Получение и очистка моноклональных антител (стр. 1 из 3). Моноклональные антитела очищают методами


Техника получения моноклональных антител. Иммуноферментный анализ. Продолжение. X077

 

1. Общая характеристика моноклональных антител.

Антитела – белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызывающим их образование, или с изолированной детерминантной группой этого антигена.

Разрешив ряд методических проблем, Милстейн, Говард, Батчер из Института физиологии (Кембридж) успешно осуществили слияние клеток, продуцирующих моноклональные антитела против крысиного антигена тканевой совместимости – молекулы, ответственной за генетическую индивидуальность организма и реакцию отторжения трансплантата.

Когда после слияния клеток двух различных линий образуется клон, антитела, которые он продуцирует, необязательно могут быть моноклональными в иммунологическом смысле, ибо в каждой клетке гибридного клона присутствуют хромосомы обеих родительских клеток, экспрессия которых ведет к продукции иммуноглобулинов селезеночных и миеломных клеток, но на ранних стадиях размножения гибридной клетки быстро утрачивается часть хромосом. Такая утрата хромосом имеет неслучайный характер. Исходя из этого Д. Келер и Ц. Милштейн пытались выделить клоны, которые потеряли хромосомы, принадлежащие миеломе, и поэтому экспрессировали хромосомы иммунных лимфоцитов, т.е. те которые, синтезируют только тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов (НL), реагирующих с эритроцитами барана. Такая селекция значительно бы облегчилась, если бы имелась мутантная миеломная линия, не продуцирующая иммуноглобулинов. Тогда в результате слияния получились бы только HL-гибридомы.

Отобранные клоны могут храниться в замороженном состоянии. В любое время определенную дозу такого клона можно ввести животному той же линии, от которой были получены клетки для слияния. У животного развивается опухоль, которая продуцирует моноклональные антитела заданной специфичности. Антитела обнаруживаются в сыворотке крови животного в очень высокой концентрации – 10 – 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела выделять из культуральной жидкости.

Ц. Милштейн и его сотрудники получили моноклональные антитела, направленные против антигенов малого размера, т.е. гаптенов, белков, углеводов и гликолипидов, а также против вирусов и компонентов клеточной мембраны.

В настоящее время гибридомная технология получила широкое развитие. Теперь моноклональные антитела можно определить, как химический реагент известной структуры, который можно получить по желанию, тогда как соответствующая антисыворотка является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть в точности воспроизведена после гибели исходного животного. Моноклональные антитела очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с нужным антигеном и затем в течение 6 – 12 мес. получают неограниченное количество моноспецифических антител очень высокой степени чистоты и гомогенности. В то время как для получения антител традиционными методами необходимо приблизительно 1200 л сыворотки крови человека, полученной из крови 6000 доноров. Ц. Милштейн и его коллеги выделили «специфические антитела» для группы А из культур гибридомы, оказывавшиеся столь же эффективными, как и наилучшие из имеющихся реагентов.

Абсолютной воспроизводимостью, стандартностью и наивысшей из возможных специфичностью обладает моноклональные антитела, которые секретируются одним клоном антителообразующих клеток и идентичны не только по антигенной специфичности, но и по классу и типу тяжелых и легких цепей в молекуле. Разделить клоны антителообразующих клеток, образующихся in vivo, невозможно, поэтому моноклональные антитела получают с использованием гибридомной технологии in vitro. Продуцентом является гибридная клетка (гибридома) – продукт слияния В-лимфоцита, секретирующего антитела на определенный антиген и непрерывно растущей клетки миеломы.

До недавнего времени для гибридизации использовали исключительно миеломные клетки и В-лимфоциты мышей или крыс, но продуцируемые ими моноклональные антитела имеют ограниченное терапевтическое применения, т.к. они представляют собой чужеродный белок для человеческого организма.

Освоение технологии получения гибридом на основе иммунных клеток человека связано со значительными трудностями: человеческие гибридомы растут медленно, сравнительно малостабильны, но уже получены гибридомы человека – продуценты моноклональных антител. Оказалась, что и человеческие моноклональные антитела в некоторых случаях вызывают иммунные реакции, и их клиническая эффективность зависит от правильного подбора класса антител, гибридомных линий, подходящих для данного больного.

К достоинствам человеческих моноклональных антител относится способность распознавать тонкие различия в структуре антигена, которые не распознаются моноклональные антитела мыши и крысы.

Предприняты попытки получения химерных гибридом, сочетающих мышиные миеломные клетки и человеческие В-лимфоциты; такие гибридомы находят пока лишь ограниченное практическое применение.

Наряду с преимуществами моноклональные антитела имеют недостатки, порождающие проблемы их практического использования. Они не стабильны при хранении в высушенном состоянии, в то время как в смеси обычных (поликлональных) антител всегда присутствует группа антител, устойчивая при избранных условиях хранения. Таким образом, неоднородность обычных антител дает им дополнительный резерв стабильности при изменении внешних условий, что соответствует одному из основных принципов повышения надежности систем. Моноклональные антитела нередко имеют слишком низкое сродство к антигену и чрезмерно низкую специфичность, что препятствует их применению против изменчивых антигенов, характерных для инфекционных агентов и опухолевых клеток. Необходимо также отметить высокую стоимость моноклональных антител на международном рынке.

2. Гибридомная технология.

Было предпринято множество попыток отыскать способы получения антител с узкой специфичностью. Так, при определенных условиях иммунизации бактериальными полисахаридами удается получить высокоиммуногенный препарат антител с узкой специфичностью, но большинство попыток оказались безуспешными. Высокоспецифические антитела были получены, когда антителообразующие клетки перенесли в организм летально облученных животных и из селезенки извлекали локальные зоны, содержащие очаги пролиферации одного клона иммунных лимфоцитов. Эти клоны продуцировали в сущности моноклональные антитела, но их можно было выделить в очень незначительных количествах. Данные опыты имели лишь теоретическое значение для оценки числа клонов и не давали препаративного способа получения моноклональных антител.

В 1975 г. Д. Келер и Ц. Милштейн предложили принципиально иной метод получения гомогенных антител. Они осуществляли слияние плазмацитомы с клетками селезенки иммунизированного животного, получив, таким образом, гибридомы, которые унаследовали от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки – синтезировать антитела предопределенной специфичности. Этот метод очень быстро получил широкое распространение во всем мире (Д. Келер и Ц. Милштейн в 1984 г. получили Нобелевскую премию).

Предпосылками для создания гибридомной технологии были ранее разработанные методы:

1)      получение миелом и адаптация их культивирования вне организма;

2)      соматическая гибридизация;

3)      получение селективных культуральных сред. 

Получение миелом.

У мышей получить миеломы довольно легко. Опухоли индуцируют у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика. Для возникновения миелом большое значение имеет генетический статус животного.

Но миеломная система как источник антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей, т.к. не удавалось иммунизировать животных, а затем получить мышиные миеломы, продуцирующие антитела к иммунизирующему антигену. Таким образом, миеломные белки оказались с неизвестной антигенной специфичностью и в дальнейшем были использованы как источник поддержания неограниченной пролиферации. 

Соматическая гибридизация (слияние соматических клеток).

Разработка техники гибридизации соматических клеток широко проводилась после открытия феномена спонтанной гибридизации. При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер – гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуются одно ядро с набором хромосом от всех слившихся партнеров, т.е. образуется гибридная клетка.

Первоначально метод гибридизации соматических клеток использовали для изучения механизма регуляции дифференцированных функций, а также для соматических и генетических подходов к картированию генов.

Низкую частоту образования гибридов можно было увеличить, используя ряд агентов, вызывающих слияние: вирус Сендай, мезолицитин, полиэтиленгликоль (ПЭГ). Механизмы слияния в значительной степени остаются до конца неизученными. Предполагают, что полиэтиленгликоль уменьшает заряд клеточной поверхности и сорбирует на себе воду, облегчая тем самым взаимный контакт плазматических мембран соседних клеток. 

Получение селективных культуральных сред (селекция гибридных клеток). 

Частота образующихся гибридов, даже при использовании агентов, повышающих слияние, крайне низка. Для их выделения необходимы селективные среды, позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. В настоящее время разработано несколько методов селекции гибридных клеток. Одним из наиболее распространенных является метод, основанный на применении системы: гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ).

В системе ГАТ используется антагонист фолиевой кислоты – аминоптерин. Тетрагидрофолиевая кислота является коферментом, необходимым для превращения 5–аминоимидазол-4-карбоксамида (АИКР) в рибонуклеотид формиамидоимидазол-4-карбоксамида (ФАИКР) в биосинтезе пуринов и в биосинтезе пиримидинов. Аминоптерин предотвращает образование тетрагидрофолята, ингибируя гидрофолятредуктазу, и таким образом, блокирует процессы биосинтеза, как пуринов, так и пиримидинов. В клетках существуют обходные пути биосинтеза нуклеотидов, в которых происходит реутилизация гипоксантина и тимидина. Эти пути зависят от двух ферментов: тимидинкиназы (ТК), катализирующей превращение тимидина в дезокситимидинтрифосфат, и гипоксантингаунинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ), катализирующей трансформацию гипоксантина в инозинмонофосфат и гуанина в гуанозинмонофосфат. При добавлении в среду гипоксантина и тимидина клетки могут нормально синтезировать ДНК в условиях, когда основной путь биосинтеза блокирован аминоптерином. Если клетка имеет дефект по этим ферментам, то в присутствии аминоптерина она погибает, но способна к выживанию, если ее слить с другой клеткой, у которой эти ферменты есть. Двойной, или полной селективной, системой является такая система, когда происходит слияние двух клеток, в одной из которых отсутствует ТК, в другой – ГГФРТ. В гибридах идет взаимная комплементация этих ферментов, и они выживают в среде ГАТ, тогда как родительские клетки погибают.

Для получения и отбора мутантных клеток, не имеющих ТК и ГГФРТ, используют токсические аналоги пуринов и пиримидинов, добавляемые одновременно с мутагенными агентами. Эти аналоги включаются в ДНК с помощью указанных ферментов. В присутствии токсических аналогов выживают только те клетки, где нет фермента, способного к включению этого аналога в ДНК. Так, в присутствии 8-азагуанина или 6-тиогуанина выживают только клетки без фермента ГГФРТ, а в присутствии 5-бромдезоксиуридина – клетки без фермента ТК.

Селекция гибридов основана на том, что в среде ГАТ родительские миеломные клетки погибают, а клетки селезенки не обладают способностью расти при данных условиях культивирования, поэтому выживают и размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины. Но в гибридах синтезировались не только антитела клеток иммунной селезенки, но и иммуноглобулины родительской миеломы, а также гибридные молекулы, состоящие из полипептидных цепей, как миелом, так и селезенки. Данная проблема будет преодолена путем использования миеломных клеток, в которых отсутствовала экспрессия собственных цепей иммуноглобулинов. 

3. Этапы получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела. 

  1. Селекция миеломных клеток.

Для получения гибридом: В-лимфоциты и миеломные клетки выделяют из мышей и крыс. Клетки миеломы (плазмоцитомы) – это злокачественные трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, представляющие собой клоны, образованные при делении единичных измененных опухолевых В-клеток, каждая из которых синтезирует моноклональные антитела неизвестной специфичности и обладает способностью к неограниченному размножению in vivo и in vitro.

На практике чрезвычайно сложно получить миелому с заданной антигенной специфичностью, поэтому получают гибридные клетки-продуценты моноклональных антител, наследующие от миеломного партнера только способность к неограниченному размножению.

Клетки плазмоцитомы, используемые для гибридизации, получают путем мутагенеза. Они должны иметь такие селективные маркерные признаки как устойчивость к 8-азогуанину и бромдезоксиуридину – токсичным аналогам азотистых оснований, входящих в состав ДНК. Такая устойчивость обусловлена неспособностью клетки синтезировать ферменты гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (ГГФРТ) и тимидинкиназу (ТК), которые участвуют в процессах включения пуринов и пиримидинов в синтез нуклеиновых кислот по резервному пути биосинтеза в клетках млекопитающих. ГГФРТ участвует в синтезе пуринов, а ТК – пиримидинов при наличии соответствующих предшественников (гипоксантина и тимидина).

Выделение мутантов, неспособных к синтезу ферментов, осуществляется воздействием мутагенов на клетки миеломной линии с последующим культивированием их в среде, содержащей 8-азогуанин и бромдезоксиуридин. На среде с 8-азогуанином выживают клетки, дефектные по ГГФРТ, а на среде с бромдезоксиуридином – по ТК.

