Получение и применение моноклональных антител. Моноклональные антитела презентация


Получение и применение моноклональных антител

1. Прикладные аспекты иммунологии

Получение и применение моноклональных антител к.х.н., доцент кафедры микробиологии Герловский Денис Олегович Минск, 2014Как это было сделано? Успех пришел, как всегда, неожиданно, как побочный продукт исследования, имевшего иные цели. В начале 70-х годов молодой немецкий иммунолог Георг Кёлер, получивший стипендию для работы в знаменитом Базельском институте иммунологии, заинтересовался вопросом о генетической изменчивости антител. В то время можно было ожидать, что антитела мутируют (генетически изменяются) с большей частотой, чем другие белки. Для исследования надо было изолировать клон АОК, продуцирующий антитела определенной специфичности, получить из него стабильную клеточную линию, поддерживаемую в пробирке (в культуре), и проследить, с какой частотой появятся там генетически измененные варианты. Для реализации проекта. Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Цезаря Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить.Проблемы получения моноклональных антител. В организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество — миллионы генетически однородных семейств клеток — клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител, и в этом причина большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Таких клонов на много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам. Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны антителообразующих клеток в пробирке — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, то есть антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но и это оказалось невозможным: нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования клонов АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.Путь решения проблемы неожиданно указали злокачественные опухоли (плазмоцитомы). 1. Известны опухоли у человека — плазмоцитомы, вырабатывающие и секретирующие в кровь иммуноглобулины, по структуре своей неотличимые от антител. 2. Плазмоцитома всегда или почти всегда сохраняет свойства и функции клетки, из которой произошла. Плазмоцитома происходит из "юных" плазматических клеток, то есть как раз из тех клеток, которые синтезируют антитела. 3. Они образуют строго однородный по всем свойствам моноклональный иммуноглобулин. 4.Опухоль, и в этом ее принципиальное отличие от нормальных предшественников, бессмертна. Ее можно культивировать в пробирке или пересаживать от одного животного другому неограниченное число раз и в течение неограниченного времени. 5. В отличие от нормальной ткани опухоль автономна, организм "хозяина" неспособен (за очень редкими исключениями) остановить неограниченный рост злокачественного опухолевого клона. 6. Плазмоцитомы возникают не только спонтанно, но их можно довольно легко индуцировать у мышей.Миеломная болезнь, также известная как болезнь Рустицкого-Калера, множественная миелома или генерализованная плазмоцитома — злокачественная опухоль плазматических клеток, тип белых кровяных клеток обычно ответственных за производство антител. Заболевание системы крови, относящееся к парапротеинемическим лейкозам. Своё название заболевание и опухолевая клетка получили в связи с преимущественной локализацией процесса на «территории» костного мозга.ГАТ-зависимая селекция. Предпосылкой для ГАТ-зависимой селекции является наличие вариантов плазмоцитомных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (ГТФРТ) или по тимидинкиназе (ТК). Эти клетки отмирают в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), поскольку не обладают способностью обойти аминоптериновый блок основного пути биосинтеза ДНК за счет биосинтеза гипоксантина и тимидина.Дефектные по ГГФРТ линии плазмоцитом получают путем селекции клеток, резистентных к 8-азагуанину. Линии, дефектные по ТК, выделяют по резистентности к 5-бромдезоксиуридину. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были неспособны усваивать Г и Т, то есть были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов.Получение антителообразующих лимфоцитов В дальнейшем речь пойдет только о слиянии клеток плазмоцитомы мыши с лимфоцитами того же вида. Слияние клеток плазмоцитомы и лимфоцитов человека или крысы имеет свои особенности. Для иммунизации используют инбредные линии мышей, сингенные, по отношению к плазмоцитоме или аллогенным штаммам. В последнем случае для лучшего роста гибридных клеток после слияния следует использовать гибриды F1 мышей BAIB/C и мышей, иммунизированных с целью выделения у них нормальных клеток селезенки. Для культивирования гибридом in vivo также необходимо использование гибридов F1. Для проведения иммунизации подходят любые схемы, стимулирующие образование выраженного гуморального иммунного ответа.Получение клеток. Мышей забивают цервикальной дислокацией, извлекают в условиях стерильности селезенку и готовят суспензию отдельных клеток. Клетки селезенки трижды отмывают средой для слияния, не содержащей сыворотки. Используют суспензию, содержащую 2*107 лимфоцитов. Если число лимфоцитов меньше предусмотренного, то к суспензии добавляют еще 2*108 ядерных клеток селезенки. Слияние клеток. Плазмоцитомные клетки в количестве 2*107, взятые в логарифмической фазе культивирования дважды отмытые культуральной средой для слияния, добавляют к отмытым клеткам селезенки мыши. Суспензию клеток тщательно перемешивают и центрифугируют при 300 g. После удаления надосадочной фракции осадок ресуспендируют в небольшом количестве среды. Затем в течение 2 мин по каплям добавляют 1 мл раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ). Избыток ПЭГ разводят добавлением бессывороточной среды для слияния. Добиваются равномерного распределения клеток во всем объеме жидкости. Клетки собирают центрифугированием при 300 g, надосадочную фракцию отбрасывают. Все процедуры проводят в условиях минимальной обсемененности микробами (в ламинарном боксе) при комнатной температуре.Имеются два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов, звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот. Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем - способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.Селекция гибридных клеток на среде ГАТ Слившиеся клетки аккуратно ресуспендируют в 40 мл среды ГАТ. К этой суспензии для поддержания роста добавляют 107 свежевыделенных ядерных клеток селезенки. Из суспензии клеток отбирают 192 пробы по 200 мкл и вносят их в плоскодонные планшеты для микрокультуральных работ. Культуры клеток инкубируют в водонасыщенной атмосфере, содержащей 5% СО2 при 37 °С. Начиная с 4-го дня после слияния, производят замену половины надосадочной фракции в лунках с культурой свежей порцией среды ГАТ; замену повторяют каждые 3 или 4 дня. Для этого половину надосадочной фракции клеточной культуры аккуратно декантируют стерильными пастеровскими пипетками, соединенными с водоструйным насосом.Определение антителопродуцирующей способности гибридом При обычных условиях культивирования через 2—3 нед количество клеток в гибридном клоне достигает величины, делающей возможной определение антител. Из культуральных лунок отбирают при помощи автоматической пипетки по 50 мкл надосадочной фракции. Для обнаружения антител можно использовать любой высокочувствительный метод.Следующий этап после получения гибридом — клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см3. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток, которые культивировали в присутствии "кормящих" клеток, не имеющих отношения к гибридомам, но способствующих их росту. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Для этого использовали микрометоды выявления антител к соответствующему антигену. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1—2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела.Применение Обычные поликлональные антитела давно и широко применяются для определения биологически активных веществ - белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и т.п. Моноклональные антитела изза высочайшей специфичности, стандартности и технологичности получения успешно вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.