групп крови не являются изолированными от условий окружающей среды и могут модифицироваться при ее изменении. Ослабление выраженности антигенных детерминант на эритроцитах описано у больных онкологическими и гематологическими заболеваниями, беременных женщин, септических больных. При этом возникают определенные трудности с типированием антигенов эритроцитов.Присутствие в исследуемой крови аутоантител также может искажать результаты исследования антигенов и антител в том случае, если аутоантитела вызывают неспецифическую агглютинацию эритроцитов. Поэтому при получении достоверного результата особенно важно уметь диагностировать неспецифические ауто- и аллоантитела.Низкая активность аллоантител в сыворотке может также явиться причиной получения неправильного результата при определении группы крови или при проведении пробы на совместимость крови донора и реципиента. В данных методических рекомендациях содержится описание методик проведения исследования сложнодиагностируемых вариантов антигенов эритроцитов системы АВО и Резус, а также выявления аллоантител, имеющих клиническое значение. Впервые при описании приемов учтены современные международные требования к проведению иммуногематологических исследований эритроцитов.Формула методаАлгоритмы выявления антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител в сложнодиагностируемых случаях (ложноположительные и ложноотрицательные результаты исследования) заключаются в дифференцированной диагностике специфических и неспецифических ауто- и аллоантител в результате чего обеспечивается правильность определения группы крови, резус-принадлежности, а также достоверность результатов постановки пробы на совместимость крови доноров и реципиентов.Показания к использованию алгоритмовАлгоритмы исследования антигенов и антител необходимо применять: 1. При расхождении результатов определения группы крови и резус-принадлежности с результатами исследования, полученными ранее или результатами исследования, полученными в других лабораториях. 2. При несовпадении результатов исследования группы крови со стандартными сыворотками и стандартными эритроцитами. 3. При установлении специфичности антител к антигенам эритроцитов в случае наличия в исследуемом образце неспецифических ауто- и аллоантител, затрудняющих подбор совместимых пар донор-реципиент.ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ОПИСАННЫХАЛГОРИТМОВ ОТСУТСТВУЮТМатериально-техническое обеспечение методов1. Реактивы для определения группы крови, резус-принадлежности, приготовленные в соответствии с требованиями приказа МЗ РФ N 2 от 09.01.98. "Об утверждении инструкций по иммуносерологии".2. Система диагностическая для типирования антигенов эритроцитов и выявления антиэритроцитарных антител (карты ДиаМед Швейцария), N 95/401. Государственный реестр медицинских изделий. М. 1996.3. Стандартные эритроциты, заготовленные в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях". Приказ МЗ РФ N 2 от 09.01.98.ОПИСАНИЕ АЛГОРИТМОВПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ГРУППЫ КРОВИ ВСЛОЖНОДИАГНОСТИРУЕМЫХ СЛУЧАЯХПри исследовании групповой принадлежности крови доноров и реципиентов могут наблюдаться отклонения от обычной картины агглютинации. Это выражается в отсутствии специфической или наличии неспецифической агглютинации, а также несовпадении результатов исследования по стандартным сывороткам и стандартным эритроцитам. Порядок проведения исследования групповой принадлежности крови, методические приемы, а также причины расхождений результатов приведены на схеме 1.ВЫЯСНЕНИЕ ПРИЧИН РАСХОЖДЕНИЙ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИГРУППЫ КРОВИРезультат исследования отличается от предыдущего¦\/Повторить исследование на свежевзятом образце крови¦\/Повторное исследование показывает такое же отличие. Результатыисследования со стандартными эритроцитами и стандартными сывороткамине совпадают.¦ ¦\/ \/-------------------------------------¬ -----------------------------------¬¦Отрицательный результат по сравнению¦ ¦ Положительный результат по ¦¦ с ожидаемым (отсутствие ожидаемой ¦ ¦ сравнению с ожидаемым ¦¦ агглютинации) ¦ ¦(наличие неожиданной агглютинации)¦L------------------------------------- L-----------------------------------¦ ¦\/ \/Повторить исследование с модификациями: ----------------------------¬- Увеличить соотношение сыворотки к ¦ Провести исследование в ¦эритроцитам до 1:20 ¦ соответствии со схемой на ¦- Уменьшить Т град. реакции, ¦ следующей странице ¦увеличить время инкубации до L----------------------------30-60 минут при 8 град. C- Исследовать результат под микроскопом- Использовать разные типы реактивовПричины слабой агглютинации:Ослабление экспрессии антигенов призаболевании, беременности, из-завозрастных изменений, приемлекарственных средств.ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ ПО СРАВНЕНИЮ С ОЖИДАЕМЫМИсследование эритроцитов Исследование сыворотки¦ ¦\/ \/--------------------------------------------------¬ --------------------------------------------------------¬¦ Отмыть эритроциты теплым физ. раствором и ¦ ¦ Исследовать сыворотку с различными образцами ¦¦ повторить исследование ¦ ¦ эритроцитов (или скрининг антител) включая проведение ¦¦ ¦ ¦ аутоконтроля ¦L-------------------------T------------------------ LT-----------------------T---------------------------T-----------------+----------¬ ¦ ¦ ¦\/ \/ ¦ \/ ¦----------------------¬ -------------------------¬ ¦ ------------------------------------------------¬ ¦¦ Результат совпадает ¦ ¦Результат не совпадает с¦ ¦ ¦- Аутоконтроль отрицательный ¦ ¦¦ с результатами ¦ ¦ результатами ¦ ¦ ¦- С эритроцитами A1 - положительный результат ¦ ¦¦ перекрестного ¦ ¦ перекрестного ¦ ¦ ¦- С эритроцитами A2 - и панелью для скрининга -¦ ¦¦ определения ¦ ¦ определения ¦ ¦ ¦ отрицательный результат ¦ ¦L-----------T---------- L-----------T------------- ¦ L---------------------T-------------------------- ¦\/ \/ ¦ \/ ¦----------------------¬ -------------------------¬ ¦ ------------------------------------------------¬ ¦¦ Расхождения были ¦ ¦- Исследуйте с ¦ ¦ ¦ Подгруппа A2 или A2B с анти- A1 ¦ ¦¦ вызваны холодовыми ¦ ¦ реактивами различных ¦ ¦ L------------------------------------------------ ¦¦ агглютининами или ¦ ¦ видов ¦ \/ \/¦монетными столбиками ¦ ¦- Изучите трансфузионный¦ -------------------------¬ ----------------------------¬L---------------------- ¦ анамнез ¦ ¦- Все эритроциты дали ¦ ¦ Один или больше образцов ¦¦- Узнайте диагноз ¦ ¦ (+) результат ¦ ¦ эритроцитов дали ¦¦ больного ¦ ¦- Аутоконтроль (+) ¦ ¦ положительный результат ¦¦- Исследуйте наличие ¦ L------------T------------ L-------------T--------------¦ аутосенсибилизации ¦ \/ \/¦ (прямой АГ тест) ¦ -------------------------¬ ----------------------------¬L-----------T------------- ¦В сыворотке присутствуют¦ ¦- В сыворотке присутствуют ¦¦ ¦аутоантитела ¦ ¦ аллоантитела ¦¦ L------------------------- ¦- Установить специфичность ¦\/ ¦ с панелью эритроцитов ¦--------------------------------------------------¬ ¦- Оценить клиническое ¦¦ Причины расхождений: ¦ ¦ значение аллоантител ¦¦- Химеризм групп крови ¦ L----------------------------¦- Недавняя АВО - несовместимая трансфузия ¦¦- Трансплантация костного мозга ¦¦- Полиагглютинабельность эритроцитов ¦¦- Приобретенный В антиген (если реципиент ¦¦ группы A) ¦¦- Аутоантитела на эритроцитах ¦¦- Сопутствующие антитела в используемых реактивах¦L----------------------------------------------------------¬¦ ПРАВИЛА, КОТОРЫЕ НАДО СОБЛЮДАТЬ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ¦¦ ГРУППЫ КРОВИ: ¦+-------+¦- Использовать для исследования реактивы, в качестве которых нет¦¦ сомнения. ¦¦- Исследование необходимо проводить перекрестным способом. Н妦 использовать для исследования эритроциты A, B и O от произвольно взятых¦¦ лиц, применять только стандартные эритроциты. ¦¦- Использовать изогемагглютинирующую сыворотку AB для контроля¦¦ специфичности реакции агглютинации. ¦¦- Кровь для исследования брать до проведения больному гемотрансфузий, таꦦ как трансфузии несовместимой крови и больших объемов компонентов от лиц¦¦ группы крови 0 могут приводить к последующему неправильному заключению¦¦ о групповой принадлежности. ¦¦- Кровь для исследования брать до переливания плазмозамещающих растворо⦦ (для исключения ошибок, вызванных склеиванием эритроцитов в монетны妦 столбики). ¦¦- Обращать внимание на диагноз. Ошибки чаще встречаются при исследовани覦 крови больных онкологическими, гематологическими заболеваниями,¦¦ беременных женщин. ¦¦- Взятие крови и определение групповой принадлежности производить дважды¦¦ с использованием каждый раз двух серий сывороток. ¦L--------Проведение исследования групповой принадлежности кровипри наличии в исследуемой сыворотке Холодовых антител1. Взять кровь у больного в теплую пробирку, которую поместить в термоконтейнер и транспортировать в лабораторию на исследование.2. Поместить исследуемый образец крови в термостат при +37 град. C и держать там до окончания проведения исследования.3. Предварительно нагреть раствор натрия хлорида 0,9%; стандартные сыворотки; эритроциты и плоскость, поместив их в термостат.4. Провести исследование группы крови на теплой плоскости, подогретыми реактивами перекрестным способом со стандартными эритроцитами.5. При необходимости произвести отмывание исследуемых эритроцитов теплым раствором натрия хлорида (наличие аутоантител на эритроцитах).

'Изделия медицинские. Классификация в зависимости от потенциального риска применения. Общие требования. ГОСТ Р 51609-2000' (утв. постановлением Госстандарта РФ от 17.05.2000 n 140-ст)  »

www.lawmix.ru


Смотрите также