При выборе миеломной линии необходимо учитывать, что в процессе культивирования клеточные линии могут терять способность к слиянию в результате перерастания, потери устойчивости к аминоптерину или заражения микоплазмой. Поэтому успех гибридизации во многом будет определяться тем, в каком состоянии находится миеломная линия, которую выбрали для слияния. 

Принципы культивирования миеломных линий: 

  1. Миеломная линия, предварительно проверенная на способность к слиянию, должна быть размножена и заморожена в достаточном количестве;
  2. После разморозки клетки можно вести в культуре не более одного месяца;
  3. Для слияния берут миеломные клетки в логарифмической фазе роста, для этого в культуру через день добавляют свежую среду; до момента слияния клетки должны находиться в этой фазе, по крайней мере, одну неделю;
  4. Концентрация клеток в культуре не должна превышать 0,5 – 1,0 млн./мл;
  5. Культуру клеток необходимо ввести в культуральную среду, к которой она адаптирована; перевод культуры в другую среду проводят постепенно;
  6. Периодически целесообразно культивировать миелому в присутствии токсического аналога нуклеотидов, использованного для селекции данной линии, чтобы избежать перерастания ревертантов;
  7. Если миеломная линия потеряла способность к слиянию, размораживают новые ампулы, хранящиеся в жидком азоте. 
  1. Иммунизация мышей антигеном.

Схемы иммунизации, применяемые разными исследователями, значительно варьируются и определяются имеющимся типом и количеством антигена. Иммунизация должна стимулировать формирование иммунного ответа и выраженное антителообразование.

Антиген вводят внутривенно, внутрибрюшно или подкожно с адъювантом (веществом, усиливающим иммуногенность антигенов) или без него в нарастающей дозе.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это осложняет отбор клонов, синтезирующих нужные антитела. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере, на ее последних этапах. Однако одним из основных достоинств гибридомной технологии является именно то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и затем использовать эти антитела для его очистки

Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться образовывать антителопродуцирующие гибридные клетки. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделить селезеночные лимфоциты животных через 3 – 4 суток после последней иммунизации, т.е. когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Способы и схемы иммунизации. 

Существует большое число способов и схем иммунизации. Схемы иммунизации зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ животного. Среди адъювантов широкое распространение получил полный адъвант Фрейда (ПАФ). Помимо этого используют введение антигена, преципитированного на квасцах вместе с антигеном убитых клеток Bordetella pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития иммунного ответа. Вместе с тем гипериммунизация может снизить способность образовывать гибридомы. Хотя иногда бывает достаточно одной иммунизации.

Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схему иммунизации:

  1. Вводят 1 – 100 мкг антигена в ПАФ (внутрибрюшинно) или без ПАФ (подкожно).
  2. Через 2 – 3 недели вводят антиген в физиологическом растворе внутрибрюшинно или внутривенно. Эту процедуру повторяют до появления высокого титра антител. (Титр антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной величиной).
  3. Последнюю иммунизацию делают внутривенно. Через 3 дня животных забивают, извлекают селезенку и готовят суспензию селезеночных лимфоцитов для гибридизации.

Когда в распоряжении экспериментатора имеется небольшое количество антигена или необходимо провести ускоренную гибридизацию, используют метод однократной иммунизации внутрь селезенки или метод иммунизации in vitro.

При однократной иммунизации внутрь селезенки используется всего 20 мкг белка или 1 млн. клеток. Этот метод рекомендуется, когда нужно быстро получить гибридомы, имея в распоряжении минимальное количество антигена.

Иммунизация in vitro имеет ряд существенных преимуществ:

а) период иммунизации занимает 4 – 5 сут;

б) требуется небольшое количество антигена;

в) повышается процент встречающихся клеток;

г) легко подбирать факторы, влияющие на эффективность иммунизации. 

  1. Получение клеток селезенки (получение В-лимфоцитов).

В гуморальном иммунитете участвует преимущественно лимфоидная ткань селезенки, обеспечивая накопление большого количества плазматических клеток, синтезирующих антитела. Через 4 дня после последней инъекции антигена мышей убивают, извлекают селезенку, измельчают ее и готовят суспензию в специальной среде для культивирования, в состав которой входят аминокислоты, витамины, углеводы и неорганические соли. Эту взвесь используют для слияния. Суспензию клеток селезенки готовят при комнатной температуре. 

4. Гибридизация (слияние) клеток миеломы и В-лимфоцитов селезенки.

Для проведения слияния используют полиэтиленгликоль (ПЭГ), который вызывает перераспределение мембранных белков, обеспечивая контакт и слияние клеток. В ПЭГ должны присутствовать ионы кальция, которые способствуют сближению клеток и образованию между ними кальциевых каналов.

Лимфоциты селезенки и клетки миеломы смешивают, осаждают центрифугированием, готовят суспензию в среде для слияния, содержащей 50 %-ный раствор ПЭГ и хлорид кальция, выдерживают 30 – 40 мин при 37 °С, а затем опять центрифугируют. Слияние проводят либо в осадке в конической пробирке, либо в монослое. 

Этапы гибридизации клеток миеломы и В-лимфоцитов селезенки:

  1. Готовят суспензию селезеночных лимфоцитов и миеломы отмывают 2 раза в среде без сыворотки с помощью метода центрифугирования.
  2. Смешивают две суспензии в одной пробирке в соотношении от 1: 1 до 1: 10 в зависимости от выбора экспериментатора.
  3. Клетки помещают в центрифужную пробирку на 50 мл и центрифугируют при комнатной температуре 3 – 5 мин при 800 – 1000 об/мин.
  4. Тщательно удаляют всю надосадочную жидкость и медленно, по каплям, в течение 1 мин добавляют раствор полиэтиленгликоля, осторожно перемешивая осадок кончиком пипетки.
  5. По истечении одной минуты очень медленно и постепенно добавляют теплую (37 °С) среду без сыворотки, доводя объем до 50 мл.
  6. Ставят пробирку в СО2-инкубатор на 1 – 2 ч.
  7. Центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.
  8. Осадок осторожно ресуспендируют в среде культивирования в необходимом объеме.
  9. Разливают суспензию слившихся клеток по 0,1 мл в 96-ти луночные планшеты и помещают в СО2-инкубатор.
  10. Постепенно заменяют среду культивирования селективной средой, добавляя по 0,1 мл среды ГАТ через каждые 3 дня.
  11. Начиная с пятых суток, ежедневно просматривают планшеты под микроскопом и отмечают в них рост колоний гибридомных клеток, записывая номера положительных лунок.
  12. Культуры подкармливают каждые 2 – 3 сут., удаляя половину культуральной жидкости, добавляя такое же количество свежей среды.
  13. Через 7 – 14 дней из лунок с растущими гибридомами отбирают супернатан и тестируют его на наличие специфичных антител подходящим методом скрининга.
  14. Клетки гибридом, синтезирующих специфические антитела, переносят в 24-х луночные планшеты, размножают, замораживают и клонируют как запасную культуру. Оставшиеся в 96-ти луночном планшете клетки продолжают еще некоторые время культивировать.

 Селекция гибридом на среде ГАТ.

Осадок клеток ресуспендируют в среде ГАТ, содержащей гипоксантин (Г), аминоптерин (А), тимидин (Т), разливают в лунки микропланшет и инкубируют при 37 °С в атмосфере диоксида углерода в течение 10 – 16 дней. Через каждые 3 – 4 дня производят замену в лунках на новую среду того же состава.

В среде ГАТ происходит отделение неслившихся миеломных клеток и лимфоцитов от гибридом, выживают на такой среде только гибридные клетки.

Аминоптерин (4-аминофолиевая кислота) блокирует основной путь биосинтеза нуклеотидов для всех клеток. Этот препарат обладает сильным цитостатическими свойствами, как аналог фолиевой кислоты он блокирует синтез пуринов, тимина и других аминокислот при этом происходит повреждение клеток, особенно быстрорастущих.

Гипоксантин и тимидин добавляют в среду в качестве предшественников пуринов и пиримидинов, использующихся для синтеза нуклеотидов по резервному пути биосинтеза с участием ТК и ГГФРТ.

Миеломные клетки погибают на среде ГАТ, т.к. из-за дефектности по ТК и ГГФРТ не способны использовать гипоксантин и тимидин для синтеза нуклеотидов.

Неслившиеся лимфоциты отмирают через несколько дней после гибридизации, т.к. они не способны к длительному выживанию in vitro.

Таким образом, на среде ГАТ должны выживать только непрерывно растущие клоны гибридных клеток. В гибридомах будут экспрессированы гены миеломных клеток и В-лимфоцитов. От миеломных партнеров наследуются способность к неограниченному росту в культуре или in vivo, а от В-лимфоцитов селезенки – способность к продукции антител известной специфичности и возможность использовать обходной путь синтеза нуклеотидов при участии ТК и ГГФРТ.

Быстро растущие клоны гибридом становятся различимы в виде плотных колоний клеток на дне лунок микропланшет. Подсчет количества клонов в лунках осуществляется с помощью инвертированного микроскопа. 

6. Определение антителообразующей способности гибридом.  

Идентификация клеток, синтезирующих антитела заданной специфичности очень важная процедура во всей гибридомной технологии. Новообразованные гибридомы могут быть нестабильными в отношении синтеза антител, поэтому методы раннего выявления отдельных антителообразующих клонов должны быть быстрыми и простыми. Наличие антител определяется в надосадочных фракциях культуральной среды в лунках микропланшет, для чего отбирают по 50 мкл среды с помощью автоматических многоканальных пипеток. Концентрацию антител определяют высокочувствительными методами радиоиммуноанализа (РИА) или иммуноферментного анализа (ИФА). 

7. Клонирование гибридом.

Обнаруженные антителообразующие клоны должны быть немедленно реклонированы, необходимость этого обусловлена тем, что после слияния во многих гибридах начинается «выброс» хромосом, продолжающийся до тех пор, пока число хромосом в клетке не будет равным приблизительно 2N. В ходе этого процесса некоторые клетки могут потерять хромосомы, несущие гены иммуноглобулинов. Существует опасность, что такие клетки, не способные больше продуцировать иммуноглобулины, будут расти лучше клонов антителообразующих клеток. В каждой лунке не всегда образуется только один гибридный клон. В этом случае возникает необходимость отделить ненужные клоны от тех, которые представляют интерес для исследования.

Гибридомы можно клонировать методом предельных разведений. Клетки отбирают из тех лунок, в которых обнаружены антитела нужной специфичности, ресуспендируют в синтетической среде обычного состава с добавлением сыворотки крови плода коровы и затем разводят этой же средой таким образом, чтобы при последующем разливе в каждую лунку микропланшета попала бы только одна клетка и формировался только один клон гибридом.

Для выращивания гибридных клонов часто применяют кондиционированные питательные среды, в которых уже культивировались макрофаги или лимфоциты, и которые выполняют в этом случае роль фидеров (клеток-кормушек). Применяют также совместное культивирование гибридом и фидерных клеток, получаемых от нормальной мыши соответствующей линии.

Через несколько дней проверяют наличие антител только в тех лунках, в которых обнаружен лишь один клон. В том случае, если в лунках образуется больше одного клона, клонирование повторяется. На этом этапе также проводят контроль антителообразующей способности клонов.

Рассмотрим подробнее некоторые методики клонирования гибридом. 

Клонирование методом предельных ( лимитирующих) разведений.

  1. За один или два дня до клонирования засевают фидерные клетки в 96-ти луночные планшеты.
  2. Отбирают клетки гибридом и подсчитывают их количество в камере Горяева.
  3. Делают десятикратное разведение в культуральной среде до концентрации в последней пробирке – 10 клеток в мл.
  4. Из последней пробирки отбирают по 0,1 мл суспензии клеток и рассевают в 96 лунок планшета.
  5. Через 5 – 7 дней под инвертированным микроскопом отмеривают лунки с растущими клонами. 

Клонирование в полужидком агаре.

  1. В чашку Петри на культуральной среде засевают фидерные клетки.
  2. Культуральную среду удаляют, заливают нижний (твердый) слой, содержащий 0,5 % агар-агара в среде культивирования, и дают ему затвердеть.
  3. Добавляют второй слой (мягкий), содержащий 0,3 % агар-агара, в который включаются клонируемые клетки. Для приготовления мягкого агарового слоя смешивают равные части среды культивирования двойной концентрации и 0,6 % агар-агара (в дистиллированной воде), помещают в водяную баню при 43 – 44 °С до употребления. Клетки в минимальном объеме вносят в мягкий агаровый слой и держат при комнатной температуре до затвердения.
  4. Чашки помещают в СО2-инкубатор и наблюдают за ростом колоний. Колонии становятся видимыми через 7 – 14 сут.
  5. Выросшие колонии извлекают пипеткой и переносят в жидкую культуральную среду для дальнейшего размножения. 

Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра.

Д. Паркс с сотрудниками (1971 г.) предложили модификацию проточного цитофлуориметра, позволяющего клонировать индивидуальные клетки. Для этого приготовляют флуоресцентные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие шарики адсорбируются на антигенспецифичных гибридомных клетках, что позволяет выделить их на этом приборе.

После выделения тем или иным способом положительных клонов их клетки размножают в достаточном количестве и образцы замораживают. Периодически необходимо проводить их реклонирование. 

8. Накопление клеток, синтезирующих моноклональные антитела.

Когда количество гибридных клеток в лунках заметно увеличиться, их переносят в планшеты с лунками больших объемов и затем в культуральные сосуды объемом 25 – 50 мл. На этом этапе можно получить достаточное количество для культивирования in vivo или в специальных биореакторах in vitro.

Гибридомы легко культивируются после их хранения в замороженном состоянии в жидком азоте при – 70 °C в среде, содержащей 20 % сыворотки крови и 10 % диметилсульфоксида. Клетки замораживают: на этапах получения, клонирования и реклонирования для последующего возобновновления в случае ее гибели вследствие контаминации. 

Замораживание гибридных клеток. 

Готовят среду для замораживания, состоящую из среды культивирования с добавками 20 % эмбриональной телячьей сыворотки и 10 % диметилсульфоксида.

  1. Клетки осаждают центрифугированием при 20 об/мин, 4 °С.
  2. К осадку добавляют необходимое количество холодной среды и разливают по ампулам для замораживания в концентрации 2 – 5*106 мл.
  3. Замораживание можно производить несколькими способами:

-          в специальном аппарате с программным обеспечением постепенного снижения температуры до – 120 °С;

-          помещают ампулы в коробку из пенопласта с толщиной стенок около 1 см; коробку закрывают крышкой и ставят на сутки в морозильник (при – 70 °С), после чего ампулы переносят в контейнеры с жидким азотом.

При отсутствии в лаборатории резервуара с жидким азотом замороженные клетки можно хранить при – 70 °С в течение года. В жидком азоте клетки хранят несколько лет. 

Размораживание клеток.

  1. Ампулы с замороженными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и быстро помещают на водяную баню при 37 °С.
  2. Растаявшую суспензию клеток переносят в центрифужные пробирки и добавляют не менее 10 мл культуральной среды так, чтобы содержание диметилсульфоксида в ней снизилось до 1 %.
  3. После центрифугирования к осадку добавляют нужное количество культуральной среды и выращивают гибридные клетки в 96- или 24-луночных планшетах.

Существует также более мягкий способ разморозки гибридом.

  1. Готовят 10 мл теплой среды для культивирования.
  2. Ампулу с клетками помещают в водяную баню при 37 °С.
  3. К размороженным клеткам добавляют 1 мл среды, встряхивают и оставляют на 4 мин.
  4. Постепенно добавляют 2, 4 и затем еще раз 4 мл среды, доведя объем среды до 10 мл.
  5. Клетки помещают во флаконы и культивируют в течение ночи при 37 °С.
  6. Сливают мертвые клетки и добавляют свежую среду. 

9. Крупномасштабное культивирование гибридом и накопление моноклональных антител.

При росте гибридом в культуральной жидкости достигается выход 10 – 100 мкг/мл чистых антител. Такие антитела можно использовать без дополнительной очистки (после концентрирования) в основном они используются в качестве первых антител для непрямой флуоресценции или иммунопреципитации.

Если требуются большие количества антител, то гибридому можно выращивать в виде трансплантируемой опухоли у мышей гистосовместимой линии. 

Культивирование гибридом in vivo. 

Для культивирования гибридом in vivo их вводят мышам или крысам внутрибрюшинно. Моноклональные антитела будут накапливаться во внутрибрюшинной асцитической жидкости в количестве 1 – 25 мг/мл. Для получения асцитов перед введением гибридных клеток (в период от трех дней до одного месяца) внутрибрюшинно инъецируют 0,5 мл пристана (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан) или неполный адъювант Фрейнда, которые повышают способность гибридом расти в брюшной полости. Асцитную жидкость можно собирать с 14-го дня после введения пристана или адъюванта.

Процесс культивирования гибридом in vivo является очень дорогим методом, т.к. животных необходимо содержать в специальных вивариях, к которым предъявляются очень строгие санитарно-гигиенические требования: в них должны быть обеспечены асептические условия, осуществляться подача стерильного воздуха, стерильной пищи, обязательным условием является наличие специальной одежды для персонала, работающего по вахтовому методу, следовательно, создание таких условий связано с большими трудностями из-за необходимости содержания большого количества животных. Ведь для производства 1 кг моноклональных антител необходимо несколько тысяч мышей или крыс. 

Размножение гибридом in vitro.

Предпочтительнее культивировать гибридомы в специальных биореакторах большого объема, где можно достичь значительно большего выхода моноклональных антител, чем от животных. При крупномасштабном культивировании стоимость моноклональных антител значительно снижается.

При росте в культуре гибридные клетки должны поддерживаться в логарифмической фазе роста в концентрации не выше 0,5 млн./мл. Клетки наращивают в культуральных флаконах увеличивающихся размеров. Ускорению роста гибридом может способствовать добавление фидерных клеток. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах). При обычных методах культивирования в супернатанах культур содержится 10 – 100 мкг/мл антител. Более высокие концентрации удается получить в ферментерах на специальных питательных средах с низким содержанием эмбриональной телячьей сыворотки и добавлением определенных препаратов (до 660 мкг/мл).

В настоящее время созданы специальные системы интенсивного культивирования гибридом в течение 1 – 2 мес. По истечении этого срока необходимо проводить повторное клонирование гибридом, поскольку могут возникать клетки, не продуцирующие антитела. 

Способы крупномасштабного культивирования гибридом и получения моноклональных антител:

1. Инкубирование в аппаратах эрлифтного типа. Суспензия клеток-антителопродуцентов постоянно перемешивается путем подачи газов: смеси диоксида углерода и воздуха, но в таких условиях возможно разрушение значительного количества клеток, поэтому для устранения данного нежелательного явления их заключают в микрокапсулы.

2. Совмещение эрлифтного типа культивирования с одновременным микрокапсулированием (в данном случае цикл культивирования составляет 1 мес., а выход антител – 59 – 250 мг/мл). Существуют следующие разновидности данного метода культивирования:

а) иммобилизация гибридом на стеклянном матриксе или в капсулах агарозы.

б) создание системы с инкапсулированными клетками-продуцентами моноклональных антител. Микрокапсулы из альгината поли-L-лизина проницаемы для метаболитов, но не для молекул антител. Через две недели культивирования капсулы отделяются от культуральной жидкости и размыкаются. Используют также микрокапсулы, состоящие из альгината, стабилизированного кальцием.

3. Создание мембранноперфузионных систем. Гибридомы помещают в пространства полых волокон, через которые проходит питательная среда. При таком способе культивирования гибридомы достаточно стабильны, а выход моноклональных антител достигается такой же, как при использовании капсул из альгината.

Для улучшения очистки и увеличения выхода моноклональных антител постоянно совершенствуется состав сред для культивирования, например, уменьшают содержание в среде сыворотки крови крупного рогатого скота или эмбриональной телячьей сыворотки, заменяя их комплексом низкомолекулярных биологически активных веществ и гормонов.

10. Концентрирование и очистка моноклональных антител.

Супернатаны культур можно использовать и без предварительной очистки в иммуноферментных и иммуногистохимических анализах.

Если моноклональные антитела, содержащиеся в асцитической жидкости, необходимо получить в чистом виде, то сначала определяют их класс и подкласс. Для идентификации класса антител применяют набор антител, специфических к отдельным классам и подклассам мышиных иммуноглобулинов, которые выпускаются многими фирмами.

Грубую иммуноглобулиновую фракцию получают высаливанием белков сульфатом аммония (45 % насыщения) с последующим диализом. Затем можно использовать различные методы аффинной или ионообменной хроматографии. Хроматографией на сефарозе с ковалентно пришитым белком А, обладающим высоким сродством к Fc-фрагменту антител, можно очистить иммуноглобулины мыши (IgG2a, IgG2b, IgG3).

По окончании процесса сорбции, иммуноглобулины десорбируют и концентрируют с применением лиофильной сушки

4. Области применения моноклональных антител.

1.Диагностика:

-          иммунологические анализы биологических жидкостей и клеток организма, микроорганизмов, вирусов и т.п.;

-          иммуногистохимическиие методы анализа;

-          иммуносцинография опухолей;

-          типирование групп крови и тканей;

2. Терапия:

-         воздействие на отдельные клеточные популяции;

-         влияние на иммунные регуляторные механизмы с помощью антител к лимфокинам;

-         иммунорегуляция с помощью антиидиотипических антител;

-         направленный транспорт лекарственных веществ;

-         элиминация токсинов, иммунотоксинов и аллергенспецифичных антител.

3. Технология:

-          идентификация молекул;

-          очистка молекул и клеток, несущих специфический антиген;

 

4. Научные разработки:

-          исследования этиологии и патогенеза различных заболеваний;

-          исследование системных и межсистемных механизмов регуляции;

-          создание новых лекарственных средств и биопрепаратов.

Рассмотрим некоторые примеры практического использования моноклональных антител:

Поскольку гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, в некоторых институтах и лабораториях для научных целей создаются так называемые гибридомные банки.

Многие фармацевтические фирмы кровно заинтересованы в увеличении масштабов производства моноклональных антител, поскольку сфера их применения помимо количественного определения различных веществ включает разнообразную диагностику (например, идентификация определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов).

Благодаря использованию моноклональных антител стало возможным определение дозы лекарственных средств. Надежность и экономичность такой иммунодозировки следует считать существенным достижением. В мае 1981 г. Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США впервые утвердило к продаже набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. Такие же наборы разрабатываются для тестирования гормонов, диагностики вирусных заболеваний, обнаружения некоторых видов рака и т.п.

Еще одним направлением применения моноклональных антител является устранение неблагоприятных последствий, вызванных передозировкой лекарственными средствами. Антитела против лекарственных препаратов, например, дигоксина, могут оказаться полезными для снятия неблагоприятных последствий, вызванных его передозировкой, хотя сегодня до конца и не ясно, нужно ли применять их экстракорпорально, связанными с твердым носителем, через который циркулирует кровь, или вводить непосредственно в кровоток.

Диагностика злокачественных новообразований и наблюдение за ними:

На сегодняшний день известно несколько специфических опухолевых маркеров, которые используются в диагностике, прогнозировании и выявлении распространения опухолей.

Некоторые из них обнаруживаются в крови, а другие находят в препаратах опухолей. Так, например, L-фетопротеин является главным белком сыворотки плода: его содержание уменьшается в течение первого года жизни. Таким образом, определяя содержание L-фетопротеина в плазме при помощи метода РИА (радиоиммунологического анализа), было обнаружено, что оно повышается у многих больных гипатомой, а также при раке семенников.

У многих больных, страдающих раком прямой кишки, в плазме отмечается повышенное содержание карциноэмбрионального антигена. Дальнейшее его увеличение может служить указанием на неэффективность химио- и лучевой терапии.

Помимо того, что моноклональные тела применяются, как специфические реагенты в стандартных тестах, они могут использоваться и для идентификации новых, более специфических маркеров опухолей.

Так, например, Ритсу и его сотрудникам удалось получить моноклональные антитела к антигену клеток при остром лимфолейкозе человека.

Развитию новых способов лечения может способствовать направленное введение лекарственных препаратов, присоединяемых к антителам против других опухолей.

Направленное введение лекарственных препаратов.

Моноклональные антитела могут найти применение для введения лекарственных веществ и токсинов в определенную часть тела (например, в опухоль): либо путем их непосредственного присоединения к таким веществам, либо путем связывания с поверхностью липосом, содержащих внутри эти вещества.

Были получены комплексы антител к поверхностным антигенам раковых клеток со многими неспецифическими противораковыми средствами, но далеко не всегда они оказывались эффективными. Наиболее многообещающим является использование сильнодействующих растительных или бактериальных токсинов, одна молекула которых может вызывать гибель клетки.