Последовательные срезы через желудок (жел) и пищевод (пищ) мыши, окрашенные двумя моноклональными антителами: 1 - первое моноклональное антитело реагирует с эпителием пищевода и слабее с эпителием желудка; 2- второе моноклональное антитело реагирует только с эпителием желудкаИммуноаффинная хроматография Пропускают белковый раствор, содержащий исследуемый антиген. Большинство макромолекул проходит через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антителами, иммобилизованными на носителе, и антигеном, содержащимся в растворе, образуется иммунный комплекс. После отмывки носителя от не связавшихся белков иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 – pH 4,0) или высокими (pH 11,0 – pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемый белок элюируют с носителя, его собирают и переводят в оптимальный для хранения данного белка буфер.Одним из наиболее распространенных носителей, используемых в биохимии уже на протяжении нескольких десятилетий, является сефароза – специальным образом обработанные сферические гранулы агарозы. Известно несколько способов активации сефарозы, однако чаще других применяют метод активации сефарозы с использованием бромциана (BrCN). Преимуществом данного метода является простота, высокая устойчивость образующихся связей, стабильность сефарозы в довольно широком диапазоне рН (от 2,0 до 12,0). Относительная жесткость и крупные размеры частиц сефарозы позволяют использовать такие носители в колоночной хроматографии при достаточно высоких скоростях подачи растворов на колонку.Активацию сефарозы осуществляют в процессе инкубации раствора бромциана с водной суспензией сефарозы. Бромциан взаимодействует с гидроксильными группами сефарозы, в результате чего образуется имидокарбонат, содержащий электрофильный атом углерода. Помимо этого в ходе реакции образуется неактивный карбамат, не способный к реакции с нуклеофильными боковыми группами аминокислот. При взаимодействии имидокарбоната с нуклеофильными группами, прежде всего с e-аминогруппами лизина, происходит образование прочной ковалентной связи белка с активированной матрицей через остаток изомочевины или N-замещенного карбамата. Реакция активации матрицы бромцианом проходит только в щелочной среде с выделением бромистоводородной кислоты, для нейтрализации которой требуется постоянное добавление щелочи к реакционной смеси. Реакция бромциана с гидроксилами матрицы экзотермична, поэтому ее проводят на ледяной бане. Нужно заметить, что активными нуклеофилами, кроме e-аминогрупп лизина, являются также SH-группа цистеина, концевые аминогруппы белков и ОН-группа тирозина (по активности данные группы располагаются в следующем порядке: SH- ˃ концевая Nh3- ˃ OH-группа тирозина). С другой стороны, тиоэфиры менее прочны, чем кислородные эфиры, а последние уступают по прочности амидным связям.Схема иммобилизации белка на BrCN-активированной сефарозеВторой способ экстракции исследуемого белка из сложной смеси – иммунопреципитация, или экстракция в объеме. Иммунопреципитацию используют при работе с незначительными (нано- и микрограммы) количествами вещества. При этом объем аффинного носителя обычно не превышает сотен микролитров, а объем исследуемого образца – нескольких миллилитров. То есть, иммунопреципитацию используют в тех ситуациях, когда из-за малого количества исследуемого вещества оказывается технически сложным создать адекватную по размерам аффинную колонку.Иммунохроматографический анализ (ИХА) — иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест полосок, панелей или тест кассет. Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии.В качестве меток в ИХА используются различные частицы, обладающие следующими свойствами: 1. Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота. 2. Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса. 3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля. 4. Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера. 5. Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.).Спасибо за внимание

