56. Моноклональные антитела. Получение, применение. Моноклональные антитела получение


3.Этапы получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела.

  1. Селекция миеломных клеток.

Для получения гибридом: В-лимфоциты и миеломные клетки выделяют из мышей и крыс. Клетки миеломы (плазмоцитомы) – это злокачественные трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, представляющие собой клоны, образованные при делении единичных измененных опухолевых В-клеток, каждая из которых синтезирует моноклональные антитела неизвестной специфичности и обладает способностью к неограниченному размножению in vivo и in vitro.

На практике чрезвычайно сложно получить миелому с заданной антигенной специфичностью, поэтому получают гибридные клетки-продуценты моноклональных антител, наследующие от миеломного партнера только способность к неограниченному размножению.

Клетки плазмоцитомы, используемые для гибридизации, получают путем мутагенеза. Они должны иметь такие селективные маркерные признаки как устойчивость к 8-азогуанину и бромдезоксиуридину – токсичным аналогам азотистых оснований, входящих в состав ДНК. Такая устойчивость обусловлена неспособностью клетки синтезировать ферменты гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (ГГФРТ) и тимидинкиназу (ТК), которые участвуют в процессах включения пуринов и пиримидинов в синтез нуклеиновых кислот по резервному пути биосинтеза в клетках млекопитающих. ГГФРТ участвует в синтезе пуринов, а ТК – пиримидинов при наличии соответствующих предшественников (гипоксантина и тимидина).

Выделение мутантов, неспособных к синтезу ферментов, осуществляется воздействием мутагенов на клетки миеломной линии с последующим культивированием их в среде, содержащей 8-азогуанин и бромдезоксиуридин. На среде с 8-азогуанином выживают клетки, дефектные по ГГФРТ, а на среде с бромдезоксиуридином – по ТК.

При выборе миеломной линии необходимо учитывать, что в процессе культивирования клеточные линии могут терять способность к слиянию в результате перерастания, потери устойчивости к аминоптерину или заражения микоплазмой. Поэтому успех гибридизации во многом будет определяться тем, в каком состоянии находится миеломная линия, которую выбрали для слияния.

Принципы культивирования миеломных линий:

  1. Миеломная линия, предварительно проверенная на способность к слиянию, должна быть размножена и заморожена в достаточном количестве;

  2. После разморозки клетки можно вести в культуре не более одного месяца;

  3. Для слияния берут миеломные клетки в логарифмической фазе роста, для этого в культуру через день добавляют свежую среду; до момента слияния клетки должны находиться в этой фазе, по крайней мере, одну неделю;

  4. Концентрация клеток в культуре не должна превышать 0,5 – 1,0 млн./мл;

  5. Культуру клеток необходимо ввести в культуральную среду, к которой она адаптирована; перевод культуры в другую среду проводят постепенно;

  6. Периодически целесообразно культивировать миелому в присутствии токсического аналога нуклеотидов, использованного для селекции данной линии, чтобы избежать перерастания ревертантов;

  7. Если миеломная линия потеряла способность к слиянию, размораживают новые ампулы, хранящиеся в жидком азоте.

  1. Иммунизация мышей антигеном.

Схемы иммунизации, применяемые разными исследователями, значительно варьируются и определяются имеющимся типом и количеством антигена. Иммунизация должна стимулировать формирование иммунного ответа и выраженное антителообразование.

Антиген вводят внутривенно, внутрибрюшно или подкожно с адъювантом (веществом, усиливающим иммуногенность антигенов) или без него в нарастающей дозе.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это осложняет отбор клонов, синтезирующих нужные антитела. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере, на ее последних этапах. Однако одним из основных достоинств гибридомной технологии является именно то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и затем использовать эти антитела для его очистки

Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться образовывать антителопродуцирующие гибридные клетки. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделить селезеночные лимфоциты животных через 3 – 4 суток после последней иммунизации, т.е. когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Способы и схемы иммунизации.

Существует большое число способов и схем иммунизации. Схемы иммунизации зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ животного. Среди адъювантов широкое распространение получил полный адъвант Фрейда (ПАФ). Помимо этого используют введение антигена, преципитированного на квасцах вместе с антигеном убитых клеток Bordetella pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития иммунного ответа. Вместе с тем гипериммунизация может снизить способность образовывать гибридомы. Хотя иногда бывает достаточно одной иммунизации.

Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схему иммунизации:

  1. Вводят 1 – 100 мкг антигена в ПАФ (внутрибрюшинно) или без ПАФ (подкожно).

  2. Через 2 – 3 недели вводят антиген в физиологическом растворе внутрибрюшинно или внутривенно. Эту процедуру повторяют до появления высокого титра антител. (Титр антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной величиной).

  3. Последнюю иммунизацию делают внутривенно. Через 3 дня животных забивают, извлекают селезенку и готовят суспензию селезеночных лимфоцитов для гибридизации.

Когда в распоряжении экспериментатора имеется небольшое количество антигена или необходимо провести ускоренную гибридизацию, используют метод однократной иммунизации внутрь селезенки или метод иммунизации in vitro.

При однократной иммунизации внутрь селезенки используется всего 20 мкг белка или 1 млн. клеток. Этот метод рекомендуется, когда нужно быстро получить гибридомы, имея в распоряжении минимальное количество антигена.

Иммунизация in vitro имеет ряд существенных преимуществ:

а) период иммунизации занимает 4 – 5 сут;

б) требуется небольшое количество антигена;

в) повышается процент встречающихся клеток;

г) легко подбирать факторы, влияющие на эффективность иммунизации.

  1. Получение клеток селезенки (получение В-лимфоцитов).

В гуморальном иммунитете участвует преимущественно лимфоидная ткань селезенки, обеспечивая накопление большого количества плазматических клеток, синтезирующих антитела. Через 4 дня после последней инъекции антигена мышей убивают, извлекают селезенку, измельчают ее и готовят суспензию в специальной среде для культивирования, в состав которой входят аминокислоты, витамины, углеводы и неорганические соли. Эту взвесь используют для слияния. Суспензию клеток селезенки готовят при комнатной температуре.

  1. Гибридизация (слияние) клеток миеломы и В-лимфоцитов селезенки.

Для проведения слияния используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), который вызывает перераспределение мембранных белков, обеспечивая контакт и слияние клеток. В ПЭГ должны присутствовать ионы кальция, которые способствуют сближению клеток и образованию между ними кальциевых каналов.

Лимфоциты селезенки и клетки миеломы смешивают, осаждают центрифугированием, готовят суспензию в среде для слияния, содержащей 50 %-ный раствор ПЭГ и хлорид кальция, выдерживают 30 – 40 мин при 37 °С, а затем опять центрифугируют. Слияние проводят либо в осадке в конической пробирке, либо в монослое.

Этапы гибридизации клеток миеломы и В-лимфоцитов селезенки:

  1. Готовят суспензию селезеночных лимфоцитов и миеломы отмывают 2 раза в среде без сыворотки с помощью метода центрифугирования.

  2. Смешивают две суспензии в одной пробирке в соотношении от 1: 1 до 1: 10 в зависимости от выбора экспериментатора.

  3. Клетки помещают в центрифужную пробирку на 50 мл и центрифугируют при комнатной температуре 3 – 5 мин при 800 – 1000 об/мин.

  4. Тщательно удаляют всю надосадочную жидкость и медленно, по каплям, в течение 1 мин добавляют раствор полиэтиленгликоля, осторожно перемешивая осадок кончиком пипетки.

  5. По истечении одной минуты очень медленно и постепенно добавляют теплую (37 С) среду без сыворотки, доводя объем до 50 мл.

  6. Ставят пробирку в СО2-инкубатор на 1 – 2 ч.

  7. Центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.

  8. Осадок осторожно ресуспендируют в среде культивирования в необходимом объеме.

  9. Разливают суспензию слившихся клеток по 0,1 мл в 96-ти луночные планшеты и помещают в СО2-инкубатор.

  10. Постепенно заменяют среду культивирования селективной средой, добавляя по 0,1 мл среды ГАТ через каждые 3 дня.

  11. Начиная с пятых суток, ежедневно просматривают планшеты под микроскопом и отмечают в них рост колоний гибридомных клеток, записывая номера положительных лунок.

  12. Культуры подкармливают каждые 2 – 3 сут., удаляя половину культуральной жидкости, добавляя такое же количество свежей среды.

  13. Через 7 – 14 дней из лунок с растущими гибридомами отбирают супернатан и тестируют его на наличие специфичных антител подходящим методом скрининга.

  14. Клетки гибридом, синтезирующих специфические антитела, переносят в 24-х луночные планшеты, размножают, замораживают и клонируют как запасную культуру. Оставшиеся в 96-ти луночном планшете клетки продолжают еще некоторые время культивировать.

  1. Селекция гибридом на среде ГАТ.

Осадок клеток ресуспендируют в среде ГАТ, содержащей гипоксантин (Г), аминоптерин (А), тимидин (Т), разливают в лунки микропланшет и инкубируют при 37 °С в атмосфере диоксида углерода в течение 10 – 16 дней. Через каждые 3 – 4 дня производят замену в лунках на новую среду того же состава.

В среде ГАТ происходит отделение неслившихся миеломных клеток и лимфоцитов от гибридом, выживают на такой среде только гибридные клетки.

Аминоптерин (4-аминофолиевая кислота) блокирует основной путь биосинтеза нуклеотидов для всех клеток. Этот препарат обладает сильным цитостатическими свойствами, как аналог фолиевой кислоты он блокирует синтез пуринов, тимина и других аминокислот при этом происходит повреждение клеток, особенно быстрорастущих.

Гипоксантин и тимидин добавляют в среду в качестве предшественников пуринов и пиримидинов, использующихся для синтеза нуклеотидов по резервному пути биосинтеза с участием ТК и ГГФРТ.

Миеломные клетки погибают на среде ГАТ, т.к. из-за дефектности по ТК и ГГФРТ не способны использовать гипоксантин и тимидин для синтеза нуклеотидов.

Неслившиеся лимфоциты отмирают через несколько дней после гибридизации, т.к. они не способны к длительному выживанию in vitro.

Таким образом, на среде ГАТ должны выживать только непрерывно растущие клоны гибридных клеток. В гибридомах будут экспрессированы гены миеломных клеток и В-лимфоцитов. От миеломных партнеров наследуются способность к неограниченному росту в культуре или in vivo, а от В-лимфоцитов селезенки – способность к продукции антител известной специфичности и возможность использовать обходной путь синтеза нуклеотидов при участии ТК и ГГФРТ.

Быстро растущие клоны гибридом становятся различимы в виде плотных колоний клеток на дне лунок микропланшет. Подсчет количества клонов в лунках осуществляется с помощью инвертированного микроскопа.