Так, например, молекула токсина дифтерии: образована двумя полипептидными цепями, связанными дисульфидными мостиками. Цепь В связывается с клеточной поверхностью, а цепь А, обладающая ферментативной активностью, проникает внутрь клетки и нарушает работу механизма биосинтеза белка. Были предприняты попытки, заменить В-цепь токсина специфическими антителами, преимущественно гомогенными. Также недавно был получен препарат моноклональных антител к антигену раковых клеток прямой кишки, ассоциированных с А-цепью токсина, который избирательно действует на эти клетки в культуре.

С помощью моноклональных антител возможно также выделение биологически активных веществ (таких, например, как белки, гормоны, токсины) из сложных смесей. В случае интерферона Сичер и Берк из Уорвикского университета (Великобритания) с помощью метода иммуноадсорбции получили препарат со степенью около чистоты 1 %.

По этому методу антитела были пришиты к углеводным гранулам и исследованы для приготовления колонки с иммуносорбентом, на которой очищали грубый препарат интерферона. После одного пассажа через такую колонку с иммобилизованными моноклональными антителами препарат очищается в 5000 раз лучше.

Можно также использовать моноклональные антитела точной идентификации специализированных клеток, таких, например, как нейтроны, чтобы глубже изучить способы их взаимодействия и функционирование (т.е. локализацию химических нейромедиаторов).

Очень ценна техника моноклональных антител и для изучения клеточных мембран. Мембранные белки трудно выделить в чистом виде. Они присутствуют в клетках в малом количестве, их биологическую активность трудно измерить или же она и вовсе исчезает при растворении мембран в аналитических экспериментах. Эти трудности можно преодолеть, если прибегнуть к иммунологическим методам изучения мембранных белков, как это было сделано в случае антигенов клеточной поверхности, являющихся маркерами разных стадий дифференцировки тканей. Обычные препараты антител против клеточных антигенов, как правило, сложные и не способные распознавать отдельные молекулы.

Кроме того, еще одной сферой применения моноклональных антител является терапия различных заболеваний, так, например, эффективность серотерапии может быть увеличена благодаря применению моноклональных антител.

Также с помощью моноклональных антител можно изготовлять высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных штаммов и паразитов.

Моноклональные антитела способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата. В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-мишени, позволяя при этом избегать серьезных побочных явлений, столь обычных при химиотерапии рака.

5. Иммунологический анализ.

Разработка Ялоу и Берсоном радиоиммунологического анализа (РИА) оказала глубочайшее влияние на многие области клинической медицины и науку вообще, так как он позволяет определять очень небольшие количества вещества путем вытеснения, меченного радиоактивным изотопом антигена из комплекса со специфическим антителом при добавлении все возрастающего количества немеченого испытуемого или стандартного антигена.

Особенно наглядно достоинства метода проявлялись в эндокринологии, т.к. «рабочая» концентрация гормонов очень невелика, а определение их при помощи биологических методов анализа – долгая, утомительная, иногда неосуществимая процедура. Анализируемые вещества бывают, нестабильны даже вне условий анализа, а при анализе их нередко приходится концентрировать; кроме того, они содержат примеси, которые могут обладать биологической активностью, сходной с таковой у изучаемого гормона.

Приведем один пример гормона, определение которого с помощью РИА открыло принципиально новые возможности: это пролактин. Применяя быстрый и относительно простой его метод его определения при помощи РИА в плазме большого числа пациентов и здоровых добровольцев, удалось установить, что повышенное содержание пролактина в плазме ассоциировано с наличием  наиболее распространенного типа опухолей последнего отдела гипофиза (пролактиномы), а нередко и с индуцируемыми пролактином галактореей и аменореей и иными нарушениями менструального цикла.

Сегодня определение содержания пролактина стало важной частью исследования бесплодия и аменореи. Так, например, приблизительно у 20 % женщин с аменореей обнаруживается повышенное содержание пролактина в плазме, причиной которого может быть опухоль гипофиза, прием лекарств, вызывающих повышение уровня пролактина и другие причины.

Моноклональные антитела уже используют в коммерческих наборах для проведения РИА, и их доступность позволила предложить альтернативные методы анализа, когда используется избыток меченых антител (например, иммунорадиометрический анализ). Это высокочувствительные методы анализа.

Также в настоящее время широко внедряется в медицинскую практику методы иммуноферментного анализа (ИФА), предназначеные для определения низких концентраций разнообразных биологически активных веществ (лекарственных препаратов, гормонов и т.п.) по их иммунохимическим свойствам. Главной их особенностью является применение в качестве метки – фермента – функционально активной биологической молекулы. Принцип метода заключается в том, что для ИФА используют комплексы иммунореагентов: антигенов (АГ) или антител (АТ) с молекулами фермента. Комплекс молекулы фермента с иммунореагентом (АГ или АТ) называется конъюгатом. При этом оба компонента конъюгата: иммунореагент и фермент – сохраняют свою функциональную активность, т.е. могут образовывать иммунные комплексы и расщеплять субстрат соответственно.

Характерными чертами ИФА являются:

1) высокая специфичность, присущая реакциям АГ – АТ, т.е. иммунореагентам;

2) высокая чувствительность, обеспечиваемая ферментом, т.к. молекулы конъюгированного фермента, как и фермента свободного, способны расщеплять множество молекул соответствующего субстрата с образованием легко обнаруживаемых продуктов.

Результаты анализа оцениваются визуально и инструментально по оптической плотности окрашенных продуктов реакции. Для измерения оптической плотности используют спектрофотометрами, или так называемыми ИФА-ридерами.

Различают два вида ИФА: гомогенный и гетерогенный.

Гомогенный ИФА или ИФА без разделения компонентов (EMIT).

С помощью данного метода анализа можно измерить ферментативную активность исследуемого образца без разделения свободных и связанных с АТ меченых АГ.

Суть гомогенного варианта ИФА состоит в ингибировании или индуцировании активности фермента в результате воздействия иммунореагентов. Каталитическая активность фермента зависит его пространственной структуры, обусловленной многочисленными нековалентными и дисульфидными связями, но нековалентные химические связи непрочны и легко разрушаются или ослабляются под влиянием различных факторов. Одним из них являются и дополнительные нековалентные взаимодействия, которые приводят к изменению пространственной структуры молекулы фермента, а, следовательно, и его каталитической активности. Если активность меченых ферментом АГ, связанных с АТ, заметно отличается от активности свободных меченых АГ, то можно измерить ферментативную активность исследуемого образца без разделения свободных и связанных с АТ меченых АГ.

Кроме ферментов при гомогенном ИФА в качестве метки могут быть использованы модуляторы – ингибиторы или индукторы ферментов, способные изменять активность индикаторного фермента. Гомогенный ИФА в основном используют для быстрого определения в биологических жидкостях низкомолекулярных АГ: токсинов, стероидных гормонов, гаптенов и лекарственных препаратов.

Итак, сущность рассматриваемого метода, применяемого для анализа низкомолекулярных антигенов, состоит в следующем. Антиген ковалентно связывают с ферментом вблизи его активного центра так, чтобы фермент, с одной стороны, сохранял свою активность, а с другой – терял ее при связывании антигена с антителом. Последнее происходит в результате блокировки активного центра объемистой молекулой антитела. Модифицированный ферментом антиген смешивают с антителом. К этой смеси добавляют определяемый антиген, который вытесняет модифицированную молекулу из комплекса с антителом. В результате появляется ферментативная активность, величина которой пропорциональна концентрации определяемого вещества.

EMIT применяется в клинической практике для быстрого определения отравлений лекарствами и наркотическими средствами. Метод пригоден для определения многих соединений: гормонов, наркотических средств, барбитуратов и др.

В случае гетерогенного или твердофазного ИФА, называемого также фермент-зависимым иммуносорбентным анализом (ELISA): иммунореагенты (АГ или АТ) фиксируются на твердой фазе. Неприсоединившиеся компоненты реакции легко удаляются при обязательной процедуре отмывания после каждого этапа анализа.

Таким образом, один из компонентов, антитело или антиген, иммобилизуют на поверхности твердого носителя, а определенное вещество (соответственно антиген или антитело) пропускают через колонку с этим носителем, который предварительно был переведен в комплекс с определенным веществом, содержащим ковалентно привязанный фермент-маркер. Определяемое вещество конкурирует с меченным и по концентрации «вымытого» фермента вычисляют количество определяемого вещества. Использование ферментов как маркеров основано на том же принципе, что и при фотоэнзографии: 1 молекула фермента производит много молекул продуктов ферментной реакции, т.е. фактически может детектировать достаточно высокие концентрации этих продуктов и обычными физико-химическими методами.

Данный метод называют анализом с разделением компонентов; он высокочувствительный, простой, широко используется в медико-биологических исследованиях, используются для массовой диагностики вирусных и инфекционных заболеваний, выявления иммунных комплексов, определения изотипов антител.

В качестве твердой фазы для проведения ИФА используют такие материалы, как полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, гели декстрана, полиакриламид, агарозы, целлюлозу, нитроцеллюлозу, нейлон и др. Твердая фаза может быть в виде пробирок, планшетов для микротитрования, шариков, пленок. В настоящее время чаще всего используются пластиковые планшеты для титрования с 96 лунками, имеющими плоское дно. Такие планшеты удобны как в работе, так и при оценке полученных результатов на ИФА-ридерах.

Большинство АГ различной химической природы (белки, нуклеиновые кислоты, пептиды, полисахариды, липополисахариды) и АТ самопроизвольно адсорбируется на поверхности пластика. Степень адсорбции зависит от физико-химических свойств молекул, от концентрации в растворе, отношения площади связывания к объему внесенного образца, времени инкубации, температуры.

Лучше всего белки адсорбируются при высоких значениях рН, поэтому обычно для посадки АГ или АТ используют 0,05 М карбонат-бикарбонатный буфер, рН 9,6. Оптимальная концентрация чистых белковых иммунореагентов для сенсибилизации составляет 1 – 10 мкг/мл, при этом в лунки вносят по 50 – 100 мкл раствора иммунореагента. Инкубируют раствор в планшете 12 – 14 ч в холодильнике при 4 °С. Адсорбировавшиеся на пластике АГ или АТ не смываются буфером, содержащем детергент, в то время как несвязавшиеся с твердой фазой молекулы фермента легко удаляются из лунок при отмывании.

Можно применять гетерогенный ИФА и при работе с корпускулярными АГ: клетками бактерий, эукариот, вирусами, хромосомами и т.п. Клетки бактерий прикрепляют на пластиковую поверхность высушиванием. Для укрепления такой связи прикрепившиеся клетки можно зафиксировать 0,1 – 0,25 % глутаровым альдегидом. При такой фиксации лишь незначительная часть эпитопов будет денатурировать.

Наиболее распространенными ферментами-маркерами, применяемыми в ИФА, являются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, а растворимыми субстратами для этих ферментов – соответственно ортофенилендиаминдигидрохлорид (ОДФ) и N, n-нитрофенилфосфат щелочной (ПНФФ).

Для выявления и количественного определения АГ и АТ применяют различные варианты гетерогенного ИФА с адсорбцией на твердой фазе АТ или АГ. Различают методы последовательного, и конкурентного анализа. На практике чаще всего применяют различные варианты последовательного гетерогенного ИФА.

Наиболее простыми вариантами ИФА, при которых образуются двухслойные иммунные комплексы, являются прямые методы. При проведении прямого ИФА лунки планшета сенсибилизируют АГ или АТ, блокируют оставшиеся свободными места на твердой фазе, после чего в лунки добавляют меченые ферментом АТ или АГ. При этом содержащий фермент иммунореагент связывается с твердой фазой лишь тогда, когда иммунореагенты взаимно комплементарны. Такой вариант ИФА используют для обнаружения АГ в образце, адсорбированном на твердой фазе, а также для контроля качества меченых ферментом АТ, например, антиглобулиновых. В последнем случае на поверхность лунок адсорбируют стандартный специфический АГ и по завершении сенсибилизации, блокировки и отмывок в лунки раститровывают анализируемый конъюгат. После инкубации и отмывания несвязавшихся компонентов в лунки вносят раствор субстрата. По завершении ферментативной реакции полученные результаты сравнивают с референс-образцом конъюгата.

Непрямой метод твердофазного ИФА был разработан в начале 70-х гг. Этот вариант ИФА проводят с использованием антивидовых конъюгатов, что позволяет решать проблемы серодиагностики самых разных заболеваний, имея ограниченный выбор антивидовых иммуноферментных конъюгатов. Кроме того, такой вариант ИФА применяют для повседневного анализа культуральной жидкости гибридом на наличие специфических моноклональных АТ, используя конъюгат, специфичный к иммуноглобулинам мыши.