ppt-online.org

Моноклональные антитела - презентация онлайн

1. Моноклональные антитела: анти-VEGF/VEGFR анти-EGFR анти-HER2 анти -CD 20 анти -CD 52 анти -CTLA4 анти-PD1/PDL1

2. Строение IgG

Fab-фрагмент: Fc-фрагмент:

3. Виды МкАТ, используемых в качестве лекарственных препаратов

Мышиные: 100% мышиные белки Химерные: Гуманизированные: CDR-участки(хотя бы 1) – мышиные (5-10%) Остальные 90–95% - человеческие белки Полностью человеческие: 100% человеческие белки

4. Поколения мкАТ

1 поколение 2 поколение 3 поколение 4 поколение мышиные химерные гуманизированные полностью человеческие Состав 100% мышиные белки Мышиные Б - 30-35% Мышиные Б - 5-10%) Человеческие - 65Человеческие Б- 9070% 95% 100% человеческие белки Иммуногенность ++++ +++ + - Цитотоксический + эффект ++ +++ ++++ Период полужизни ++ +++ ++++ +

5. мкАТ

6. Анти-VEGF/VEGFR мкАТ

Название Вид мкАТ Мишени Показания Бевацизумаб (Avastin) Гуман-ное мкАТ VEGF-A Первая и вторая линия терапии КРР Первая линия терапии НМРЛ Вторая линия терапии МФГ мПКР Вторая линия терапии мКРР (после предшествующего бевацизумабсодержащего режима) РЯ Афлиберцепт (Zaltrap, VEGF Trap) Анти-VEGF мкАТ Фьюжен-белок VEGFA, VEGFB, мКРЛ (после предшествующего PIGF1, PIGF2 оксалиплатин-содержащего режима) Рамицирумаб (Cyramza) Полностью человеческое мкАТ VEGFR-2 Распространенный РЖ или ПЖП НМРЛ мКРР

7. Ангиогенез контролируется динамическим равновесием про- и антиангиогенных факторов

Опухоли, активируют «ангиогенный сдвиг” путем изменения равновесия между индукторами ангиогенеза и их ингибиторами (Hanahan and Folkman, 1996)

8. Семейство VEGF (англ. Vascular endothelial growth factor)

VEGF лиганд Тип VEGF рецептора Функции VEGF-A Ангиогенез VEGF-B VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR), нейропилин-1 VEGFR-1 (Flt-1) VEGF-C VEGFR-2 (KDR), VEGFR-3 (Flt-4) Лимфоангиогенез VEGF-D VEGFR-2 (KDR), VEGFR-3 Лимфоангиогенез PlGF VEGFR-1 (Flt-1), нейропиллин-1 Ангиогенез Воспаление Ангиогенез

9. Структурная организация рецепторов семейства VEGFR

Данные тирозинкиназные рецепторы состоят из: - внеклеточного N-концевого лигандсвязывающего участка, который образуют 7 Ig-подобных доменов, - трансмембранного α-спирального домена, - внутриклеточных тирозинкиназного и - С-терминального участков. ТМ — трансмембранный домен; ТКI и ТКII — тирозинкиназные домены I и II, соответственно.

11. Основные эффекты связывания VEGF-A:

12. Механизмы резистентности при анти-VEGF/VEGFR терапии:

14. Бевацизумаб (Avastin)

15. Бевацизумаб (Avastin)

16. Афлиберцепт (Zaltrap, VEGF Trap)

17. Рамицирумаб (Cyramza)

18. Анти-EGFR мкАТ

Название Вид мкАТ Показания Цетуксимаб (Erbitux) Химерное мкАТ КРР (при «диком» типе KRAS) ПРГШ Панитумумаб (Vectibix) Полностью человеческое мкАТ мКРР (при «диком» типе KRAS) Нецитимумаб (Portrazza) Метастатический плоскоклеточный НМРЛ Полностью человеческое мкАТ

19. Семейство HER

20. EGFR (HER-1)

• Лиганды • Биологические эффекты

21. Основные механизмы активации EGFR-зависимых сигнальных путей в опухолевых клетках:

При наличии в опухолевой ткани мутаций гена KRAS терапия мкАТ неэффективна.

24. Цетуксимаб (Erbitux)

25. Панитумумаб (Vectibix)

26. Нецитумумаб (Portrazza)

27. Анти HER-2 мкАТ

Название Вид мкАТ Показания Трастузумаб (Herceptin) Пертузумаб (Perjeta) гуманизированное РМЖ HER2/neu+ , рак желудка HER2/neu+ РМЖ HER2/neu+ Адо-трастузумаб эмтазин (Kadcyla) Иммуноконъюгат: трастузумаб + DM1 гуманизированное РМЖ HER2/neu+

28. Трастузумаб (Herceptin)

29. Пертузумаб (Perjeta)

30. Адо-трастузумаб эмтазин (Kadcyla)