6. Определение антителообразующей способности гибридом.

Идентификация клеток, синтезирующих антитела заданной специфичности очень важная процедура во всей гибридомной технологии. Новообразованные гибридомы могут быть нестабильными в отношении синтеза антител, поэтому методы раннего выявления отдельных антителообразующих клонов должны быть быстрыми и простыми. Наличие антител определяется в надосадочных фракциях культуральной среды в лунках микропланшет, для чего отбирают по 50 мкл среды с помощью автоматических многоканальных пипеток. Концентрацию антител определяют высокочувствительными методами радиоиммуноанализа (РИА) или иммуноферментного анализа (ИФА).

7. Клонирование гибридом.

Обнаруженные антителообразующие клоны должны быть немедленно реклонированы, необходимость этого обусловлена тем, что после слияния во многих гибридах начинается «выброс» хромосом, продолжающийся до тех пор, пока число хромосом в клетке не будет равным приблизительно 2N. В ходе этого процесса некоторые клетки могут потерять хромосомы, несущие гены иммуноглобулинов. Существует опасность, что такие клетки, не способные больше продуцировать иммуноглобулины, будут расти лучше клонов антителообразующих клеток. В каждой лунке не всегда образуется только один гибридный клон. В этом случае возникает необходимость отделить ненужные клоны от тех, которые представляют интерес для исследования.

Гибридомы можно клонировать методом предельных разведений. Клетки отбирают из тех лунок, в которых обнаружены антитела нужной специфичности, ресуспендируют в синтетической среде обычного состава с добавлением сыворотки крови плода коровы и затем разводят этой же средой таким образом, чтобы при последующем разливе в каждую лунку микропланшета попала бы только одна клетка и формировался только один клон гибридом.

Для выращивания гибридных клонов часто применяют кондиционированные питательные среды, в которых уже культивировались макрофаги или лимфоциты, и которые выполняют в этом случае роль фидеров (клеток-кормушек). Применяют также совместное культивирование гибридом и фидерных клеток, получаемых от нормальной мыши соответствующей линии.

Через несколько дней проверяют наличие антител только в тех лунках, в которых обнаружен лишь один клон. В том случае, если в лунках образуется больше одного клона, клонирование повторяется. На этом этапе также проводят контроль антителообразующей способности клонов.

Рассмотрим подробнее некоторые методики клонирования гибридом.

Клонирование методом предельных ( лимитирующих) разведений.

  1. За один или два дня до клонирования засевают фидерные клетки в 96-ти луночные планшеты.

  2. Отбирают клетки гибридом и подсчитывают их количество в камере Горяева.

  3. Делают десятикратное разведение в культуральной среде до концентрации в последней пробирке – 10 клеток в мл.

  4. Из последней пробирки отбирают по 0,1 мл суспензии клеток и рассевают в 96 лунок планшета.

  5. Через 5 – 7 дней под инвертированным микроскопом отмеривают лунки с растущими клонами.

Клонирование в полужидком агаре.

  1. В чашку Петри на культуральной среде засевают фидерные клетки.

  2. Культуральную среду удаляют, заливают нижний (твердый) слой, содержащий 0,5 % агар-агара в среде культивирования, и дают ему затвердеть.

  3. Добавляют второй слой (мягкий), содержащий 0,3 % агар-агара, в который включаются клонируемые клетки. Для приготовления мягкого агарового слоя смешивают равные части среды культивирования двойной концентрации и 0,6 % агар-агара (в дистиллированной воде), помещают в водяную баню при 43 – 44 С до употребления. Клетки в минимальном объеме вносят в мягкий агаровый слой и держат при комнатной температуре до затвердения.

  4. Чашки помещают в СО2-инкубатор и наблюдают за ростом колоний. Колонии становятся видимыми через 7 – 14 сут.

  5. Выросшие колонии извлекают пипеткой и переносят в жидкую культуральную среду для дальнейшего размножения.

Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра.

Д. Паркс с сотрудниками (1971 г.) предложили модификацию проточного цитофлуориметра, позволяющего клонировать индивидуальные клетки. Для этого приготовляют флуоресцентные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие шарики адсорбируются на антигенспецифичных гибридомных клетках, что позволяет выделить их на этом приборе.

После выделения тем или иным способом положительных клонов их клетки размножают в достаточном количестве и образцы замораживают. Периодически необходимо проводить их реклонирование.

8. Накопление клеток, синтезирующих моноклональные антитела.

Когда количество гибридных клеток в лунках заметно увеличиться, их переносят в планшеты с лунками больших объемов и затем в культуральные сосуды объемом 25 – 50 мл. На этом этапе можно получить достаточное количество для культивирования in vivo или в специальных биореакторах in vitro.

Гибридомы легко культивируются после их хранения в замороженном состоянии в жидком азоте при – 70 °C в среде, содержащей 20 % сыворотки крови и 10 % диметилсульфоксида. Клетки замораживают: на этапах получения, клонирования и реклонирования для последующего возобновновления в случае ее гибели вследствие контаминации.

Замораживание гибридных клеток.

Готовят среду для замораживания, состоящую из среды культивирования с добавками 20 % эмбриональной телячьей сыворотки и 10 % диметилсульфоксида.

  1. Клетки осаждают центрифугированием при 20 об/мин, 4 С.

  2. К осадку добавляют необходимое количество холодной среды и разливают по ампулам для замораживания в концентрации 2 – 5*106 мл.

  3. Замораживание можно производить несколькими способами:

  • в специальном аппарате с программным обеспечением постепенного снижения температуры до – 120 С;

  • помещают ампулы в коробку из пенопласта с толщиной стенок около 1 см; коробку закрывают крышкой и ставят на сутки в морозильник (при – 70 С), после чего ампулы переносят в контейнеры с жидким азотом.

При отсутствии в лаборатории резервуара с жидким азотом замороженные клетки можно хранить при – 70 С в течение года. В жидком азоте клетки хранят несколько лет.

Размораживание клеток.

  1. Ампулы с замороженными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и быстро помещают на водяную баню при 37 С.

  2. Растаявшую суспензию клеток переносят в центрифужные пробирки и добавляют не менее 10 мл культуральной среды так, чтобы содержание диметилсульфоксида в ней снизилось до 1 %.

  3. После центрифугирования к осадку добавляют нужное количество культуральной среды и выращивают гибридные клетки в 96- или 24-луночных планшетах.

Существует также более мягкий способ разморозки гибридом.

  1. Готовят 10 мл теплой среды для культивирования.

  2. Ампулу с клетками помещают в водяную баню при 37 С.

  3. К размороженным клеткам добавляют 1 мл среды, встряхивают и оставляют на 4 мин.

  4. Постепенно добавляют 2, 4 и затем еще раз 4 мл среды, доведя объем среды до 10 мл.

  5. Клетки помещают во флаконы и культивируют в течение ночи при 37 С.

  6. Сливают мертвые клетки и добавляют свежую среду.

9. Крупномасштабное культивирование гибридом и накопление моноклональных антител.

При росте гибридом в культуральной жидкости достигается выход 10 – 100 мкг/мл чистых антител. Такие антитела можно использовать без дополнительной очистки (после концентрирования) в основном они используются в качестве первых антител для непрямой флуоресценции или иммунопреципитации.

Если требуются большие количества антител, то гибридому можно выращивать в виде трансплантируемой опухоли у мышей гистосовместимой линии.

Культивирование гибридом in vivo.

Для культивирования гибридом in vivo их вводят мышам или крысам внутрибрюшинно. Моноклональные антитела будут накапливаться во внутрибрюшинной асцитической жидкости в количестве 1 – 25 мг/мл. Для получения асцитов перед введением гибридных клеток (в период от трех дней до одного месяца) внутрибрюшинно инъецируют 0,5 мл пристана (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан) или неполный адъювант Фрейнда, которые повышают способность гибридом расти в брюшной полости. Асцитную жидкость можно собирать с 14-го дня после введения пристана или адъюванта.

Процесс культивирования гибридом in vivo является очень дорогим методом, т.к. животных необходимо содержать в специальных вивариях, к которым предъявляются очень строгие санитарно-гигиенические требования: в них должны быть обеспечены асептические условия, осуществляться подача стерильного воздуха, стерильной пищи, обязательным условием является наличие специальной одежды для персонала, работающего по вахтовому методу, следовательно, создание таких условий связано с большими трудностями из-за необходимости содержания большого количества животных. Ведь для производства 1 кг моноклональных антител необходимо несколько тысяч мышей или крыс.

Размножение гибридом in vitro.

Предпочтительнее культивировать гибридомы в специальных биореакторах большого объема, где можно достичь значительно большего выхода моноклональных антител, чем от животных. При крупномасштабном культивировании стоимость моноклональных антител значительно снижается.

При росте в культуре гибридные клетки должны поддерживаться в логарифмической фазе роста в концентрации не выше 0,5 млн./мл. Клетки наращивают в культуральных флаконах увеличивающихся размеров. Ускорению роста гибридом может способствовать добавление фидерных клеток. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах). При обычных методах культивирования в супернатанах культур содержится 10 – 100 мкг/мл антител. Более высокие концентрации удается получить в ферментерах на специальных питательных средах с низким содержанием эмбриональной телячьей сыворотки и добавлением определенных препаратов (до 660 мкг/мл).

В настоящее время созданы специальные системы интенсивного культивирования гибридом в течение 1 – 2 мес. По истечении этого срока необходимо проводить повторное клонирование гибридом, поскольку могут возникать клетки, не продуцирующие антитела.

Способы крупномасштабного культивирования гибридом и получения моноклональных антител:

1. Инкубирование в аппаратах эрлифтного типа. Суспензия клеток-антителопродуцентов постоянно перемешивается путем подачи газов: смеси диоксида углерода и воздуха, но в таких условиях возможно разрушение значительного количества клеток, поэтому для устранения данного нежелательного явления их заключают в микрокапсулы.

2. Совмещение эрлифтного типа культивирования с одновременным микрокапсулированием (в данном случае цикл культивирования составляет 1 мес., а выход антител – 59 – 250 мг/мл). Существуют следующие разновидности данного метода культивирования:

а) иммобилизация гибридом на стеклянном матриксе или в капсулах агарозы.

б) создание системы с инкапсулированными клетками-продуцентами моноклональных антител. Микрокапсулы из альгината поли-L-лизина проницаемы для метаболитов, но не для молекул антител. Через две недели культивирования капсулы отделяются от культуральной жидкости и размыкаются. Используют также микрокапсулы, состоящие из альгината, стабилизированного кальцием.

3. Создание мембранноперфузионных систем. Гибридомы помещают в пространства полых волокон, через которые проходит питательная среда. При таком способе культивирования гибридомы достаточно стабильны, а выход моноклональных антител достигается такой же, как при использовании капсул из альгината.