Для определения в образцах АГ и иммунных комплексов широко применяется «сандвич»-вариант ИФА. «Сандвич»-вариант ИФА проводится по следующей схеме. Высокоаффинные или моноклональные АТ адсорбируют на твердую фазу и блокируют оставшуюся свободной поверхность пластика. Затем в лунки вносят исследуемый материал, положительный и отрицательный контроли. После инкубации и отмывания в лунки вносят конъюгат – меченые ферментом АТ, а также АГ. Далее вносят субстрат и следят за развитием цветной реакции. В ходе работы искомый АГ оказывается «зажатым» между молекулами АТ. Это позволило назвать данный вариант ИФА «сандвич»-вариантом. Понятно, что исследуемый в «сандвич»-варианте АГ должен обладать, как минимум, двумя сходными эпитопами.

Разновидностью «сандвич»-варианта является анализ для выявления АТ и иммунных комплексов. В этом случае ферментную метку присоединяют не к АТ, взаимодействующим с АГ, а к антиглобулиновому реагенту, который связывается с АТ, входящими в состав иммунных комплексов.

Стоит также упомянуть о варианте ИФА, основанном на ингибировании антигеном. Этот метод применяют для выявления и количественного определения АГ в растворе. Стандартный АГ адсорбируют в лунках планшета и подбирают оптимальное разведение конъюгата. Добавление даже минимальных количеств раствора АГ к конъюгату в оптимальном разведении ингибирует взаимодействие меченых АТ с адсорбированным на твердой фазе АГ. Степень ингибирования при этом прямо пропорциональна содержанию АГ в растворе, что позволяет и количественно оценить содержание АГ в растворе. Таким образом, если конъюгат в оптимальном разведении проинкубировать с последовательными разведениями образца, содержащего АГ, после чего внести эту смесь в лунки с адсорбированным АГ, то свободный АГ, связавшись с мечеными АТ, воспрепятствует связыванию этих АТ с АГ на твердой фазе. Следовательно, меньшее количество фермента, входящего в состав конъюгата, свяжется с твердой фазой, что и приведет к ослаблению ферментативной реакции на заключительном этапе анализа.

Варианты ИФА (конкурентный ИФА с адсорбированными и конкурентный ИФА с адсорбированными АТ) основаны на принципе конкуренции за место связывания. Здесь так же, как и в описанном выше случае, сначала необходимо определить оптимальные концентрации иммунореагентов, после чего исследовать тестируемый материал. Реакцию проводят, смешивая и инкубируя исследуемые образцы с меченым ферментом АТ. При наличии в образце АТ, гомологичных адсорбированным на твердой фазе АГ, эти АТ будут конкурировать с коньюгатом за присоединение к АГ. Чем выше концентрация свободных АТ в образце, тем меньше молекул фермента, входящего в состав конъюгата, присоединится к твердой фазе, и ферментативная активность пропорционально снизится.

К недостаткам метода ELISA можно отнести длительность анализа. Высокой экспрессивностью обладают гомогенные методы анализа EMIT.

Схема проведения ИФА:

  1. Первый этап любого из рассматриваемых вариантов ИФА заключается в сенсибилизации твердой фазы – лунок планшета для титрования – АГ или АТ. При постановке каждого опыта необходимо предусмотреть положительный и отрицательный контроль. Положительный контроль ставят в лунках, сенсибилизированных стандартными образцами АГ или АТ, отрицательный контроль – в лизированных стандартными образцами АГ или АТ, отрицательный – в лунках, сенсибилизированных растворами, заведомо не содержащими специфического иммунореагента. Кроме того, как правило, несколько лунок отводят для контроля субстрата и контроля конъюгата, при котором выявляют неспецифическое связывание конъюгата.
  2. Вслед за сенсибилизацией проводится блокировка свободной поверхности твердой фазы. После адсорбции иммунореагента свободные места на твердой фазе блокируют для предупреждения неспецифичного связывания на последующих этапах ИФА. Для блокировки используют различные белки (чаще всего 1 % раствор бычьего сывороточного альбумина).
  3. При выполнении прямого варианта ИФА после сенсибилизации и блокировки в систему вносят меченый ферментом иммунореагент – конъюгат. Условиия и время инкубации устанавливаются эмперически.
  4. После инкубации и отмывки в лунки планшета вносят специфический для используемого фермента субстрат и по достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают и измеряют оптическую плотность растворов на ИФА-ридере при соответствующей длине волны.

Таким образом, чаще всего ИФА используют для определения мест локализации антигенов в гистохимических анализах и их концентраций в биологических жидкостях.

Количественные методы ИФА развиваются с начала 70-х гг. и в настоящее время их используют для определения иммуноглобулинов, гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, лекарственных препаратов, антител к различным антигенам. Методы характеризуются чрезвычайно высокой чувствительностью и абсолютной селективностью, что делает их незаменимыми в ранней диагностике и контроле заболеваний.

Что дает медицине применение этих методов? Количество иммуноглобулинов в сыворотке крови человека служит показателем иммунного статуса организма и важным диагностическим признаком при некоторых заболеваниях. Выявление изменений концентрации гормонов – существенная проблема современной эндокринологии. Такой анализ необходим для диагностики и контроля за эффективностью терапии ряда заболеваний. ИФА используют также для определения поверхностного антигена гепатита В и раково-эмбрионального антигена. Появилась возможность обнаруживать на ранних стадиях заболевание печени или злокачественные образования и своевременно применять методы терапии.

Благодаря ИФА стало легче выявлять антитела к различным антигенам в сыворотке крови пациентов. Метод широко используют в диагностике по данным анализа крови, ибо увеличение содержания в организме антител к какому-либо вирусному или бактериальному антигену позволяет на ранних стадиях распознавать природу заболевания. Обычно применяют модификацию ИФА. Предполагаемый антиген связывают с нерастворимым носителем и соединяют с сывороткой крови. Если в ней есть антитела, то они свяжутся с антигеном, на носителе. Затем такой носитель обрабатывают раствором, содержащим меченные ферментом антитела какого-либо животного. Они связываются с попавшими из крови пациента антителами на носителе, в результате чего появляется детектируемая ферментная активность носителя. Такой метод разработан для диагностики бруцеллеза, сифилиса, гельминтоза и т.п.

Для проведения подобных анализов созданы автоматизированные системы, позволяющие исследовать до 1000 сывороток в день. Перспективность ИФА, а также других аналитических методов с использованием ферментов совершенно очевидна. Она обусловлена их уникально высокими чувствительностью и селективностью, простотой оборудования и возможностью автоматизации. Однако лишь немногие из них широко внедрены в практику. Причина этого – в инерции промышленности, производящей оборудование и наборы реактивов.

Задание 2. Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1. Идентификация антигенов с помощью высокоспецифичных моноклональных антител.

Целью данной лабораторной работы является выявление наличия определяемого антигена с помощью высокоспецифичных моноклональных антител.

Принцип метода. Основой метода является строго специфичное взаимодействие антиген-антитело, приводящее к образованию стабильного комплекса, где антигеном является определяемое соединение. Для регистрации образовавшегося комплекса используют другие антитела ковалентно связанные с ферментом, активность которого легко определить. Схематическая последовательность взаимодействий при иммуноферментном анализе:

  1. антиген сорбируется на твердой фазе;
  2. первичные (моноклональные) антитела образуют комплекс с антигеном;
  3. вторичные антитела, конъюгированные с ферментом, связываются с первичными антителами, которые являются антигеном для вторичных антител.

После отмывки несвязавшихся антител происходит определение активности конъюгированного фермента, исходя из которой судят о наличии антигена.

Наиболее широко в качестве индикаторного фермента используют пероксидазу, которая сохраняет свою активность в конъюгированном состоянии и легко определяется. В качестве субстрата для этого фермента могут быть использованы различные соединения, которые окисляются при разложении перекиси водорода пероксидазой и переходят в окрашенную форму. Схема реакции:

пероксидаза

Н2О2 = Н2О + 0,5 О2,

0,5 О2 + КН2 = К + Н2О,

К и КН2 – окисленная и восстановленная форма субстрата соответственно. В данной работе в качестве субстрата используется кверцетин.

Практическая значимость работы. Метод иммуноферментного анализа используется для определения или обнаружения различных биологически активных соединений (гормоны, антибиотики, токсины, клофелин и др.), диагностики целого ряда заболеваний (СПИД, вирусный гепатит), а также в экспериментальной биохимии.

Техника выполнения работы. В ячейку иммунологической планшеты, где предварительно был адсорбирован исследуемый антиген, вносится 0,1 мл раствора первичных моноклональных антител. После 10-минутной он выливается и в ячейку наливают 0,1 мл раствора вторичных антител, конъюгированных с индикаторным ферментом и также инкубируют 10 минут.

Затем этот раствор также удаляется и в ячейку последовательно вносится 0,02 мл буферного раствора, 0,06 мл раствора кверцетина (субстрата для фермента) и 0,02 мл раствора перекиси водорода.

Для буферного раствора, моноклональных и вторичных антител используется одна пипетка, а для перекиси водорода и раствора кверцетина – другая.

В ячейках, где находился антиген, происходит потемнение раствора.

Вариант 2. Определение титра антител в антисыворотке крови кролика, иммунизированного протеиназой (инсулиназой).

Целью работы является исследование особенностей реакции антиген-антитело, представляющей собой специфическое взаимодействие антигена с антителом. Продуктами данной реакции являются комплексы антиген-антитело (иммунные агрегаты), которые могут образовывать преципитаты.

Принцип метода. Протекающая на молекулярном уровне реакция взаимодействия антител с антигеном доступна для наблюдения невооруженным глазом. Для решения данной задачи готовят оптимальную смесь антител и антигенов в растворе, в которой в результате протекания иммунохимических реакций практически каждый из антигенов оказывается связанным с двумя или несколькими молекулами антител, а каждое из антител, в свою очередь, свяжется с двумя антигенами. Образуется пространственная сетка из чередующихся молекул антигенов и антител, легко выпадающих в осадок (это так называемая зона эквивалентности). При избытке антигена в растворе по отношению к антителам на долю каждого антитела достанется по два отдельных антигена, и сетка не образуется. И наоборот, если в большом избытке будут антитела, то образование пространственной сетки не происходит из-за нехватки связывающих антигенов.

Простейшим методом обнаружения в сыворотке крови иммунизированного животного специфичных антител может служить «кольцевой тест». Предельное разбавление антисыворотки, при котором еще наблюдается кольцо преципитации, характеризует содержание специфических антител в сыворотке, это разбавление называют титром антител.

Практическая значимость работы. Реакции антиген – антитело, происходящие in vivo, - это важнейший защитный механизм устранения множества антигенов, с которыми сталкивается организм. Кроме того, реакции антиген – антитело могут приводить к иммунопатологическим состояниям.

Реакции антиген – антитело in vivo имеют большое диагностическое значение, так как благодаря своей специфичности они позволяют количественно и качественно определить антигены или антитела. Этот тест дает возможность судить о количественном содержании протеиназы, отвечающей за специфическую деградацию инсулина – гормона, являющегося одним из основных регуляторов обмена веществ в клетках и тканях человека.

Техника выполнения работы.

  1. Выделение из цитозоля гепатоцитов протеиназы, деградирующей инсулин (получение антигена).
  2. Иммунизация кроликов протеиназой для получения специфической антисыворотки к антигену.
  3. Определение титра антител в антисыворотке кролика.

Делают серию разведений исходной антисыворотки в геометрической прогрессии (1: 2, 1: 4, 1: 8, 1: 16 и т.п.). В пробирку диаметром 3 –4 мм наливают по 0,5 мл соответствующих разведений антисыворотки. Туда же можно добавить несколько кристалликов сахарозы, для того, чтобы увеличить плотность раствора. Затем, наклонив пробирку, на раствор антител осторожно наслаиваем 0,5 мл раствора антигена (в каждую пробирку из приготовленных разведений). Установив пробирки в штатив, наблюдают на темном фоне образование белых колец преципитата. Обычно кольца преципитатов образуются в пределах 20 минут. За титр принимают то разведение, при котором еще заметно образование иммунных агрегатов.

Литература:

  1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. В.П. Комов, В.Н. Шведова, Н.В. Кириллова, О.М. Спасенкова, В.И. Фирсова, Л.А. Троицкая. – СПб.: СПХФА. – 1998.
  2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.
  3. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.
  4. Иммунологические методы/ Под ред. Х. Фримеля. – М.: Мир. – 1979.
  5. Коротяев А.И., Бабичесв С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – СПб.: Специальная литература. – 1998.
  6. Лекционный материал по биотехнологии.
  7. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.
  8. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

 Темы рефератов.