31. Анти CD20 и CD52-мкАТ

Название Вид мкАТ Показания Ритуксимаб (Rituxan) Химерное НХЛ Офатумумаб (Arzerra) Полностью человеческое ХЛЛ Обинитузумаб (Gazyva) Гуманизированное ХЛЛ, фолликулярная лимфома Ибритумомаб (Zevalin) Мышиное мкАТ+90Y НХЛ Тозитумомаб (Bexxxar) Мышиное мкАТ+131I НХЛ Анти CD52 мкАТ Алемтузумаб (Campath-1H) Полностью человеческое ХЛЛ

32. СD20-Аг

33. Ритуксимаб (Rituxan)

34. Офатумумаб (Arzerra)

35. Обинитузумаб (Gazyva)

36. Ибритумомаб (Zevalin)

37. Тозитумомаб (Bexxxar)

38. CD52 Аг

39. Алемтузумаб (Campath-1H)

40. Ингибиторы иммунных контрольных точек: анти-CTLA4 и анти-PD1/PDL1 мкАТ

Название Вид мкАТ Показание Ипилимумаб (Ervoy) Анти-CTLA4 – челов-ое мкАТ Метастатическая меланома Пембролизумаб (Keytruda) Анти PD1- гуман- Неоперабельная или метастатическая меланома, мНМРЛ, р и мПКГШ, ое мкАТ рефрактерная или рецидивирующая лимфома Ходжкина, м-р или м уротелиальный рак, р или мр м аденокарцинома желудка и ПЖП Ниволумаб (Opdivo) Анти PD1-человое мкАТ Метастатическая меланома, метастатический плоскоклеточный НМРЛ, мКРР с высокой МСН, нерезектабельная или диссеминированная меланома с диким типом BRAF V600, распространенный неплоскоклеточный НМРЛ, мПКР, р или мПРГШ, м-р или м рак мочевого пузыря, ГЦР Атезолизумаб (Tecentriq) Анти PDL1-гумое мкАТ местно-распространенный или метастатический уротелиальный рак, метастатический НМРЛ Дурвалумаб (Imfinzi) Анти PDL1-челое мкАТ местно-распространенная или метастатическая уротелиальная карцинома Авелумаб (Bavencio) Анти PDL1-челое мкАТ метастатическая карцинома Меркеля

41. Анти CTLA-4 мкАТ

42. Анти PD1/PDL1 мкАТ

43. Побочные эффекты

Анти CTLA-4 мкАТ Анти PD1/PDL1 мкАТ Сыпь и раздражение слизистых оболочек 50%.3 6,5%2 Диарея и колит аутоиммунной природы 30%1 1-2%2 Гепатотоксичность 10%4 5%2 эндокринопатия, воспалительная пневмония, почечная недостаточность и др. редко крайне редко

44. Ипилимумаб (Ervoy)

45. Пембролизумаб (Keytruda)

Дата Показания 4.09.2014 Метастатическая меланома, после предшествующей терапии ипилимумабом и/или ингибиторами BRAF (ускоренное одобрение). 2.10.2015 Больные НМРЛ с экспрессией лиганда PD-L1, ранее получавшие платиносодержащую химиотерапию (ускоренное одобрение) 19.12.2015 Метастатическая или нерезектабельная меланома, 1 линия терапии 5.08.2016 Больные рецидивирующим или мПРГШ с прогрессированием заболевания после проведения химиотерапии с включением препаратов платины (ускоренное удобрение) 24.10.2016 Первая линия терапии PD-L1-позитивных больных мНМРЛ 10.05.2017 в комбинации с пеметрекседом (Алимта) и карбоплатином в 1 линии терапии больных мНМРЛ (KEYNOTE-021) 18.05.2017 В лечении больных местно-распространенным или метастатическим уротелиальным раком (KEYNOTE-045) 23.05.2017 В лечении больных нерезектабельными или метастатическим солидными опухолями, имеющими высокую микросателлитную нестабильность (MSI-H) или дефицит коррекционной репарации ДНК (dMMR) 22.09.2017 в лечении больных рецидивирующей местно-распространенной или метастатической аденокарциномой желудка или пищеводно-желудочного перехода