Для улучшения очистки и увеличения выхода моноклональных антител постоянно совершенствуется состав сред для культивирования, например, уменьшают содержание в среде сыворотки крови крупного рогатого скота или эмбриональной телячьей сыворотки, заменяя их комплексом низкомолекулярных биологически активных веществ и гормонов.

10. Концентрирование и очистка моноклональных антител.

Супернатаны культур можно использовать и без предварительной очистки в иммуноферментных и иммуногистохимических анализах.

Если моноклональные антитела, содержащиеся в асцитической жидкости, необходимо получить в чистом виде, то сначала определяют их класс и подкласс. Для идентификации класса антител применяют набор антител, специфических к отдельным классам и подклассам мышиных иммуноглобулинов, которые выпускаются многими фирмами.

Грубую иммуноглобулиновую фракцию получают высаливанием белков сульфатом аммония (45 % насыщения) с последующим диализом. Затем можно использовать различные методы аффинной или ионообменной хроматографии. Хроматографией на сефарозе с ковалентно пришитым белком А, обладающим высоким сродством к Fc-фрагменту антител, можно очистить иммуноглобулины мыши (IgG2a, IgG2b, IgG3).

По окончании процесса сорбции, иммуноглобулины десорбируют и концентрируют с применением лиофильной сушки

  1. Области применения моноклональных антител.

  1. Диагностика:

  • иммунологические анализы биологических жидкостей и клеток организма, микроорганизмов, вирусов и т.п.;

  • иммуногистохимическиие методы анализа;

  • иммуносцинография опухолей;

  • типирование групп крови и тканей;

  1. Терапия:

    • воздействие на отдельные клеточные популяции;

    • влияние на иммунные регуляторные механизмы с помощью антител к лимфокинам;

    • иммунорегуляция с помощью антиидиотипических антител;

    • направленный транспорт лекарственных веществ;

    • элиминация токсинов, иммунотоксинов и аллергенспецифичных антител.

    1. Технология:

      • идентификация молекул;

      • очистка молекул и клеток, несущих специфический антиген;

      1. Научные разработки:

        • исследования этиологии и патогенеза различных заболеваний;

        • исследование системных и межсистемных механизмов регуляции;

        • создание новых лекарственных средств и биопрепаратов.

        Рассмотрим некоторые примеры практического использования моноклональных антител:

        Поскольку гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, в некоторых институтах и лабораториях для научных целей создаются так называемые гибридомные банки.

        Многие фармацевтические фирмы кровно заинтересованы в увеличении масштабов производства моноклональных антител, поскольку сфера их применения помимо количественного определения различных веществ включает разнообразную диагностику (например, идентификация определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов).

        Благодаря использованию моноклональных антител стало возможным определение дозы лекарственных средств. Надежность и экономичность такой иммунодозировки следует считать существенным достижением. В мае 1981 г. Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США впервые утвердило к продаже набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. Такие же наборы разрабатываются для тестирования гормонов, диагностики вирусных заболеваний, обнаружения некоторых видов рака и т.п.

        Еще одним направлением применения моноклональных антител является устранение неблагоприятных последствий, вызванных передозировкой лекарственными средствами. Антитела против лекарственных препаратов, например, дигоксина, могут оказаться полезными для снятия неблагоприятных последствий, вызванных его передозировкой, хотя сегодня до конца и не ясно, нужно ли применять их экстракорпорально, связанными с твердым носителем, через который циркулирует кровь, или вводить непосредственно в кровоток.

        Диагностика злокачественных новообразований и наблюдение за ними:

        На сегодняшний день известно несколько специфических опухолевых маркеров, которые используются в диагностике, прогнозировании и выявлении распространения опухолей.

        Некоторые из них обнаруживаются в крови, а другие находят в препаратах опухолей. Так, например, L-фетопротеин является главным белком сыворотки плода: его содержание уменьшается в течение первого года жизни. Таким образом, определяя содержание L-фетопротеина в плазме при помощи метода РИА (радиоиммунологического анализа), было обнаружено, что оно повышается у многих больных гипатомой, а также при раке семенников.

        У многих больных, страдающих раком прямой кишки, в плазме отмечается повышенное содержание карциноэмбрионального антигена. Дальнейшее его увеличение может служить указанием на неэффективность химио- и лучевой терапии.

        Помимо того, что моноклональные тела применяются, как специфические реагенты в стандартных тестах, они могут использоваться и для идентификации новых, более специфических маркеров опухолей.

        Так, например, Ритсу и его сотрудникам удалось получить моноклональные антитела к антигену клеток при остром лимфолейкозе человека.

        Развитию новых способов лечения может способствовать направленное введение лекарственных препаратов, присоединяемых к антителам против других опухолей.

        Направленное введение лекарственных препаратов.

        Моноклональные антитела могут найти применение для введения лекарственных веществ и токсинов в определенную часть тела (например, в опухоль): либо путем их непосредственного присоединения к таким веществам, либо путем связывания с поверхностью липосом, содержащих внутри эти вещества.

        Были получены комплексы антител к поверхностным антигенам раковых клеток со многими неспецифическими противораковыми средствами, но далеко не всегда они оказывались эффективными. Наиболее многообещающим является использование сильнодействующих растительных или бактериальных токсинов, одна молекула которых может вызывать гибель клетки.

        Так, например, молекула токсина дифтерии: образована двумя полипептидными цепями, связанными дисульфидными мостиками. Цепь В связывается с клеточной поверхностью, а цепь А, обладающая ферментативной активностью, проникает внутрь клетки и нарушает работу механизма биосинтеза белка. Были предприняты попытки, заменить В-цепь токсина специфическими антителами, преимущественно гомогенными. Также недавно был получен препарат моноклональных антител к антигену раковых клеток прямой кишки, ассоциированных с А-цепью токсина, который избирательно действует на эти клетки в культуре.

        С помощью моноклональных антител возможно также выделение биологически активных веществ (таких, например, как белки, гормоны, токсины) из сложных смесей. В случае интерферона Сичер и Берк из Уорвикского университета (Великобритания) с помощью метода иммуноадсорбции получили препарат со степенью около чистоты 1 %.

        По этому методу антитела были пришиты к углеводным гранулам и исследованы для приготовления колонки с иммуносорбентом, на которой очищали грубый препарат интерферона. После одного пассажа через такую колонку с иммобилизованными моноклональными антителами препарат очищается в 5000 раз лучше.

        Можно также использовать моноклональные антитела точной идентификации специализированных клеток, таких, например, как нейтроны, чтобы глубже изучить способы их взаимодействия и функционирование (т.е. локализацию химических нейромедиаторов).

        Очень ценна техника моноклональных антител и для изучения клеточных мембран. Мембранные белки трудно выделить в чистом виде. Они присутствуют в клетках в малом количестве, их биологическую активность трудно измерить или же она и вовсе исчезает при растворении мембран в аналитических экспериментах. Эти трудности можно преодолеть, если прибегнуть к иммунологическим методам изучения мембранных белков, как это было сделано в случае антигенов клеточной поверхности, являющихся маркерами разных стадий дифференцировки тканей. Обычные препараты антител против клеточных антигенов, как правило, сложные и не способные распознавать отдельные молекулы.

        Кроме того, еще одной сферой применения моноклональных антител является терапия различных заболеваний, так, например, эффективность серотерапии может быть увеличена благодаря применению моноклональных антител.

        Также с помощью моноклональных антител можно изготовлять высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных штаммов и паразитов.

        Моноклональные антитела способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата. В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-мишени, позволяя при этом избегать серьезных побочных явлений, столь обычных при химиотерапии рака.

        studfiles.net

        56. Моноклональные антитела. Получение, применение.

        Моноклональные антитела. Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в ре­зультате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природ­ных условиях макроорганизма получить моно­клональные антитела практически невозмож­но. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначи­тельно различающихся антигенной специфич­ностью рецепторов и, естественно, аффиннос­тью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаемполиклональные антитела.

        Принципиально получение моноклональных антителвыполнимо, если провести пред­варительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.

        Проблема получения моноклональных ан­тител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммун­ных В-лимфоцитов с миеломной (опухоле­вой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопродуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток полу­чил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неогра­ниченном количестве вырабатывает антите­ла. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных кле­ток, обладавшие наивысшей продуктивнос­тью и наибольшей аффинностью специфи­ческих антител.

        Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В послед­нем случае моноклональные антитела накап­ливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются гибридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартиза­ции и используют для создания на их основе диагностических препаратов.

        Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применениепри создании диагностических и лечебных иммунобиоло­гических препаратов.

        57.Реакция пассивной гемагглютинации. Компоненты. Применение. Реакции между антигенами и антителами in vitro или серологические реакции применяют для определения антигенов или антител по одному известному реагенту. В серологических реакциях можно установить титр антител в сыворотке крови при помощи известного антигена и на основании полученных данных судить об имевшем место контакте между инфекционным агентом и макроорганизмом. С помощью известных антитея, содержащихся в диагностических иммунных сыворотках, могут быть идентифицированы самые разнообразные антигены, в том числе микроорганизмы — возбудители заболеваний людей и животных, и определен их серовариант (серовар). Серологические реакции дают возможность судить о динамике накопления антител в процессе заболевания, напряженностл иммунитета, возникающего после предохранительных прививок. Таким образом, серологические реакции в диагностических целях применяются в двух направлениях:

        1)для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для определения неизвестных антител с помощью известного антигена, и

        2)для определения вида антигена (микроба) или его серовара с помощью известных диагностических антисывороток.

        Серологические реакции характеризуются двумя показателями — специфичностью и чувствительностью. Под специфичностью понимают способность антигена реагировать только с гомологичными антителами. Чувствительность — это возможность определения минимальных количеств антигена или антител Внешнее проявление реакции зависит от физического состояния антигена и условий ее постановки. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые антигены — преципитацию. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

        Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

        Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

        Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

        Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.

        Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

        Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич­ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.

        Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

        studfiles.net

        Моноклональные антитела. Получение, применение. — КиберПедия

        Моноклональные антитела.Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в ре­зультате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природ­ных условиях макроорганизма получить моно­клональные антитела практически невозмож­но. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначи­тельно различающихся антигенной специфич­ностью рецепторов и, естественно, аффиннос­тью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем поликлональные антитела.

        Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести пред­варительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.

        Проблема получения моноклональных ан­тител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммун­ных В-лимфоцитов с миеломной (опухоле­вой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопродуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток полу­чил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неогра­ниченном количестве вырабатывает антите­ла. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных кле­ток, обладавшие наивысшей продуктивнос­тью и наибольшей аффинностью специфи­ческих антител.

        Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В послед­нем случае моноклональные антитела накап­ливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются гибридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартиза­ции и используют для создания на их основе диагностических препаратов.

        Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиоло­гических препаратов.

        64 Методы приготовления и применения агглютинирую­щих, адсорбированных сывороток.

        В диагностике инфекционных болезней широко применя­ются иммунные реакции при идентификации возбудителя: при установлении родовой, видовой и типовой принадлежности микроба (вируса). Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки, которые в зависи­мости от содержания соответствующих антител называются агглютинирующие, преципитирующие, гемо­литические, противовирусные.

        Агглютинирующие сыворотки. Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то макси­мальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствую­щим микроорганизмом.

        Агглютинирующие сыворотки применяются при идентифи­кации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

        Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки облада­ют высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600.

        Недостатком таких сывороток является то, что они способ­ны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода.

        Поэтому в настоящее время большинство агглютинирую­щих сывороток выпускаются адсорбированными, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содер­жащими только типовые или видовые антитела и соответст­вующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению.

        Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственны­ми гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворот­ке. В зависимости от полноты истощения групповых агглюти­нинов можно получить монорецепторные сыворотки — сыво­ротки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглю­тинации с двумя — тремя родственными бактериями, имею­щими общий антиген, в отношении которого проводилась ад­сорбция.

        Адсорбированные сыворотки применяют при идентифика­ции выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод).

        Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применя­ются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae. Так, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки; при дифференциации сальмонелл — набор сывороток: агглю­тинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная О-сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) — для определения принадлежности к роду Salmonella, при положительном ре­зультате — определяют отдельно с каждой сывороткой (входя­щей в смесь) серологическую группу и в заключение опреде­ляется серологический тип выделенного возбудителя с моно-рецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу.

        Вакцины

        Термин «вакцина» (от франц. vacca — корова) ввел Л. Пастер в честь создателя первой вакцины Дженнера, применившего вирус коровьей оспы для иммунизации людей против натуральной оспы человека.

        Вакцины используют в первую очередь для активной специ- фической профилактики инфекционных заболеваний. Однако в последнее время область применения вакцин значительно рас- ширилась. Созданы вакцины для профилактики и лечения неин- фекционных и онкологических болезней, наркозависимости, та- бакокурения и др. Действующим началом всех вакцин является специфический антиген.

        Вакцина представляет собой сложный ИБП, в состав которого, кроме специфических антигенов, входят стабилизаторы, консер- ванты, адъюванты. В качестве стабилизаторов, предохраняющих антиген от разрушения, чаще всего используют гомологичные белки (человеческий альбумин, сахарозо-агар-желатин и др.). В качестве консервантов для подавления роста случайно попавших в препарат микроорганизмов применяют мертиолат, формалин и другие антимикробные препараты. Иногда для повышения имму- ногенности антигена в вакцинные препараты добавляют адъюван- ты различной природы.

        Вакцины применяют парентерально, внутримышечно, подкож- но, чпескожно или интраназально, перорально согласно календа- рю прививок или по определенным для каждой вакцины показа- ниям.

        Общая характеристика вакцин, применяемых в практике

        В настоящее время в мире создано более 100 различных вакцин. с помощью которых медики могут контролировать более 40раз- личных инфекций.

        Применение этих вакцинных препаратов позволило человече- ству достичь невероятных успехов в борьбе с инфекционнымиза- болеваниями. Эффективность вакцин сильно различается. Тем не менее независимо ог этого их применение всегда обоснованно, о чем свидетельствует значительное снижение заболеваемости и смертности среди вакцинированных.Специалисты из США счи- тают, что средняя продолжительность жизни за XX век выросла по сравнению с ожидаемой по крайней мере на 20 лет, и 80% этого увеличения относят i:a результат широкого применения вакцин- ных препаратов. Применение вакцин но только позволяет сохра- нить здоровье и даже жизнь миллионам людей, но и дает огромныйэкономический эффект КО > считает пакиняацию наиболее эф- фективным способом борьбы c инфеционной заболеваемостью Существуют общие требования ко всем вакцинным препара- там. Любая вакцина, рекомендуемая для применения, должна быть иммуногенна, безопасна, нереактогенна, не должна вызы- вать аллергических реакций, не должна обладать тератогенностью и онкогенностью. Штаммы микроорганизмов, из которых гото- вят вакцинный препарат, должны быть генетически стабильными.

        Вакцина должна иметь длительный срок хранения, производство ее должно быть технологичным, а способ применения — простым и доступным для массового применения.

        -

         

         

        № 66 Живые вакцины. получение, применение. Достоинства и недостатки.

        Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий. Аттенуация (ослабление) возможна путём воздействия на штамм химических (мутагены) и физических (температура) факторов или посредством длительных пассажей через невосприимчивый организм. Так же в качестве живых вакцин используются дивергентные штаммы (непатогенные для человека), имеющие общие протективные антигены с патогенными для человека микробами. Примером такой вакцины является БЦЖ и вакцина против натуральной оспы.Возможно получение живых вакцин генно-инженерным способом. Принцип получения таких вакцин сводится к созданию непатогенных для человека рекомбинантных штаммов, несущих протективные антигены патогенных микробов и способных при введении в орг. человека размножаться и создавать иммунитет. Такие вакцины называют векторными.Вне зависимости от того, какие штаммы включены в вакцины, бактерии получают путём выращивания на искусственных питательных средах, культурах клеток или куриных эмбрионах. В живую вакцину, как правило, добавляют стабилизатор, после чего подвергают лиофильному высушиванию.В связи с тем, что живые вакцины способны вызывать вакцинную инфекцию (живые аттенуированные микробы размножаются в организме, вызывая воспалительный процесс проходящий без клинических проявлений), они всегда вызывают перестройку иммунобиологического статуса организма и образование специфических антител. Это так же может являться недостатком, т. к. живые вакцины чаще вызывают аллергические реакции.Вакцины данного типа, как правило, вводятся однократно.Примеры: сибиреязвенная вакцина, чумная вакцина, бруцеллёзная вакцина, БЦЖ вакцина, оспенная дермальная вакцина.

        № 67 Инактивированные (корпускулярные) вакцины. Применение. Недостатки.Инактивированные (убитые, корпускулярные или молекулярные) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе протективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины). Для выделения из бактерий и вирусов антигенных комплексов (гликопротеинов, ЛПС, белков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, изоэлектрическое осаждение.Их получают путем выращивания патогенных бактерий и вирусов на искусственных питательных средах, инактивируют, выделяют антигенные комплексы, очищают, конструируют в виде жидкого или лиофильного препарата.Преимуществом данного типа вакцин является относительная простота получения (не требуется длительного изучения и выделения штаммов). К недостаткам же относятся низкая иммуногенность, потребность в трехкратном применении и высокая реактогенность формализированных вакцин. Так же, по сравнению с живыми вакцинами, иммунитет, вызываемый ими, непродолжителен.В настоящее время применяются следующие убитые вакцины: брюшнотифозная, обогащенная Vi антигеном; холерная вакцина, коклюшная вакцина.

         

        № 68 Субклеточные и субъединичные вакцины. Получение. Преимущество. Применение. Роль адъювантов.Действующим началом этого типа препаратов являются протективные антигены бактерий, полученные путем воздействия ультразвука на бактериальные клетки. Главным преимуществом данного типа вакцин является их низкая реактогенность.Адъюванты применяются для усиления иммуногенности вакцин. В качестве адъювантов используют минеральные сорбенты (гели гидрата окиси и фосфата аммония), полимеры, и др. хим. соединения, бактерии и компоненты бактерий, липиды, вещества, вызывающие воспалительную реакцию. Они действуют на антиген и организм в целом. Действие на антиген сводится к укрупнению молекул антигена, т. е. превращению растворимых антигенов в корпускулярные, в результате чего антиген лучше захватывается иммунокомпетентными клетками. При воздействии на организм в месте инъекции адъюванты вызывают воспалительный процесс образование фиброзной капсулы, что способствует более длительному сохранению антигена в «депо» и суммации антигенных раздражений. Адъюванты так же непосредственно активируют пролиферацию В, Т и А систем иммунитета.

         

        № 69 Молекулярные вакцины. Анатоксины. Получение, очистка, титрование. Применение.Молекулярные вакцины – в них антиген находится в молекулярной форме или даже в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность т. е. в виде эпитопов, детерминант.В процессе культивирования природных патогенных микробов можно получить протективный антиген, синтезируемый этими бактериями токсин затем превращается в анатоксин, сохраняющий специфическую антигенность и иммуногенность. Анатоксины являются одним из видов молекулярных вакцин. Анатоксины – препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные своих токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Получение: токсигенные бактерии выращивают на жидких средах, фильтруют с помощью бактериальных фильтров для удаления микробных тел, к фильтрату добавляют 0,4% формалина и выдерживают в термостате при 30-40t на 4 недели до полного исчезновения токсических свойств, проверяют на стерильность, токсигенность и иммуногенность. Эти препараты называются нативными анатоксинам, в настоящее время почти не используются, т. к. содержат большое количество балластных веществ, неблагоприятно влияющих на организм. Анатоксины подвергают физической и химической очистке, адсорбируют на адъювантах. Такие препараты называются адсорбированными высокоочищенными концентрированными анатоксинами.Титрование анатоксинов в реакции фолликуляции производят по стандартной фолликулирующей антитоксической сыворотке, в которой известно количество антитоксических единиц. 1 антигенная единица анатоксина обозначается Lf, это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию фолликуляции с 1 единицей дифтерийного анатоксина.Анатоксины применяются для профилактики и реже, для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк). Так же анатоксины применяются для получения антитоксических сывороток путем гипериммунизации животных.Примеры препаратов: АКДС, АДС, адсорбированный стафилококковый анатоксин, ботулинистический анатоксин, анатоксины из экзотоксинов возбудителей газовых инфекций.

         

        № 70 Ассоциированные и комбинированные вакцинные препараты. Достоинства. Вакцинотерапия.Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов и позволяющие проводить иммунизацию против нескольких инфекций одновременно. Если в препарат входят однородные антигены, то такую ассоциированную вакцину называют поливакциной. Если же ассоциированный препарат состоит из разнородных антигенов, то его целесообразно называть комбинированной вакциной. Возможна так же комбинированная иммунизация, когда одновременно вводят несколько вакцин в различные участки тела, например, против оспы (накожно) и чумы (подкожно).Примером поливакцины можно считать живую полиомиелитную поливакцину, содержащую аттенуированные штаммы вируса полиомиелита I, II, III типов. Примером комбинированной вакцины является АКДС, куда входят инактивированная корпускулярная коклюшная вакцина, дифтерийный и столбнячный анатоксин.Комбинированные вакцины применяются в сложной противоэпидемической обстановке. В основе их действия лежит способность иммунной системы отвечать на несколько антигенов одновременно.