  1. Биотехнологическое производство сывороток.
  2. Особенности получения бактериальных анатоксинов.
  3. Возможности получения вакцин с помощью методов биотехнологии.
  4. Методы анализа, основанные на применении моноклональных антител.
  5. Перспективы применения моноклональных антител в медицинской диагностике.
  6. Возможности применения моноклональных антител в области терапии.
  7. Моноклональные антитела как специфические сорбенты при выделении и очистке биотехнологических продуктов.

onlinehelpstud.ru

Получение и очистка моноклональных антител

Получение и очистка моноклональных антител

Введение

В 1975 г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомной технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены. В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линией миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы invitroза несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена. Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах.

Последние достижения в этой области включают получение антиидиотипических антител и моноклональных антител овцы межвидовым слиянием клеток. Кроме того, получены моноклональные антитела человека как из гибридом, образованных с помощью внутри- или межвидового слияния клеток, так и из культуры В-лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна – Барра. Другими большими достижениями, важными для практики, являются получение биспецифических антител из гибридных гибридом и создание химерных антител с помощью трансфекции генов иммуноглобулинов в миеломные клетки.

1. Получение антител

Наиболее важные области применения моноклональных антител перечислены в табл. 1.

Таблица 1. Основные области применения антител

Традиционный метод получения больших количеств моноклональных антител включает введение мышам или крысам гибридомных клеток выбранного клона с последующим развитием опухолевых асцитов и отбором асцитной жидкости. От одной мыши можно получить до 50 мг антител. Однако при получении очень больших количеств антител использование животных уже нецелесообразно, поскольку для получения 1 кг очищенного продукта потребуется 20 000 мышей. Следовательно, необходимо развивать промышленную технологию получения моноклональных антител invitro.

1.1 Методы получения моноклональных антител invitro

Методы выращивания гибридом invitroимеют ряд преимуществ по сравнению с методами получения антител invivo:

1)в них не используются животные;

2)они дают очень малые количества примесных антител;

3)размеры сосудов для культивирования можно легко увеличивать без особых затрат на масштабирование; в первую очередь это относится к трудозатратам и расходам на капитальное строительство;

4)за счет оптимизации процесса достигается высокая воспроизводимость;

5)уменьшается риск загрязнения целевого продукта различными веществами из животных-хозяев;

6)в организмах грызунов трудно культивировать клетки человеческих гибридом и лимфобластоиды, трансформированные ВЭБ.

Существуют два подхода к культивированию животных клеток. Первый подход основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. В качестве примера можно привести перфузию в пористые волокна, применение микрокапсул, агарозных микрошариков или керамических кассет. Второй подход включает культивирование клеток в гомогенной суспензии.

Выбор одного из этих двух методов получения моноклональных антител в основном определяется требованиями производственного процесса. Система получения моноклональных антител должна быть

1)сравнительно простой и легкой в управлении;

2)воспроизводимой для обеспечения высокого качества продуктов;

3)легко стерилизуемой и способной работать асептически в течение длительного периода времени;

4)просто и эффективно масштабируемой.

1.1.1 Культивирование в гомогенной суспензии

Фирма Celltech для получения моноклональных антител использует культивирование в гомогенной суспензии. Преимущества этого метода включают все упомянутые факторы. Кроме того, при проведении процесса в суспензии за счет перемешивания достигается высокая гомогенность культуры. Эффективное перемешивание очень важно, так как при культивировании необходимо равномерное распределение клеток по всему объему сосуда. При этих условиях результаты измерений рН или концентрации растворенного кислорода в одной определенной точке сосуда будут отражать состояние всей культуры клеток, в результате чего осуществляется простой и надежный контроль этих параметров. Хорошее перемешивание обеспечивает быстрое и равномерное распределение любого добавленного компонента во всем объеме. Кроме того, от эффективности перемешивания зависят параметры массопереноса в ферментере, особенно переноса кислорода. При атмосферном давлении содержание кислорода в воде, насыщенной атмосферным воздухом, составляет примерно 7 мг/л. Один миллион гибридомных клеток потребляет такое количество кислорода за один час. Таким образом, эффективное снабжение культуры клеток кислородом является очень важным фактором; в противном случае рост клеток будет лимитироваться кислородом.

1.1.2 Масштабирование процесса

Культивирование в гомогенной суспензии имеет неоспоримые преимущества, когда возникает проблема масштабирования процесса. Увеличение размера ферментера в десять раз требует увеличения капитальных затрат всего в два-три раза, а трудозатраты будут несравненно меньшими по сравнению с трудозатратами на одновременное культивирование в нескольких ферментерах меньшего размера. Гомогенность системы обеспечивает стабильность параметров. перемешивания и массопереноса, что в свою очередь облегчает их расчет для сосудов различной формы. Более того, такая система дает наилучшие ВРЗ-можности для непосредственного наблюдения за параметрами процесса и их регулирования.

Традиционно в микробиологических процессах используют емкостные ферментеры с механическим перемешиванием. Подобные ферментеры объемом до 8000 л применяют для получения вируса ящура и интерферона. В то же время фирма Celltech для выращивания гибридомных клеток использует ферментеры эрлифтного типа с активной подачей воздуха.

1.1.3 Эрлифтные ферментеры

Применение эрлифтных ферментеров для получения антител впервые описано Катингером и др., которые решили, что такие ферментеры целесообразно использовать для культивирования клеток с высокой чувствительностью к механическим повреждениям. Принцип работы эрлифтного ферментера представлен на рис. 1. Его подробное описание можно найти в обзоре. Реактор изготовляют из стекла для работ лабораторного масштаба и из нержавеющей стали при промышленном культивировании. Газовую смесь подают из кольцевого барботера в основание тяговой трубы, расположенной соосно внутри ферментера. Газ, поднимаясь вверх по трубе, поступает к клеткам культуры и удерживается на ее поверхности. При подъеме газа по трубе создается разность плотностей между содержимым трубы и остальным объемом ферментера, в результате чего обеспечивается циркуляция культуры в ферментере. Вспенивание, которое может возникнуть при необходимой для роста клеток скорости подачи кислорода, обычно легко подавляется обычными антивспенивающими агентами.

1.1.4 Регулирование условий культивирования

Рост гибридомных клеток и синтез антител ими зависят от физико-химических характеристик микроокружения клеток. При этом особое внимание уделяется регулированию рН, концентрации растворенного кислорода, температуры и содержания питательных веществ. Адекватность процессов контроля и регулирования легче всего достигается в гомогенной системе. В свою очередь для этого необходимо эффективное перемешивание, обеспечивающее соответствующие характеристики тепло- и массопереноса в ферментере.

В эрлифтных ферментерах фирмы Celltech концентрация растворенного кислорода регулируется автоматически изменением скорости подачи воздуха в ферментер. Необходимый рН среды обеспечивается или введением в поток газа диоксида углерода, или добавлением гидроксида натрия в культуральную жидкость. Температура в ферментере поддерживается с помощью воды, циркулирующей в термостатирующей рубашке ферментера. При необходимости вода нагревается или охлаждается в теплообменнике.

1.1.5 Контроль роста клеток

Контроль за ростом клеток осуществляется путем асептического отбора проб из ферментера с последующим подсчетом клеток иа гемоцитометре. Для дискриминации живых и мертвых клеток используют краситель трипановый голубой. Косвенное слежение за ростом клеток может осуществляться также путем измерения скорости потребления кислорода. Возможность прямого подсчета общего количества и количества жизнеспособных клеток в ферментере является несомненным преимуществом по сравнению с негомогенными системами культивирования. Концентрацию антител в культуральной жидкости определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или с помощью ELISA.

1.1.6 Использование микропроцессоров

На неавтоматизированных предприятиях большую часть затрат на производство моноклональных антител составляют расходы на оплату труда. Поэтому ручной труд целесообразно автоматизировать. В нашем случае всем процессом можно управлять с помощью компьютера, который обеспечивает автоматическое включение и выключение необходимых клапанов и насосов на всех этапах процесса, в том числе на стадиях очистки, стерилизации, проведения основного процесса, сбора клеток и выделения антител. В этом случае функции оператора ограничиваются только приготовлением питательной среды и общим наблюдением за ходом процесса. Однако осуществление высокой степени автоматизации невозможно без активного компьютерного самоконтроля, а также без проверки правильности выполнения всех технологических стадий. Кроме того, компьютер должен сигнализировать об авариях и принимать необходимые меры в случае отказа той или иной основной или вспомогательной системы.

mirznanii.com

Моноклональные антитела очистка - Справочник химика 21

    В разделе изложены методы иммунизации животных и гибридизации клеток для получения поликлональных и моноклональных антител, методы получения препаративных количеств антител и их очистки, способы введения ферментных меток в антитела и антигены для использования в иммуноферментном анализе, способы введения радио-изотопных меток в антитела для радиоиммунного анализа, методы изучения антигенных свойств ферментов [c.307]     Очистка моноклональных антител [c.315]

    Для очистки больших количеств моноклональных антител из асцитных жидкостей применяют хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.316]

    В клетке можно пометить любые молекулы для этого е них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. [c.228]

    ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ [c.37]

    Получ ни и очистка моноклональных антител [c.43]

    В заключение отметим, что получение и очистка моноклональных антител требуют новых как научных, так и инженерных разработок, чтобы можно было проектировать процессы, обеспечивающие как быстрый рост продуцирующих клеток (т.е. гибридом), так и высокое качество конечного продукта. Создание таких процессов позволит получать большие количества моноклональных антител (до 100 г в одном периодическом процессе) с очень высокой степенью чистоты. Ясно, что такие процессы являются идеальными для получения новых моноклональных антител, которые могут быть применены в иммуноанализе. [c.50]

    IV. Антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и крысы. Для общих целей анти-IgG, получают путем иммунизации животных фракцией IgG, полученной в результате аффинной очистки на колонке с протеинА-сефарозой (разд. 10.6.1). Для удаления антител к другим классам иммуноглобулинов сыворотки сорбируют моноклональными антителами или сывороткой, лишенной IgG. [c.104]

    Проблема получения специфических антител при отсутствии чистого антигена была решена с разработкой технологии получения моноклональных антител (МКА) [9], позволяющей выделять антитела к индивидуальным компонентам любой сложной смеси антигенов [10]. Очень скоро МКА были использованы в аффинной хроматографии — вначале для очистки антигенов клеточной поверхности [И, 12], а затем для выделения множества других белков [13, 14]. [c.165]

    Потенциальная контаминация названных выше продуктов возможна из рааллчных источников от лиц, чьи клетки используются в биотехнологических процессах, от миеломных клеток, применяемых для получения гибридов, из питательных сред для культивирования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для очистки белковых продуктов, например, моноклональные антитела, наконец, несоблюдение требований GMP [c.256]

    Применение моноклональных антител. Практическое использование МкАТ исключительно многообразное — в медицине И ветеринарии (в целях диагностики, терапии), в биотехнологии для получения, выделения и очистки специфических продуктов, в исследованиях фундаментальных и прикладных проблем. Так, например, стволовые клетки костного мозга не обладают какими- [c.579]

    Область возможного применения моноклональных антител весьма обширна. Их используют в диагностике, например для быстрого и точного типирования тканей и органов, предназначенных для пересадки. Они находят применение при очистке белков и других биологических соединений методом иммуноад- [c.313]

    Примером использования моноклональных антител для очистки и крупномасштабного производства важных для медицины веществ может быть работа Секера и Берке (Se her, Burke,. [c.334]

    Клонирование фрагментов генома, содержащих ОРС, в экспрессирующих векторах позволяет нарабатывать для иммунизации большие количества чистого белка. Это делает получение моноклональных антител к белкам, кодируемым последовательностями ОРС, стратегически простой, хотя и в некоторой степени трудоемкой задачей. Основные требования при подобной работе— наличие хорошей культуры клеток и использование высокочувствительного метода анализа, позволяющего отличать антитела к продуктам ОРС от антител, узнающих векторные фрагменты гибридного белка. Отлаживание такого метода— основное узкое место рассматриваемого подхода. После получения специфических моноклональных антител к продукту, кодируемому встроенным фрагментом, их можно использовать для выявления, количественного анализа и очистки белкового продукта ОРС. [c.180]

    При обычных методах культивирования концентрация антител в культуральной жидкости лежит в пределах 10—100 мкг/мл. Более высокие концентрации удается получить в ферментерах при использовании сред с низким содержанием СПК и добавлением определенных препаратов [препараты приматон КГ и плу-роник Р-68 (5. Кеиуепу е а1., 1986)] —до 660 мкг/мл. Важным направлением исследований является подбор бессывороточных сред, применение которых значительно облегчает последующие этапы очистки моноклональных антител. [c.117]