46. Ниволумаб (Opdivo)

Дата Показания 22.12.2014 Метастатическая меланома, после предшествующей терапии ипилимумабом и/или ингибиторами BRAF(CheckMate 037) 4.03.2015 Метастатический плоскоклеточный НМРЛ, получавшие ранее химиотерапию на основе преп-тов Pt 30.09.2015 В комбинации с ипилимумабом для лечения больных нерезектабельной или диссеминированной меланомой с диким типом BRAF V600 (ускоренное одобрение) 9.10.2015 Распространенный неплоскоклеточный НМРЛ у больных с прогрессированием заболевания на фоне предшествующей платиносодержащей химиотерапии (CheckMate 057) 23.11.2015 Больные мПКР с прогрессированием заболевания во время или после терапии антиангиогенными пр-ми 24.11.2015 Монотерапия первой линии больных метастатической меланомой (CheckMate-066) 13.09.2016 Больные рецидивирующим или метастатическим ПРГШ с прогрессированием заболевания на фоне/после проведения химиотерапии на основе препаратов платины (CheckMate 141) 22.09.2017 В терапии больных местно-распространенным или метастатическим раком мочевого пузыря(CheckMate275) 1.08.2017 Лечение больных мКРР с высокой микросателлитной нестабильностью или нарушением механизма репарации неспаренных оснований ДНК (CheckMate 142) 22.09.2017 Лечение больных ГЦР, получавших ранее сорафениб (CheckMate 040)

47. Атезолизумаб (Tecentriq)

Дата Показания 18.05.2016 Больные местно-распространенным или метастатическим уротелиальным раком с прогрессированием заболевания на фоне/после проведения химиотерапии с включением препаратов платины1 (IMvigor210) 18.10.2016 Больные метастатическим НМРЛ с прогрессированием заболевания на фоне/после проведения химиотерапии с включением препаратов платины (POPLAR) 1. В связи с этим одновременно с атезолизумабом FDA одобрило диагностический тест Ventana PD-L1 (SP142)

48. Дурвалумаб (Imfinzi)

49. Авелумаб (Bavencio)

50. Список использованной литературы

www.rosoncoweb.ru www.clinicaltrials.gov

ppt-online.org

Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии

Факультет медицины Кафедра СРС Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии. Выполнил: Баимбетов А.А СТР – 247 Принял: Туркестан 2017 г.

2. СОдержание

СОДЕРЖАНИЕ I. Введение II. Основная часть Структура антител Понятие о МКАТ Получение МКАТ Гибридомная технология Применение МКАТ в иммунологии III.Заключение Список литетратуры

3. Введение

ВВЕДЕНИЕ Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Такие сыворотки называются иммунные. Антитела выделяют из сыворотки в виде γ-глобулиновой фракции, осаждая их из сыворотки крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Самое главное, полученные антитела содержат много антител с различной специфичностью, ко многим антигенным детерминантам, как антигена, которым проводилась иммунизация, так и другим антигенам, с которыми встречалось животное-донор.

4. Список сокращений

Ig – иммуноглобулин IgG, IgA, IgM, IgE, IgE - классы сывороточных иммуноглобулинов АГ – антиген АОК – антитело образующие клетки АТ – антитело ГАТ - культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин МкАТ (мАТ) (англ. mab) – моноклональные антитела ПЭГ - полиэтиленгликоль

5. Структура антител

При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются защитные белки - антитела, для которых характерна уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, - точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6—8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка.