         

        № 71 Генно-инженерные вакцины. Принципы получения, применение.Генно-инженерные вакцины – это препараты, полученные с помощью биотехнологии, которая по сути сводится к генетической рекомбинации .Для начала получают ген, который должен быть встроен в геном реципиента. Небольшие гены могут быть получены методом химического синтеза. Для этого расшифровывается число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества, затем по этим данным узнают очерёдность нуклеотидов в гене, далее следует синтез гена химическим путем.Крупные структуры, которые довольно сложно синтезировать получаются путем выделения (клонирования), прицельного выщепления этих генетических образований с помощью рестриктаз.Полученный одним из способов целевой ген с помощью ферментов сшивается с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека и животных. Экспрессируемый ген встраивается в бактериальную или животную клетку, которая начинает синтезировать несвойственное ей ранее вещество, кодируемое экспрессируемым геном.В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используется E. coli, B. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы, некоторые штаммы способны переключаться на синтез чужеродного вещества до 50% своих синтетических возможностей – эти штамм называются суперпродуцентами. Иногда к генно-инженерным вакцинам добавляется адъювант.Примерами таких вакцин служат вакцина против гепатита В (энджерикс), сифилиса, холеры, бруцеллёза, гриппа, бешенства.Есть определённые сложности в разработке и применении:- длительное время к генно-инженерным препаратам относились настороженно.- на разработку технологии для получения вакцины затрачиваются значительные средства- при получении препаратов данным способом возникает вопрос об идентичности полученного материала природному веществу.

         

        № 72 Иммунные сыворотки. Классификация. Получение, очистка. Применение.

        Иммунные сыворотки: иммунологические препараты на основе антител.

        1.Антитоксические - сыворотки против дифтерии, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, т.е. сыво­ротки, содержащие в качестве антител антитоксины, которые нейтрализуют специфические токсины.

        2.Антибактериальные - сыворотки, содержащие агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела к воз­будителям брюшного тифа, дизентерии, чумы, коклюша.

        3.Противовирусныесыворотки (коревая, гриппоз­ная, антирабическая) содержат вируснейтрализующие, комплементсвязывающие противовирусные антитела.

        Иммунные сыворотки получают путем гипе­риммунизации животных (ло­шади) специфическим антигеном (анатоксином, бактериальными или вирусными культурами и их антигенами) с пос­ледующим, в период максимального антителообразования, выделением из крови иммунной сыворотки. Иммунные сы­воротки, полученные от животных, называют гетерогенными, так как они содержат чужерод­ные для человека сывороточные белки.

        Для получения гомологичных нечужеродных иммунных сывороток используют сы­воротки переболевших людей (коревая, оспенная сыворотки) или специ­ально иммунизированных людей-доноров (противостолбнячная, противоботулиническая), содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакци­нации или перенесенного заболевания.

        Нативные иммунные сыворотки содержат ненужные белки (альбумин), из этих сывороток выделяют и подвергают очистке специфические белки- иммуноглобулины. Методы очистки: осаждение спиртом, ацетоном на холоде, обработка ферментами.

        Иммунные сыворотки создают пассивный специфический иммунитет сразу после введения. Применяют с лечебной и профилактической целью. Для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для ле­чения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва). С лечебной целью сывороточные препараты в/м. Профилактически: в/м лицам, имевшим контакт с больным, для создания пассивного иммунитета.

         

        № 73 Антитоксические сыворотки. Получение, очистка, титро­вание. Применение. Осложнения при использовании и их преду­преждение.

        Антитоксические гетерогенные сыворотки получаются путем гипериммунизации различных животных. Они называются гетерогенными т.к. содержат чужеродные для человека сывороточные белки. Более предпочтительным является применение гомологичных антитоксических сывороток, для получения которых используется сыворотка переболевших людей (коревая, паротидная), или специально иммунизированных доноров(противостолбнячная, противоботулинистическая), сыворотка из плацентарной а так же абортивной крови, содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания.

        Для очистки и концентрирования антитоксических сывороток используют методы: осаждение спиртом или ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация.

        Активность иммунных антитоксических сывороток выражают в антитоксических единицах, т.е. тем наименьшим кол-вом антител, которое вызывает видимую или регистрируемую соответствующим способом реакцию с определённым кол-вом специфического антигена. активность антитоксической противостолбнячной сыворотки и соответствующего Igвыражается в антитоксических единицах.

        Антитоксические сыворотки применяются для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена).

        После введения антитоксических сывороток возможны осложнения в виде анафилактического шока и сывороточной болезни, поэтому пред введением препаратов ставят аллергическую пробу на чувствительность к ним пациента, а вводят их дробно, по Безредке.

         

         

        № 74 Препараты иммуноглобулинов. Получение, очистка, по­казания к применению.

        Нативные иммунные сыворотки содержат ненужные белки (альбумин), из этих сывороток выделяют и подвергают очистке специфические белки- иммуноглобулины.

        Иммуноглобулины, иммунные сыворотки подразделяют на:

        1.Антитоксические - сыворотки против дифтерии, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, т.е. сыво­ротки, содержащие в качестве антител антитоксины, которые нейтрализуют специфические токсины.

        2.Антибактериальные - сыворотки, содержащие агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела к воз­будителям брюшного тифа, дизентерии, чумы, коклюша.

        3.Противовирусныесыворотки (коревая, гриппоз­ная, антирабическая) содержат вируснейтрализующие, комплементсвязывающие противовирусные антитела.

        Методы очистки: осаждение спиртом, ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация.

        Активность иммуноглобулинов выражают в антитоксических единицах, в титрах вируснейтрализующей, гемагглютинирующей, агглютинирующей активности, т.е. тем наименьшим количеством антител, которое вызывает видимую реакцию с определенным количеством специфического антигена.

        Иммуноглобулины создают пассивный специфический иммунитет сразу после введения. Применяют с лечебной и профилактической целью. Для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для ле­чения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва). С лечебной целью сывороточные препараты в/м. Профилактически: в/м лицам, имевшим контакт с больным, для создания пассивного иммунитета.

        При необходимости экстренного создания иммунитета, для лечения развивающейся инфекции применяют иммуноглобулины, содержащие готовые антитела.

         

        № 75 Понятие об иммуномодуляторах. Принцип действия. Применение.

        Иммуномодуляторы – вещества, оказывающие влияние на функцию иммунной системы, изменяющие активность иммунной системы в сторону повешения (иммуностимуляторы) или понижения (иммунодепрессанты) её активности.

        К экзогенным иммуномодуляторам отно­сится большая группа веществ различной хи­мической природы и происхождения, оказы­вающих неспецифическое активирующее или супрессивное действие на иммунную систему, но являющихся чужеродными для организма. Антибиотики, левамизол, полисахариды, ЛПС, адъюванты.

        Эндогенные иммуномодуляторы представляют собой достаточно большую группу олигопептидов, синтезируемых самим организмом, его иммунокомпетентными клетка­ми, и способных активировать иммунную сис­тему путем усиления функции иммунокомпетентных клеток. К ним относятся регуляторные пептиды: интерлейкины, интерфероны, гормоны тимуса.

        Применение иммуномодуляторов: при первичных и вторичных иммунодефицитах различного происхождения, при онкологических болезнях, при транспланта­ции органов и тканей, при лечении иммуно­патологических и аллергических болезней, в иммунопрофилактике и лечении инфек­ционных болезней.

        Созданы препараты, обладающие иммуномодулирующим действием: интерферон, лейкоферон, виферон.

         

        № 76 Интерфероны. Природа, способы получения. Применение.

        Интерфероны— гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы. Бло­кируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии клеток иммунной системы. Различают две се­рологические группы интерферонов:Iтип — ИФН-α и ИФН -β;IIтип — ИФН-.γ ИнтерфероныIтипа оказывают противовирус­ные и противоопухолевые эффекты, в то время как интерферонIIтипа регулирует специфический иммунный ответ и неспеци­фическую резистентность.

        α- интерферон (лейкоцитарный) продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами. β-интерферон (фибробластный) продуцируется фибробластами, обработанными вирусами.

        ИФН Iтипа, связываясь со здоровыми клетками, защищает их от вирусов. Антивирусное действие ИФНIтипа может обуславливаться и тем, что он способен угне­тать клеточную пролиферацию, препятствуя синтезу аминокис­лот.

        ИФН-γ продуцируется Т-лимфоцитами и NK. Стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, моноци­тов/макрофагов и нейтрофилов. Индуцирует апоптоз активированных макрофагов, кератиноцитов, гепатоцитов, клеток костного мозга, эндотелиоцитов и подавляет апоптоз периферических моноцитов и герпес-инфицированных нейронов.

        Генно-инженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения лейкоцитарного интерферонавключает следующие этапы: 1) об­работка лейкоцитарной массы индукторами интерферона; 2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК; 3) получение суммарных комплемен­тарных ДНК с помощью обратной транскриптазы; 4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование; 5) отбор клонов, содержащих гены интерферона; 6) включение в плазмиду сильного промо­тора для успешной транскрипции гена; 7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка; 8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.

        Интерфероны применяютсядля профи­лактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется до­зой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях за­болевания, применяется местно. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных ново­образованиях.

        № 77 Иммуномодуляторы. Классификация, принципы применения. Иммунотерапия (применение препаратов иммуноглобулинов, моноклональных антител и цитокинов в лечении аллергических и аутоиммунных болезней) .

        Иммуномодуляторы- ЛС, в терапевтических дозах восстанавливающие функции иммунной системы (эффективную иммунную защиту). Следовательно, иммунологический эффект иммуномодуляторов зависит от исходного состояния иммунитета больного: они снижают повышенные и повышают сниженные показатели иммунитета.

        Иммуномодуляторами называют вещества, оказывающие влияние на иммунную систему. Их подразделяют на эндогенные и экзогенные.

        К экзогенным иммуномодуляторам относится большая группа веществ различной природы и происхождения (растительные, бактериальные, искусственно синтезируемые), оказывающих активирующее или супрессивное действие на иммунную систему.

        Эндогенные иммуномодуляторы представляют собой достаточно большую группу олигопептидов, синтезируемых самим организмом, его иммунокомпетентными и другими клетками и способных активировать иммунную систему путем усиления пролиферации и функции иммунокомпетентных клеток, т.е. обладающих иммуностимулирующим свойством. К ним относятся лимфокины, интефероны, миелопептиды, хемокины, пептиды тимуса.

        Иммуностимулирующим свойством обладают также экзогенные иммуномодуляторы, такие, как адъюванты, многие химические соединения, цитокины и интерфероны, лизаты бактерий, рибосомальные вакцины (риболизины), производные растений рода Echinoceae.