    Применение моноклональных антител для иммуноанализа пептидов требует большой осторожности, поскольку высокоспецифичные моноклональные антитела могут взаимодействовать, например, только с одним из изогормонов. По этим же причинам нельзя использовать слишком специфичные моноклональные антитела и для аффинной очистки пептидов. Кроме того, существует опасность разрушения образца при его элюировании с аффинной колонки под действием pH и ионной с ы раствора. И наконец, следовые количества антител могут загрязнять очищенный продукт и влиять на результаты анализа. [c.35]

    Использование мшроироцессоров. На неавтоматизированных предприятиях большую часть затрат на производство моноклональных антител составляют расходы на оплату труда. Поэтому ручной труд целесообразно автоматизировать. В нашем случае всем процессом можно управлять с помощью компьютера, который обеспечивает автоматическое включение и выключение необходимых клапанов и насосов на всех этапах процесса, в том числе на стадиях очистки, стерилизации, проведения основного процесса, сбора клеток и выделешш антител. В этом случае функции оператора ограничиваются только приготовлением питательной среды и общим наблюдением за ходом процесса. Однако осуществление высокой степени автоматизации невозможно без активного компьютерного самоконтроля, а также без проверки правильности выполнения всех технологических стадий. Кроме того, компьютер должен сигнализировать об авариях и принимать необходимые меры в случае отказа той или иной основной или вспомогательной системы. [c.41]

    СО свойствами гибридомных клеток. Рассмотрим характерные особенности ферментеров и процесса, применяемых для получения и очистки моноклональных антител на фирме ellte h. [c.45]

    Выделенне антител. По завершении ферментации получают раствор, содержащий активные растворенные моноклональные антитела, отработанную питательную среду, цельные клетки и большое количество продуктов их деградации. При очистке антител сначала удаляют твердые примеси. Для этой, цели культуральную жидкость или фильтруют (до 100 л в одной операции), или, чаще, подвергают непрерывному проточному центрифугированию. Эффективность последнего процесса может быть существенно повышена за счет использования агентов, ускоряющих флокуляцию клеток и их фрагментов. В этом отношении наиболее эффективной оказалась полигалактуроновая кислота [37 ]. [c.46]

    В зависимости от области применения антител и от их свойств можно использовать самые различные способы очистки. Для диагностических целей часто достаточно имет препараты антител 70-95%-ной степени чистоты. С другой стороны, при применении антител in vivo их чистота должна быть намного выше. В сывороточных средах содержание антител не превышает 10% от общего количества белка. Хотя проведение процесса на бессывороточных средах и облегчает очистку, на практике относительно легко достичь 90%-ной и даже более высокой степени чистоты независимо от содержания сывороточных белков. При очистке антител для их использования ш vivo на последних стадиях очистки приходится решать одни и те же проблемы независимо от природ и питательной среды. Высокоэффективные методы очистки необходимы для удаления следовых количеств не только примесных белков, но и пирогенов и ДНК. Ранее для очистки антител широко применяли фракционирование сульфатом аммония с послед)пющей ионообменной хроматографией. Применение этих методов осложняется тем, что различные моноклональные антитела имеют разные изо-электрические точки [34, 36 J. Кроме того, после ионообменной хроматографии чистота антител не превышает 90%, поэтому для дальнейшей очистки необходимы другие методы, например гель-фильтрация. Однако в тех случаях, когда моноклональные антитела использ)пют для диагностики или иммуноаффинной очистки, ионообменная хроматография или ее сочетание с предварительным осаждением позволяют получить препараты достаточного качества. [c.47]

    Использование микрокомпьютерной системы управления позволяет совершенствовать метод аффинной хроматохрафии. Свойства аффинных колонок после каждого цикла меняются, как бы точно ни выполнялись условия очистки. Поэтому система управления, основанная на регистрации времени или объема, не может реагировать на такие изменения. Высокая стоимость аффинных колонок, особенно белка А, а также ценность получаемых моноклональных антител требуют включения в систему управления приборов, реагир)пющйх на любые отклонения и неполадки. Например, применение датчиков на воздух позволяет предотвратить высушивание колонки при прекращении подачи раствора, а использование клапанов давления перед входными фильтрами предотвращает разрушение системы, если колонка забьется. [c.49]

    Для дальнейшего совершенствования процесюв получения и очистки моноклональных антител необходимо провести исследования в нескольких направлениях. Используемые в настоящее время процессы ферментации очень эффективны. Однако более глубокое понимание физиологии гибридом и линий клеток человека должно позволить увеличить выход продукта. Например, очень перспективным представляется улучшение линий клеток путем повторного [c.49]

    Выше обращали внимание на необходимость тщательной проверки чистоты препаратов клеточных рецепторов, выявление в изучаемом препарате примеси клеточных ферментов. Так, нанрп-мер, было установлено присутствие в препаратах рецептора гормона роста фермента — фосфотидилннозиткиназы. Последняя выделяется вместе с рецептором даже при иснользовании для его очистки методов аффинной хроматографии на иммобилизованном гормоне или иммобилизованных моноклональных антителах против рецептора (D. М. Thompson et al., 1985). Несмотря на эти факты, существуют веские основания утверждать, что у рецептора гормона роста имеется собственная ферментативная активность, в том числе эндонуклеазная. Об этом свидетельствуют следующие наблюдения. [c.31]

    Большое разнообразие макромолекул, изучаемых с помощью антител, включает не только естественные продукты животных н растений, но, и продукты микробного происхождения, и синтетические вещества. Приготовление поликлональной антисыворотки к определенным молекулам может включать предварительную очистку, если нельзя получить очищенный коммерческий препарат. Для компонентов клеточной поверхности современный подход — это получение моноклональных антител требуемой специфичности при этом решается проблема очистки иммуногена (см. гл. 3). С другой стороны, с помощью уже существующих антител можно очистить компоненты клеточной поверхности, а также проводить обогащение клеток, экспрессирующих антиген-мишень. Эти подходы обсуждены в гл. 5. Метод экстракции имеет большое значение в тех случаях, когда необходимо получить полиспецифическую антисыворотку к смеси иммуногенов, например экстрагированных клеточных мембран, гомогенатов тканей, разрушенных ультразвуком бактерий, вирусов и паразитов. Невозможно в этой главе привести детальное руководство по экстракции и очистке огромного разнообразия иммуногенов. Существует специальная литература, посвященная методам получения углеводных, бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных антигенов [21]. Очистка с помощью аффинной хроматографии описана в гл. 5, а приготовление иммуноглобулинов [c.50]

    До начала использования моноклональных антител разделение подклассов IgG иезависимо от требуемой степени чистоты оставалось трудной задачей. Методика очистки заключается в следующем [11]  [c.109]

    Доступность моноклональных антител в достаточно больших количествах позволяет использовать другой метод очистки подклассов IgG (так же как IgM, IgA и, IgE)—аффинную хроматографию на колонках с иммуносорбенто м. Процедуры аффинного связывания и элюции рассмотрены в гл. 5. [c.110]

    Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]

chem21.info

Получение и очистка моноклональных антител

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Получение и очистка моноклональных антител

 

 

 

Введение

 

В 1975 г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомной технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены. В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линией миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы in vitro за несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена. Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах.

Последние достижения в этой области включают получение антиидиотипических антител и моноклональных антител овцы межвидовым слиянием клеток. Кроме того, получены моноклональные антитела человека как из гибридом, образованных с помощью внутри- или межвидового слияния клеток, так и из культуры В-лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна – Барра. Другими большими достижениями, важными для практики, являются получение биспецифических антител из гибридных гибридом и создание химерных антител с помощью трансфекции генов иммуноглобулинов в миеломные клетки.

 

 

 

1. Получение антител

 

Наиболее важные области применения моноклональных антител перечислены в табл. 1.

 

Таблица 1. Основные области применения антител

Область применения

Потребность

(г в год)

Диагностические наборы

1 -200

Визуализация in vivo

1 - 100

Иммунотерапия

1000 -100 000

Иммуноочистка

1 -1000

 

Традиционный метод получения больших количеств моноклональных антител включает введение мышам или крысам гибридомных клеток выбранного клона с последующим развитием опухолевых асцитов и отбором асцитной жидкости. От одной мыши можно получить до 50 мг антител. Однако при получении очень больших количеств антител использование животных уже нецелесообразно, поскольку для получения 1 кг очищенного продукта потребуется 20 000 мышей. Следовательно, необходимо развивать промышленную технологию получения моноклональных антител in vitro.

 

1.1 Методы получения моноклональных антител in vitro

 

Методы выращивания гибридом in vitro имеют ряд преимуществ по сравнению с методами получения антител in vivo:

  1. в них не используются животные;
  2. они дают очень малые количества примесных антител;
  3. размеры сосудов для культивирования можно легко увеличивать без особых затрат на масштабирование; в первую очередь это относится к трудозатратам и расходам на капитальное строительство;
  4. за счет оптимизации процесса достигается высокая воспроизводимость;
  5. уменьшается риск загрязнения целевого продукта различными веществами из животных-хозяев;
  6. в организмах грызунов трудно культивировать клетки человеческих гибридом и лимфобластоиды, трансформированные ВЭБ.

Существуют два подхода к культивированию животных клеток. Первый подход основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. В качестве примера можно привести перфузию в пористые волокна, применение микрокапсул, агарозных микрошариков или керамических кассет. Второй подход включает культивирование клеток в гомогенной суспензии.

Выбор одного из этих двух методов получения моноклональных антител в основном определяется требованиями производственного процесса. Система получения моноклональных антител должна быть

  1. сравнительно простой и легкой в управлении;
  2. воспроизводимой для обеспечения высокого качества продуктов;
  3. легко стерилизуемой и способной работать асептически в течение длительного периода времени;
  4. просто и эффективно масштабируемой.

 

1.1.1 Культивирование в гомогенной суспензии

Фирма Celltech для получения моноклональных антител использует культивирование в гомогенной суспензии. Преимущества этого метода включают все упомянутые факторы. Кроме того, при проведении процесса в суспензии за счет перемешивания достигается высокая гомогенность культуры. Эффективное перемешивание очень важно, так как при культивировании необходимо равномерное распределение клеток по всему объему сосуда. При этих условиях результаты измерений рН или концентрации растворенного кислорода в одной определенной точке сосуда будут отражать состояние всей культуры клеток, в результате чего осуществляется простой и надежный контроль этих параметров. Хорошее перемешивание обеспечивает быстрое и равномерное распределение любого добавленного компонента во всем объеме. Кроме того, от эффективности перемешивания зависят параметры массопереноса в ферментере, особенно переноса кислорода. При атмосферном давлении содержание кислорода в воде, насыщенной атмосферным воздухом, составляет примерно 7 мг/л. Один миллион гибридомных клеток потребляет такое количество кислорода за один час. Таким образом, эффективное снабжение культуры клеток кислородом является очень важным фактором; в противном случае рост клеток будет лимитироваться кислородом.

 

1.1.2 Масштабирование процесса

Культивирование в гомогенной суспензии имеет неоспоримые преимущества, когда возникает проблема масштабирования процесса. Увеличение размера ферментера в десять раз требует увеличения капитальных затрат всего в два-три раза, а трудозатраты будут несравненно меньшими по сравнению с трудозатратами на одновременное культивирование в нескольких ферментерах меньшего размера. Гомогенность системы обеспечивает стабильность параметров. перемешивания и массопереноса, что в свою очередь облегчает их расчет для сосудов различной формы. Более того, такая система дает наилучшие ВРЗ-можности для непосредственного наблюдения за параметрами процесса и их регулирования.

Традиционно в микробиологических процессах используют емкостные ферментеры с механическим перемешиванием. Подобные ферментеры объемом до 8000 л применяют для получения вируса ящура и интерферона. В то же время фирма Celltech для выращивания гибридомных клеток использует ферментеры эрлифтного типа с активной подачей воздуха.

 

 

1.1.3 Эрлифтные ферментеры

Применение эрлифтных ферментеров для получения антител впервые описано Катингером и др., которые решили, что такие ферментеры целесообразно использовать для культивирования клеток с высокой чувствительностью к механическим повреждениям. Принцип работы эрлифтного ферментера представлен на рис. 1. Его подробное описание можно найти в обзоре. Реактор изготовляют из стекла для работ лабораторного масштаба и из нержавеющей стали при промышленном культивировании. Газовую смесь подают из кольцевого барботера в основание тяговой трубы, расположенной соосно внутри ферментера. Газ, поднимаясь вверх по трубе, поступает к клеткам культуры и удерживается на ее поверхности. При подъеме газа по трубе создается разность плотностей между содержимым трубы и остальным объемом ферментера, в результате чего обеспечивается циркуляция культуры в ферментере. Вспенивание, которое может возникнуть при необходимой для роста клеток скорости подачи кислорода, обычно легко подавляется обычными антивспенивающими агентами.