6. Моноклональные  антитела

Моноклональные антитела Моноклональные антитела - это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток. Антитела синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена

7. ИССЛЕДОВАНИЕ

Решение проблемы было предложено в 1975 году учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы (гибридные опухолевые клетки) образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro. Георг Кёлер (George Kohler) Цезарь Мильштейн (Cesar Milstein)

8. Схема получения гибридом

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОМ Если к суспензии В-лимфоцитов добавить клетки плазмоцитомы и полиэтиленгликоль, то после инкубации, требующейся для слияния клеток, в системе находились следующие клетки: - гибриды АОК и АОК (В-лимфоцитов и Влимфоцитов), - гибриды АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными - АОК и клетки плазмоцитомы (не слившиеся). Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных не слившихся клеток и от гибридов иной специфичности. Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селективной питательной среде.

11. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител. В основе ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему моноклональным антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием так называемого конъюгата, который представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена).

12. отличие

ОТЛИЧИЕ В отличие от поликлональных гетерогенных сывороток, содержащих большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью, аффинитетом и физико-химическими свойствами, препараты моноклональных антител содержат продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте и обладающий всегда одинаковыми физико- химическими характеристиками и сродством к антигену. Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии.

13. Области применения моноклональных антител:

идентификация субпопуляций лимфоцитов человека истощение клеточных популяций выделение клеток установление функций молекул клеточной поверхности определение группы крови диагностика опухолей и локализация опухолей иммунорадиометрический анализ анализ сложных смесей антигенов анализ эмбрионального развития квадромы анализ иммунного ответа искусственные ферменты

14. Цели использования мкат

ЦЕЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МКАТ •для идентификации клеток - выявления Т- и В-лимфоцитов и других клеток, определения их свойств; •для осуществления современных радиоиммунных, иммуноферментных и иммунолюминесцентных методов выявления антигенов и антител; •для определения локализации антигенов в организме и доставки к ним (например, в опухоль) лекарственных веществ, присоединенных к антителам; •для приготовления иммуносорбентов, позволяющих выделить ели удалить из организма антигены или клетки данной специфичности.

15. Терапевтическое применение

Терапевтическое применение моноклональных антител, которые являлись мышиными антителами, было ограничено. Их введение человеку сопровождалось иммунным ответом на чужой (гетерогенный) мышиный белок. Это приводило к быстрому устранению желаемого терапевтического эффекта, а так же поражению почек и гиперчувствительности к чужеродному мышиному белку.

16. Ритуксимаб

Ритуксимаб (Ритуксан, Мабтера) представляет собой химерные моноклональные антитела мыши/человека специфически связывающиеся с CD20+ антигеном. Этот антиген локализуется на поверхности пре-В-лимфоцитов и зрелых Bлимфоцитов, но отсутствует на стволовых гемопоэтических клетках, нормальных плазматических клетках и здоровых клетках других тканей.

17. Алемтузумаб

Алемтузумаб (Кампат, Кэмпас, Campath) – гуманизированное МКА, связывающееся с CD52. Антиген CD52 экспрессируется на мембране большинства зрелых нормальных и опухолевых Т- и Влимфоцитов с очень высокой плотностью — примерно 500 000 молекул на клетку (по сравнению с антигеном CD20, плотность экспрессии которого составляет около 8000 молекул на клетку).

18. Заключение

Новое поколение МкАТ-технологий, объединяют в себе преимущества МкАТ и низкомолекулярных препаратов, обладающих высокой специфичностью и низкой токсичностью, возможностью воздействовать на объекты, нераспознаваемые современными МкАТ, в том числе на активные центры ферментов и рецепторов. Такие МкАТ обладают более высокой стабильностью, что допускает возможность их перорального, ингаляционного или местного применения

19. ЛИТЕРАТУРА

1. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б. Моноклональиые антитела: Гибридомы: новый уровень логического анализа. М.: Медицина, 1983. 2. Роит А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991. 3. А.Ю. Барышников, Е.Р. Полосухина. Моноклональные тела в онкологии. 4. Г.И. Абелев. Моноклональные антитела.

en.ppt-online.org


Смотрите также