        Иммуносупрессирующее действие оказывают все цитостатики, антагонисты пуринов и аминокислот; алкилирующие агенты (циклофосфамид), ингибирующие выработку антител; кортикостероиды, которые препятствуют презентации антигена, ингибируют первичный антительный ответ, уменьшают секрецию ИЛ-1 и количество циркулирующих Т-лимфоцитов, блокаторы действия ИЛ-2 (циклоспорин), действующие на Thl-лимфоциты, препятствуя выработке ими ИЛ-2, а также антилимфоцитарная сыворотка, рентгеновские лучи и γ-излучение.

        Иммуномодуляторы широко применяют при лечении иммунодефицитов различной природы, онкологических заболеваний, иммунопатологических и аллергических болезней, профилактике и лечении инфекционных заболеваний, трансплантации органов и тканей. Для этого создан ряд препаратов, оказывающих иммуномодулирующее действие. К ним относятся препараты интерферона и его индукторов. Создан целый ряд препаратов на основе интерлейкинов, полученных в основном генно-инженерным путем. Из экзогенных иммуномодуляторов чаще всего используются препараты, полученные из микробных клеток, например препарат ИРС19, полученный из лизатов бактериальных культур пневмококка, стрептококка, клебсиелл, гемофильной палочки.

         

        Моноклональные антитела

        Как известно, антитела по своей структуре и функциям очень разнородны. Каждый В-лимфоцит синтезирует свой класс, подкласс, аллотип иммуноглобулинов. Поэтому в ответ на введение антигена в крови появляются поликлональные антитела, т.е. смесь иммуноглобулинов, синтезированных множеством клонов активированных В-лимфоцитов.

        Для получения иммуноглобулинов, синтезированных только одним В-лимфоцитом или одним полученным от него клоном, т.е. моноклонального иммуноглобулина, необходимо иммунный В-лимфоцит размножить в искусственных условиях и добиться синтеза иммуноглобулина. Однако это невозможно, так как В-лимфоциты не размножаются in vitro. Исходя из этого немецкие ученые Келлер и Мильштейн разработали метод получения моноклональных антител с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Такие клетки получили название гибридом. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный только для взятого В-лимфоцита.

        Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, размножают или в специальных аппаратах, или вводя их внутрибрюшинно мышам особой линии, выделяя их потом из асцитической жидкости.

        С лечебной целью моноклональные антитела практически не используются из-за высокого риска введения в организм генетического материала миеломных клеток. Однако они широко применяются для создания диагностических препаратов и очистки антигенов.

        cyberpedia.su

        Моноклональные антитела получение — modwear.ru

        Маркер СА125 был обнаружен посредством моноклональных антител. взятых от мыши, иммунизированной клетками линии карциномы яичников. Было найдено, что соответствующий антиген экспрессируется как правило карциномы немуцинового эпителия яичников и его определение возможно использовано для диагностики рака яичников. Маркер СА19-9 обнаруживается при гастроинтестинальной аденокарциноме. Антитела к этому маркеру были взяты при иммунизации клетками линии карциномы толстой кишки. В на-[c.397]

        Высокая специфичность моноклональных антител разрешает создать иммуноферментные диагностику мы для определения антигенов. каковые имеются в ограниченных количествах либо же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом возможно использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген нужен на стадии тестирования гибридом но при наличии высокочувствительного способа определения необходимые количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. По окончании получения гибридомы антиген возможно выделен способом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в вы-сокоочищенном состоянии в больших количествах антиген в будущем возможно использован в составе иммуноферментных диагностикумов.[c.170]

        С учетом всех изюминок животных клеток (в отличие, к примеру, от растительных и бактериальных) иногда нереально отказаться от них чтобы не было каких-то чрезвычайных затруднений, поскольку только лишь с их помош,ью возможно взять какой-то особенный продукт (веш,ество) Для примера назовем моноклональные антитела. получение трансгенных животных и т д[c.39]

        Современный уровень развития биотехнологии обусловлен неспециализированным прогрессом науки и техники, особенно — в течение последних 50 лет Достаточно отметить только такие события, как установление структуры и функций нуклеиновых кислот. обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим применением в генно-инженерных работах, создание гибридом и получение моноклональных антител. внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т д[c.9]

        Создание мышей, каковые синтезировали бы лишь человеческие антитела, — это примечательный пример трансгеноза посредством YA. Как отмечалось в гл. 10, моноклональные антитела возможно применять для лечения некоторых болезней человека. Но взять человеческие моноклональные антитела фактически нереально. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Дабы очеловечить существующие моноклональные антитела грызунов, были созданы сложные стратегии с применением рекомбинантных ДНК. В следствии этих трудоемких процедур удалось взять Fv- и Fab-фрагмен-ты, обычно владеющие каким-то сродством к специфическому антигену. Быть может, технологического прорыва удастся достигнуть, в случае если применять для получения полноразмерных человеческих антител более доступный способ с применением гибридом.[c.429]

        С целью проведения РИА гормонов, и других лекарств либо токсических веществ (возможности способа очень широкие) нужно иметь радиоактивно меченое исследуемое соединение и смесь сывороточных гамма-глобулинов. содержащих антитела к этому соединению. Совершенным случаем есть применение чистых моноклональных антител. взятых посредством гиб-рндомной методики.[c.315]

        Эффективность аффинной хроматофафии зависит в основном от выбора лиганда либо акцептора, определяющий природу вьщеляемого мембранного белка. Значительным причиной в этом случае есть сродство лиганда к рецептору, и исходя из этого самыми действенными лигандами выясняются специфические блокаторы либо антагонисты нейрорецепторных белков. Время от времени для вьщеления конкретного белка применяют две либо три ступени аффинной хроматофафии на различных сорбентах и с разньаш лигандами. Стали широко распространены способы иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лиганда употребляется поликлональные либо моноклональные антитела. полученные к компонентам рецептора.[c.268]

        Закономерен вопрос, запрещено ли избежать отмеченных выше трудностей антигенного анализа, отказавшись от классической техники получения антител в следствии иммунизации и оперируя вместо этого моноклональными антителами. взятыми посредством гибридомной техники (см. гл. 12). О чевидно, что для детального анализа антигенной структуры. к примеру белков, нужно применение солидного числа личных клонов. Дабы учесть генетические особенности иммунного ответа личных реципиентов, нужно будет производить слияние с клетками плазмацитомы лимфоидных клеток от генетически неидентичных особей, отбор которых возможно ли,шь случайным. Тем самым степень неопределенности задачи не уменьшится.[c.30]

        Разработка новых способов профилактики и лечения многих болезней человека внесла громадный вклад в рост благосостояния людей в XX в. Но данный процесс ни при каких обстоятельствах нельзя считать завершенным. Так именуемые ветхие заболевания (к примеру, туберкулез) смогут дать о себе знать снова, когда будут ослаблены профи-лактичес1сие меры либо появятся резистентные штаммы. Очень привлекательной выглядит возможность применения в качестве терапевтических средств специфических антител их возможно будет применять для нейтрализации токсинов. борьбы с бактериями. вирусами, для лечения раковых болезней. Антитело возможно уподобить самонаводящейся ракете, которая или нейтрализует нарушителя — чужеродный агент, или, если она оснащена боеголовкой. разрушает специфическую клетку -мишень. К сожалению, не обращая внимания на многообещающие возможности, антитела достаточно редко использовались для профилактики и лечения заболеваний и других патологий. И только в последнее время. с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой способов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов. интерес к применению специфических антител для лечения разных болезней снова пробудился.[c.204]

        Биологические технологии позюлили совершить прорыв в сферу иммунной диагностики. Современная иммунная диагностика (к примеру, иммунофлуоресцентный анализ и др.) характеризуется простотой, высокой специфичностью и универсальностью. Отдельные диагностикумы разрешают прогнозировать развитие патологий задолго до субъективных проявлений. Моноклональные антитела. полученные методом генной инженерии. разрешают диагностировать беременность, выявлять предрасположенность к диабету, раку, ревматоидному артриту, идентифицировать наследственные заболевания (сопроюждаюпщеся утратой определенных ферментов или других белковых компонентов).[c.181]

        С развитием гибридомной технологии снова появилась надежда на то, что антитела возможно будет применять в качестве терапевтических средств для поддержания постоянного уровня чистых моноспецифичных антител в организме. Но остаются неприятности, связанные с риском развития перекрестных реакций. приводящих к формированию иммунного ответа и анафилаксии так как в организме больного смогут вырабатываться личные антитела на детерминанты моноклональных антител мыши. Исходя из этого основная задача в настоящее время пребывает в том, дабы создать способы получения моноклональных антител человека, владеющих как специфическими иммунотерапевтическими свойствами, так и пониженной иммуногенностью.[c.211]

        При применении сыворотки крови от больных с опухолями либо моноклональных антител. взятых к опухолевым клеткам от таких больных, в большинстве случаев выявляются антигены, обширно представленные на поверхности либо чаще в как опухолевых, так и обычных клеток. Соответствующие антитела большей частью принадлежат к классу IgM и, следовательно, владеют низкой аффинностью. Аналогичные моноклональные антитела смогут быть взяты с применением иммортализованных В-клеток от здоровых индивидов. Такие антитела выявляют аутоантигены, и роль их в иммунном ответе организма на опухоль (если он существует) неясна.[c.380]

        Растения дают много биомассы, а выращивание их очень просто, исходя из этого разумно было постараться создать трансгенные растения. талантливые синтезировать коммерчески полезные белки и химикаты. В отличие от рекомбинантных бактерий. которых культивируют в громадных биореакторах (наряду с этим нужны высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование), для выращивания сельскохозяйственных культур не требуется громадных средств и квалифицированных рабочих. Основная неприятность. которая может появиться при применении растений в качестве биореакторов, будет связана с выделением продукта введенного гена из массы растительной ткани и сравнительной ценой производства нужного белка посредством трансгенных растений и микроорганизмов. Уже созданы экспериментальные установки по получению посредством растений моноклональных антител. функциональных фрагментов антител и полимера поли -Р-гидроксибутира-та, из которого возможно изготавливать материал. подверженный биодеградации.[c.412]

        Моноклональные антитела получение

        Для применения моноклональных антител в изучении белковых антигенов принципиально важно знать, с одной и той же либо различными антигенным и детерминантами (эпитопами) антигена связываются полученные антитела. Эпитопную специфичность антител определяют способом их конкурентного связывания. Антитела одного клона конъюгируют с пероксидазой (с. 317). Берут 96-луночный микропланшет для ИФА и сорбируют в лунках антиген, как в большинстве случаев (с. 320). По окончании тщательной отмывки в каждую из 12 лунок вносят по 75 мкл культуральной жидкости того же или других клонов либо раствор очищенных антител — 100 мкг/мл (рис. 42). Все остальные лунки содержат 50 мкл фосфатного буфера с 1%-ным БСА. Делают серийные разведения антител, перенося по 25 мкл раствора из каждой лунки в соседнюю (рис. 42) на 5—6 лунок. К каждой лунке додают 10 мкл меченных пероксидазой автител в концентрацию 20 мкг/мл. Инкубируют 2—4 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. По окончании тщательной[c.322]

        Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с мишенью. В случае если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат в большинстве случаев применяют для получения антител. при помощи которых после этого и выявляют данную мишень. Антитела, каковые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (в большинстве случаев кролика), связываются с различными антигенными детерминантами (эпитопами) моле-кулы-мишени. Такую смесь антител именуют поликлональным препаратом. Применение поликлональных антител имеет два недостатка, значительных для некоторых способов диагностики 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой 2) поликлональные антитела нельзя применять, в случае если нужно различить две сходные мишени, т. е. в то время, когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Но эти неприятности в полной мере разрешимы, потому, что на данный момент обучились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте. т. е. препараты моноклональных антител.[c.184]

        Моноклональные антитела получение

        Гибридома (Hybridoma) Гибридная клеточная линия, полученная при слиянии обычных антителообразующих клеток (лимфоцитов) и миеломных клеток. Владеет свойством к неограниченному росту и синтезу моноклональных антител.[c.547]

        Моноклональные антитела (Mono lonal antibodies) Однотипные антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа (антигенной детерминанты ). Синтезируются гибридомами — клеточными гибридами. взятыми при слиянии обычных антителообразующих клеток с миеломной опухолевой клеткой. способной к неограниченному росту. Кое-какие мие-[c.553]

        Линия гибридомных клеток не истинно нейрональная модельная система. но она должна быть упомянута тут, потому, что представляет собой нужный инструмент изучения в нейрохимии. Любой В-лимфоцит в большинстве случаев секретирует лишь один тип антител. Смесь солидного числа моноспецифических антител образует обычную гетерогенную антисыворотку. Для получения высокопродуктивных моноспецифических лимфоцитов, секретирующих антитела. Кёлер и Милштейн проводили слияние В-клеток иммунной мыши с опухолевыми клетками. В отличие от обычных лимфоцитов, полученные гибридные клетки растут и размножаются фактически вечно и продуцируют смесь антител против антигена, применяемого для иммунизации. Кроме того в случае если антиген есть личным белком. продуцируемые антитела являются смесь многих антител, каждое из которых направлено против одного специфичного антигенного участка исходной молекулы. Для получения моноспецифической сыворотки, т. е. раствора антител против одной антигенной области и происходящих из одного вида гибридомных клеток, эти клетки нужно отобрать и клонировать. Сейчас клон продуцирует моноклональные антитела. гомогенную популяцию антител против лишь одной детерминанты антигена. Эти моноклональные антитела возможно пспользовать для разнообразных изучений, к примеру для идентификации функциональных участков молекулы. Но что еще более принципиально важно, таковой способ может употребляться для полу-[c.371]

        Первые удачи в изучении строения иммуноглобулинов были связаны с изучением иммуноглобулинов. взятых от больных миеломой (см. 1.4). Как уже говорилось, у таких больных в следствии присутствия одного злокачественно разросшегося клона В-лимфоцитов вырабатывается огромное количество личного иммуноглобулина. который относительно леп о отделить от всех остальных. Предстоящие удачи в получении личных антител связаны с достижениями клеточной биологии. разрешившими осуществлять слияние клеток миеломы как носителей способности к неограниченному размножению с обычными В-лимфоцитами как носителями программы для выработки антител определенной, задаваемой экспериментатором специфичности. Получающиеся клетки, гибридоми сохраняют свойство к неограниченному размножению и вырабатывают личные антитела. Так как в этом случае гибридомы происходят от одной исходной слитной клетки, то они являются единый клон получающиеся из них антитела именуют исходя из этого моноклональными антителами.[c.39]

        Моноклональные антитела получение

        Одним из перспективных способов получения целевых продуктов из животных клеток есть их гибридизация. Примером может служить образование гибридом методом слияния обычных и трансформированных злокачественных клеток. Г. Мильстейн и соавторы создали способ получения моноклональных антител (мкАТ) в следствии слияния клеток селезенки и миеломы. Появившиеся гибридомы от селезенки унаследовали свойство к синтезу и секреции антител, а от миеломы — неограниченный рост и деление.[c.494]

        Очень действенным способом уточнения топографии мембранных белков. в первую очередь правильной локализации внемембранных участков, есть применение моноклональных антител. Для получения гибридом употреблялись фрагменты бактериородопсина, полученные методом его расщепления протеолитическими ферментами. Наиболее полезными в этом случае оказались синтетические фрагменты коррелируя величину синтетического пептида и эффективность связывания соответствующего антитела, возможно с высокой степенью достоверности зондировать выступающие из мембраны полипептидные петли. Ниже продемонстрирована локализация разных антигенных детерминант молекулы бaктepиopoдoпtинa в пурпурной мембране (Г. Корана, И. Г. Абдулаев).[c.609]

        modwear.ru

        Моноклональные антитела

        Моноклональные антитела - антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной клетки-предшественницы. Моноклональные антитела распознают и связывают антигены для распознавания специфических эпитопов, которые обеспечивают защиту против болезнетворных организмов.

        Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в результате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природных условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначительно различающихся антигенной специфичностью рецепторов и, естественно, аффинностью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем поликлональные антитела.

        Моноклональные антитела связывают различные белки, которые влият на активность клеток, такие как рецепторы или другие белки, представленные на поверхности нормальных и раковых клеток. Специфичность моноклональных антител позволяет им связывать раковые клетки и, взаимодействуя с цитотоксическими агентами, такими как сильная радиоактивы, разрушают раковые клетки, не повреждая здоровые.

        Раковые клетки, которые способны реплицироваться бесконечно, сливаются с клетками млекопитающих, которые продуцируют специфические антитела, что приводит к образованию гибридом, постоянно продуцирующих антитела. Эти антитела называют моноклональными, которые происходят из одного типа клеток, т.е. из клеток-гибридом. Антитела, получаемые с помощью традиционных методов, получают из клеток различного типа и называют поликлональными.

        Моноклональные антитела искусственно производят против специфических антигенов, для связи с антигенами-мишенями. Лабораторное производство моноклональных антител, основанное на получении антигенов из одной клетки, позволяет получать идентичные друг другу моноклональные антитела.

        При слиянии культур миеломных клеток с антителами клеток селезенки млекопитающих образуются гибридные клетки / гибридомы, которые производят моноклональные антитела в большом количестве. Слияние клеток приводит к образованию двух типов клеток, один тип способен расти постоянно, другой тип способен производить чистые антитела в больших количествах. Гибридные клетки производят только одно лучшее антитело, более чистое, чем поликлональные антитела, получаемые с помощью традиционных методик. Моноклональные антитела являются гораздо более эффективными методами, чем традиционные методы лечения, поскольку эти методики воздействуют не только на инородную субстанцию, но и на собственные клетки организма, что вызывает сильные побочные эффекты. Моноклональные антитела взаимодействуют только с инородными антителами / клетками-мишенями, не оказывая или оказывая минимальные побочные эффекты.

        Присутствие большого количества специфических моноклональных антител в крови говорит о присутствии в организме аномального белка. Как правило, этот белок может быть обнаружен в процессе клинического обследования и идентифицирован с помощью скринингового анализа крови, например, с помощью белкового электрофореза. Источником аномального производства моноклональных антител является популяция плазматических клеток в костном мозге.

        Получение

        Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести предварительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.

        Проблема получения моноклональных антител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммунных В-лимфоцитов с миеломной (опухолевой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопродуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток получил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неограниченном количестве вырабатывает антитела. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных клеток, обладавшие наивысшей продуктивностью и наибольшей аффинностью специфических антител.

        Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В последнем случае моноклональные антитела накапливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются гибридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартизации и используют для создания на их основе диагностических препаратов.

        Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиологических препаратов.

        

        biofile.ru

        Получение моноклональных антител

        Маркер СА125 был обнаружен посредством моноклональных антител. взятых от мыши, иммунизированной клетками линии карциномы яичников. Было найдено, что соответствующий антиген экспрессируется как правило карциномы немуцинового эпителия яичников и его определение возможно использовано для диагностики рака яичников. Маркер СА19-9 обнаруживается при гастроинтестинальной аденокарциноме. Антитела к этому маркеру были взяты при иммунизации клетками линии карциномы толстой кишки. В на-[c.397]

        Высокая специфичность моноклональных антител разрешает создать иммуноферментные диагностику мы для определения антигенов. каковые имеются в ограниченных количествах либо же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом возможно использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген нужен на стадии тестирования гибридом но при наличии высокочувствительного способа определения необходимые количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. По окончании получения гибридомы антиген возможно выделен способом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в вы-сокоочищенном состоянии в больших количествах антиген в будущем возможно использован в составе иммуноферментных диагностикумов.[c.170]

        С учетом всех изюминок животных клеток (в отличие, к примеру, от растительных и бактериальных) иногда нереально отказаться от них чтобы не было каких-то чрезвычайных затруднений, поскольку только лишь с их помош,ью возможно взять какой-то особенный продукт (веш,ество) Для примера назовем моноклональные антитела. получение трансгенных животных и т д[c.39]

        Современный уровень развития биотехнологии обусловлен неспециализированным прогрессом науки и техники, особенно — в течение последних 50 лет Достаточно отметить только такие события, как установление структуры и функций нуклеиновых кислот. обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим применением в генно-инженерных работах, создание гибридом и получение моноклональных антител. внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т д[c.9]

        Создание мышей, каковые синтезировали бы лишь человеческие антитела, — это примечательный пример трансгеноза посредством YA. Как отмечалось в гл. 10, моноклональные антитела возможно применять для лечения некоторых болезней человека. Но взять человеческие моноклональные антитела фактически нереально. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Дабы очеловечить существующие моноклональные антитела грызунов, были созданы сложные стратегии с применением рекомбинантных ДНК. В следствии этих трудоемких процедур удалось взять Fv- и Fab-фрагмен-ты, обычно владеющие каким-то сродством к специфическому антигену. Быть может, технологического прорыва удастся достигнуть, в случае если применять для получения полноразмерных человеческих антител более доступный способ с применением гибридом.[c.429]

        Получение моноклональных антител

        С целью проведения РИА гормонов, и других лекарств либо токсических веществ (возможности способа очень широкие) нужно иметь радиоактивно меченое исследуемое соединение и смесь сывороточных гамма-глобулинов. содержащих антитела к этому соединению. Совершенным случаем есть применение чистых моноклональных антител. взятых посредством гиб-рндомной методики.[c.315]