 

 

1.1.4 Регулирование условий культивирования

Рост гибридомных клеток и синтез антител ими зависят от физико-химических характеристик микроокружения клеток. При этом особое внимание уделяется регулированию рН, концентрации растворенного кислорода, температуры и содержания питательных веществ. Адекватность процессов контроля и регулирования легче всего достигается в гомогенной системе. В свою очередь для этого необходимо эффективное перемешивание, обеспечивающее соответствующие характеристики тепло- и массопереноса в ферментере.

В эрлифтных ферментерах фирмы Celltech концентрация растворенного кислорода регулируется автоматически изменением скорости подачи воздуха в ферментер. Необходимый рН среды обеспечивается или введением в поток газа диоксида углерода, или добавлением гидроксида натрия в культуральную жидкость. Температура в ферментере поддерживается с помощью воды, циркулирующей в термостатирующей рубашке ферментера. При необходимости вода нагревается или охлаждается в теплообменнике.

 

1.1.5 Контроль роста клеток

Контроль за ростом клеток осуществляется путем асептического отбора проб из ферментера с последующим подсчетом клеток иа гемоцитометре. Для дискриминации живых и мертвых клеток используют краситель трипановый голубой. Косвенное слежение за ростом клеток может осуществляться также путем измерения скорости потребления кислорода. Возможность прямого подсчета общего количества и количества жизнеспособных клеток в ферментере является несомненным преимуществом по сравнению с негомогенными системами культивирования. Концентрацию антител в культуральной жидкости определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или с помощью ELISA.

 

1.1.6 Использование микропроцессоров

На неавтоматизированных предприятиях большую часть затрат на производство моноклональных антител составляют расходы на оплату труда. Поэтому ручной труд целесообразно автоматизировать. В нашем случае всем процессом можно управлять с помощью компьютера, который обеспечивает автоматическое включение и выключение необходимых клапанов и насосов на всех этапах процесса, в том числе на стадиях очистки, стерилизации, проведения основного процесса, сбора клеток и выделения антител. В этом случае функции оператора ограничиваются только приготовлением питательной среды и общим наблюдением за ходом процесса. Однако осуществление высокой степени автоматизации невозможно без активного компьютерного самоконтроля, а также без проверки правильности выполнения всех технологических стадий. Кроме того, компьютер должен сигнализировать об авариях и принимать необходимые меры в случае отказа той или иной основной или вспомогательной системы.

Обеспечение кислородом. Хотя клетки млекопитающих потребляют несравненно меньше кислорода, чем микроорганизмы, обеспечение гибридомных клеток кислородом в ходе культивирования является одним из наиболее важных факторов, определяющих общую эффективность процесса. Многие системы культивирования не обеспечивают поступление кислорода в количестве, достаточном для поддержания высокой плотности популяции клеток. Кроме того, кислород плохо растворяется в среде для культивирования. Потребление кислорода гибридомами составляет 6–11 мкг на миллион клеток в час в зависимости от линии клеток и фазы их цикла роста. Измерения скоростей процессов переноса кислорода в эрлифтных ферментерах при различных скоростях подачи газа показали, что эти ферментеры в принципе обеспечивают намного большую скорость подачи кислорода, чем необходимо для роста культуры. Такая эффективность в первую очередь достигается за счет барботажной системы, обеспечивающей высокую эффективность переноса кислорода; к тому же систему барботажа можно легко пересчитать при масштабировании процесса. Интересно, что исследование влияния концентрации растворенного кислорода на кинетику роста гибридом и синтез конечного продукта показало, что изменение степени насыщения раствора воздухом от 8 до 100% заметно не влияет на эффективность процесса.

 

1.1.7 Питательные среды

Другим аспектом физиологии, животных клеток, которому уделяют все большее внимание, являются питательные среды. Исследования компонентов питательных сред, выполненные в различных лабораториях, явились основой; для создания ныне хорошо известных сред, а также понимания механизма гормонального регулирования.

Бессывороточные среды. В настоящее время наблюдается тенденция к производству моноклональных антител в средах с низким содержанием сыворотки или в бессывороточных средах, хотя публикаций о применении таких сред в промышленном масштабе очень немного. Преимущества таких сред по сравнению с обычными, содержащими 10 и более процентов сыворотки, заключаются в упрощении процесса и удешевлении продукции. В случае бессывороточных сред, кроме того, достигается более высокая воспроизводимость процесса, поскольку каждый компонент среды хорошо известен и может быть получен в очень чистом состоянии. Наконец, бессывороточные синтетические среды полезны и в научно-исследовательских работах, поскольку в них можно селективно варьировать концентрацию любого компонента. По сути дела, для проведения корректных научных исследований по росту гибридомных и других клеточных линий в первую очередь необходимо иметь хорошо охарактеризованную бессывороточную среду.

Кинетика роста. До появления бессывороточных сред закономерности роста животных клеток изучали на средах, содержащих различные сыворотки. Позднее оказалось, что кинетика роста и биосинтез антител гибридомными клетками на бессывороточных средах и в средах, содержащих сыворотку, очень близки. На рис. 2 представлены характеристики роста гибридомных клеток грызунов и образования IgG на бессывороточной среде в эрлифтом ферментере объемом 1000 л. Клетки росли с временем удвоения 18 ч, максимальная плотность популяции была равна 3,2 млн. жизнеспособных клеток в 1 мл. После 260 ч ферментации выход антител составил 26 г. В других случаях время ферментации зависит от конкретной линии клеток и изменяется от 140 до 400 ч. Время удвоения клеток при этом составляет 11–36 ч, а максимальная плотность популяции – 1,0–4,6 млн. клеток в 1 мл.

2.1.5. Биосинтез антител. Концентрация моноклональных антител, получаемых в эрлифтных ферментерах Celltech, в среднем составляет 109 мг/л и изменяется в диапазоне 40 – 500 мг/л. Эти изменения отражают характерные особенности каждой линии клеток. Отметим, что выход антител при культивировании в колбах или во вращающихся сосудах значительно ниже, чем в ферментерах. Более высокие выходы антител в ферментерах являются результатом оптимизации процесса, особенно в отношении состава культуральной среды.

 

1.2 Эффект фазы роста культуры

 

Как видно из приведенных на рис. 2 данных, образование антител продолжается даже после того, как клетки перестали пролиферировать. Было высказано обоснованное предположение, что синтезированные антитела не сразу секретируются клетками в культуральную среду. Позднее, в фазе отмирания, клетки лизируют и высвобождают находящиеся в них антитела. Полученные результаты побудили провести специальные эксперименты по определению содержания антител в клетках в фазах роста и отмирания. Оказалось, что количество антител, которые удается выделить из гибридомных клеток после их разрушения с помощью замораживания – размораживания, в течение всех фаз роста практически постоянно и слишком мало, чтобы можно было объяснить наблюдаемую кинетику синтеза антител.

 

 

 

Полученный осветленный раствор содержит моноклональные антитела в низкой концентрации, поэтому обычно для облегчения последующих операций его концентрируют с помощью ультрафильтрации в тангенциальном потоке. При этом удаляются вода и низкомолекулярные примеси. После этой стадии объем раствора уменьшается примерно в десять раз, а концентрация антител достигает 1–5 т/л.

 

 

2. Очистка антител

 

В зависимости от области применения антител и от их свойств можно использовать самые различные способы очистки. Для диагностических целей часто достаточно иметь препараты антител 70–95%-ной степени чистоты. С другой стороны, при применении антител in vivo их чистота должна быть намного выше. В сывороточных средах содержание антител не превышает 10% от общего количества белка. Хотя проведение процесса на бессывороточных средах и облегчает очистку, на практике относительно легко достичь 90%-й и даже более высокой степени чистоты независимо от содержания сывороточных белков. При очистке антител для их использования in vivo на последних стадиях очистки приходится решать одни и те же проблемы независимо от природы питательной среды. Высокоэффективные методы очистки необходимы для удаления следовых количеств не только примесных белков, но и пиротенов и ДНК. Ранее для очистки антител широко применяли фракционирование сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией. Применение этих методов осложняется тем, что различные моноклональные антитела имеют разные изоэлектрические точки. Кроме того, после ионообменной хроматографии чистота антител не превышает 90%, поэтому для дальнейшей очистки необходимы другие методы, например гель-фильтрация. Однако в тех случаях, когда моноклональные антитела используют для диагностики или иммуноаффинной очистки, ионообменная хроматография или ее сочетание с предварительным осаждением позволяют получить препараты достаточного качества.

 

2.1 Очистка с помощью иммобилизованного белка А

 

Известен метод получения препаратов различных антител с чистотой более 95%, основанный на применении иммобилизованного белка А. Этот аффинный лиганд не нашел широкого применения для очистки моноклональных антител из-за его плохого связывания с иммуноглобулинами типа IgGi, к которому относится около 90% моноклональных антител. Можно, однако, подобрать условия, при которых связывающая способность иммобилизованного белка А по отношению к IgGi возрастает в пять раз. Тогда после одной стадии аффинной очистки можно получить высокочистые антитела с выходом более 90%. На рис. 3.6 представлены электрофореграммы, полученные в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, после концентрирования и моноклональных антител после очистки на иммуносорбенте с белком А. Образцы были подготовлены так, чтобы в каждом из них содержались одинаковые количества моноклональных антител; таким образом можно наглядно сравнить общее количество белка в каждом образце после выдерживания с красителем кумасси голубым. Во многих случаях дальнейшая очистка антител уже не нужна. Кроме того, быстрая одностадийная очистка позволяет получить более активные антитела, чем медленные многостадийные методы. Колонку с иммобилизованным белком А часто можно использовать более тридцати раз, хотя ее аффинные свойства сильно зависят от способа регенерации. Таким образом, высокая цена белка А компенсируется длительным временем функционирования колонки и высокими качеством и выходом получаемых антител.

Использование микрокомпьютерной системы управления позволяет совершенствовать метод аффинной хроматографии. Свойства аффинных колонок после каждого цикла меняются, как бы точно ни выполнялись условия очистки. Поэтому система управления, основанная на регистрации времени или объема, не может реагировать на такие изменения. Высокая стоимость аффинных колонок, особенно белка А, а также ценность получаемых моноклональных антител требуют включения в систему управления приборов, реагирующих на любые отклонения и неполадки. Например, применение датчиков на воздух позволяет предотвратить высушивание колонки при прекращении подачи раствора, а использование клапанов давления перед входными фильтрами предотвращает разрушение системы, если колонка забьется.

 

2.2 Характеристика очищенных антител

 

При использовании in vivo к качеству моноклональных антител предъявляются очень высокие требования. Поэтому характеристике получаемых для этих целей в производственном масштабе антител следует уделять самое тщательное внимание. Необходимо, например, разработать методы определения пикограммовых количеств возможных примесей. Если же моноклональные антитела предполагается использовать для диагностических целей, важнее удостовериться в их функциональной пригодности. Как правило, для того чтобы показать, что препарат антител удовлетворяет принятым стандартам, его характеризуют двумя методами – изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом в полиакри-ламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

 

 

 

3. Дальнейшие перспективы

 

Для дальнейшего совершенствования процессов получения и очистки моноклональных антител необходимо провести исследования в нескольких направлениях. Используемые в настоящее время процессы ферментации очень эффективны. Однако более глубокое понимание физиологии гибридом и линий клеток человека должно позволить увеличить выход продукта. Например, очень перспективным представляется улучшение линий клеток путем повторного слияния гибридом с родительскими миеломами, имеющими особенно благоприятные характеристики. Кроме того, большое поле деятельности открывается в области инженерии моноклональных антител. Эта технология позволит создавать новые типы моноклональных антител с заранее заданными свойствами и получать их в больших количествах. Необходимо также развивать методы скрининга для поиска клонов, секретирующих антитела при культивировании на бессывороточных средах.

В заключение отметим, что получение и очистка моноклональных антител требуют новых как научных, так и инженерных разработок, чтобы можно было проектировать процессы, обеспечивающие как быстрый рост продуцирующих клеток, так и высокое качество конечного продукта. Создание таких процессов позволит получать большие количества моноклональных антител с очень высокой степенью чистоты. Ясно, что такие процессы являются идеальными для получения новых моноклональных антител, которые могут быть применены в иммуноанализе.

znakka4estva.ru


Смотрите также