        Эффективность аффинной хроматофафии зависит в основном от выбора лиганда либо акцептора, определяющий природу вьщеляемого мембранного белка. Значительным причиной в этом случае есть сродство лиганда к рецептору, и исходя из этого самыми действенными лигандами выясняются специфические блокаторы либо антагонисты нейрорецепторных белков. Время от времени для вьщеления конкретного белка применяют две либо три ступени аффинной хроматофафии на различных сорбентах и с разньаш лигандами. Стали широко распространены способы иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лиганда употребляется поликлональные либо моноклональные антитела. полученные к компонентам рецептора.кожный покров.268]

        Закономерен вопрос, запрещено ли избежать отмеченных выше трудностей антигенного анализа, отказавшись от классической техники получения антител в следствии иммунизации и оперируя вместо этого моноклональными антителами. взятыми посредством гибридомной техники (см. гл. 12). О чевидно, что для детального анализа антигенной структуры. к примеру белков, нужно применение солидного числа личных клонов. Дабы учесть генетические особенности иммунного ответа личных реципиентов, нужно будет производить слияние с клетками плазмацитомы лимфоидных клеток от генетически неидентичных особей, отбор которых возможно ли,шь случайным. Тем самым степень неопределенности задачи не уменьшится.[c.30]

        Разработка новых способов профилактики и лечения многих болезней человека внесла громадный вклад в рост благосостояния людей в XX в. Но данный процесс ни при каких обстоятельствах нельзя считать завершенным. Так именуемые ветхие заболевания (к примеру, туберкулез) смогут дать о себе знать снова, когда будут ослаблены профи-лактичес1сие меры либо появятся резистентные штаммы. Очень привлекательной выглядит возможность применения в качестве терапевтических средств специфических антител их возможно будет применять для нейтрализации токсинов. борьбы с бактериями. вирусами, для лечения раковых болезней. Антитело возможно уподобить самонаводящейся ракете, которая или нейтрализует нарушителя — чужеродный агент, или, если она оснащена боеголовкой. разрушает специфическую клетку -мишень. К сожалению, не обращая внимания на многообещающие возможности, антитела достаточно редко использовались для профилактики и лечения заболеваний и других патологий. И только в последнее время. с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой способов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов. интерес к применению специфических антител для лечения разных болезней снова пробудился.[c.204]

        Биологические технологии позюлили совершить прорыв в сферу иммунной диагностики. Современная иммунная диагностика (к примеру, иммунофлуоресцентный анализ и др.) характеризуется простотой, высокой специфичностью и универсальностью. Отдельные диагностикумы разрешают прогнозировать развитие патологий задолго до субъективных проявлений. Моноклональные антитела. полученные методом генной инженерии. разрешают диагностировать беременность, выявлять предрасположенность к диабету, раку, ревматоидному артриту, идентифицировать наследственные заболевания (сопроюждаюпщеся утратой определенных ферментов или других белковых компонентов).[c.181]

        С развитием гибридомной технологии снова появилась надежда на то, что антитела возможно будет применять в качестве терапевтических средств для поддержания постоянного уровня чистых моноспецифичных антител в организме. Но остаются неприятности, связанные с риском развития перекрестных реакций. приводящих к формированию иммунного ответа и анафилаксии так как в организме больного смогут вырабатываться личные антитела на детерминанты моноклональных антител мыши. Исходя из этого основная задача в настоящее время пребывает в том, дабы создать способы получения моноклональных антител человека, владеющих как специфическими иммунотерапевтическими свойствами, так и пониженной иммуногенностью.[c.211]

        При применении сыворотки крови от больных с опухолями либо моноклональных антител. взятых к опухолевым клеткам от таких больных, в большинстве случаев выявляются антигены, обширно представленные на поверхности либо чаще в как опухолевых, так и обычных клеток. Соответствующие антитела большей частью принадлежат к классу IgM и, следовательно, владеют низкой аффинностью. Аналогичные моноклональные антитела смогут быть взяты с применением иммортализованных В-клеток от здоровых индивидов. Такие антитела выявляют аутоантигены, и роль их в иммунном ответе организма на опухоль (если он существует) неясна.[c.380]

        Растения дают много биомассы, а выращивание их очень просто, исходя из этого разумно было постараться создать трансгенные растения. талантливые синтезировать коммерчески полезные белки и химикаты. В отличие от рекомбинантных бактерий. которых культивируют в громадных биореакторах (наряду с этим нужны высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование), для выращивания сельскохозяйственных культур не требуется громадных средств и квалифицированных рабочих. Основная неприятность. которая может появиться при применении растений в качестве биореакторов, будет связана с выделением продукта введенного гена из массы растительной ткани и сравнительной ценой производства нужного белка посредством трансгенных растений и микроорганизмов. Уже созданы экспериментальные установки по получению посредством растений моноклональных антител. функциональных фрагментов антител и полимера поли -Р-гидроксибутира-та, из которого возможно изготавливать материал. подверженный биодеградации.[c.412]

        Получение моноклональных антител

        Для применения моноклональных антител в изучении белковых антигенов принципиально важно знать, с одной и той же либо различными антигенным и детерминантами (эпитопами) антигена связываются полученные антитела. Эпитопную специфичность антител определяют способом их конкурентного связывания. Антитела одного клона конъюгируют с пероксидазой (с. 317). Берут 96-луночный микропланшет для ИФА и сорбируют в лунках антиген, как в большинстве случаев (с. 320). По окончании тщательной отмывки в каждую из 12 лунок вносят по 75 мкл культуральной жидкости того же или других клонов либо раствор очищенных антител — 100 мкг/мл (рис. 42). Все остальные лунки содержат 50 мкл фосфатного буфера с 1%-ным БСА. Делают серийные разведения антител, перенося по 25 мкл раствора из каждой лунки в соседнюю (рис. 42) на 5—6 лунок. К каждой лунке додают 10 мкл меченных пероксидазой автител в концентрацию 20 мкг/мл. Инкубируют 2—4 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. По окончании тщательной[c.322]

        Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с мишенью. В случае если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат в большинстве случаев применяют для получения антител. при помощи которых после этого и выявляют данную мишень. Антитела, каковые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (в большинстве случаев кролика), связываются с различными антигенными детерминантами (эпитопами) моле-кулы-мишени. Такую помесь антител именуют поликлональным препаратом. Применение поликлональных антител имеет два недостатка, значительных для некоторых способов диагностики 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой 2) кожный покров антитела нельзя применять, в случае если нужно различить две сходные мишени, т. е. в то время, когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Но эти неприятности в полной мере разрешимы, потому, что на данный момент обучились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте. т. е. препараты моноклональных антител.[c.184]

        Гибридома (Hybridoma) Гибридная клеточная линия, полученная при слиянии обычных антителообразующих клеток (лимфоцитов) и миеломных клеток. Владеет свойством к неограниченному росту и синтезу моноклональных антител.[c.547]

        Моноклональные антитела (Mono lonal antibodies) Однотипные антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа (антигенной детерминанты ). Синтезируются гибридомами — клеточными гибридами. взятыми при слиянии обычных антителообразующих клеток с миеломной опухолевой клеткой. способной к неограниченному росту. Кое-какие мие-[c.553]

        Линия гибридомных клеток не истинно нейрональная модельная система. но она должна быть упомянута тут, потому, что представляет собой нужный инструмент изучения в нейрохимии. Любой В-лимфоцит в большинстве случаев секретирует лишь один тип антител. Смесь солидного числа моноспецифических антител образует обычную гетерогенную антисыворотку. Для получения высокопродуктивных моноспецифических лимфоцитов, секретирующих антитела. Кёлер и Милштейн проводили слияние В-клеток иммунной мыши с опухолевыми клетками. В отличие от обычных лимфоцитов, полученные гибридные клетки растут и размножаются фактически вечно и продуцируют смесь антител против антигена, применяемого для иммунизации. Кроме того в случае если антиген есть личным белком. продуцируемые антитела являются смесь многих антител, каждое из которых направлено против одного специфичного антигенного участка исходной молекулы. Для получения моноспецифической сыворотки, т. е. раствора антител против одной антигенной области и происходящих из одного вида гибридомных клеток, эти клетки нужно отобрать и клонировать. Сейчас клон продуцирует моноклональные антитела. гомогенную популяцию антител против лишь одной детерминанты антигена. Эти моноклональные антитела возможно пспользовать для разнообразных изучений, к примеру для идентификации функциональных участков молекулы. Но что еще более принципиально важно, таковой способ может употребляться для полу-[c.371]

        Первые удачи в изучении строения иммуноглобулинов были связаны с изучением иммуноглобулинов. взятых от больных миеломой (см. 1.4). Как уже говорилось, у таких больных в следствии присутствия одного злокачественно разросшегося клона В-лимфоцитов вырабатывается огромное количество личного иммуноглобулина. который относительно леп о отделить от всех остальных. Предстоящие удачи в получении личных антител связаны с достижениями клеточной биологии. разрешившими осуществлять слияние клеток миеломы как носителей способности к неограниченному размножению с обычными В-лимфоцитами как носителями программы для выработки антител определенной, задаваемой экспериментатором специфичности. Получающиеся клетки, гибридоми сохраняют свойство к неограниченному размножению и вырабатывают личные антитела. Так как в этом случае гибридомы происходят от одной исходной слитной клетки, то они являются единый клон получающиеся из них антитела именуют исходя из этого моноклональными антителами.[c.39]

        Получение моноклональных антител

        Одним из перспективных способов получения целевых продуктов из животных клеток есть их гибридизация. Примером может служить образование гибридом методом слияния обычных и трансформированных злокачественных клеток. Г. Мильстейн и соавторы создали способ получения моноклональных антител (мкАТ) в следствии слияния клеток селезенки и миеломы. Появившиеся гибридомы от селезенки унаследовали свойство к синтезу и секреции антител, а от миеломы — неограниченный рост и деление.[c.494]

        Очень действенным способом уточнения топографии мембранных белков. в первую очередь правильной локализации внемембранных участков, есть применение моноклональных антител. Для получения гибридом употреблялись фрагменты бактериородопсина, полученные методом его расщепления протеолитическими ферментами. Наиболее полезными в этом случае оказались синтетические фрагменты коррелируя величину синтетического пептида и эффективность связывания соответствующего антитела, возможно с высокой степенью достоверности зондировать выступающие из мембраны полипептидные петли. Ниже продемонстрирована локализация разных антигенных детерминант молекулы бaктepиopoдoпtинa в пурпурной мембране (Г. Корана, И. Г. Абдулаев).[c.609]

        tpk-eti.ru


        Смотрите также