Мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis. Моноклональные антитела мышиные


мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis - патент РФ 2420588

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны изолированное мышиное антитело, селективно связывающееся с антигеном F1 из Yersinia pestis, и антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Представлена клетка дрожжей, продуцирующая описанный антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Предложен способ получения описанного антигенсвязывающего фрагмента. Также предложен способ детекции Yersinia pestis и набор для детекции антигена F1 из Yersinia pestis. Изобретение предоставляет реагент для детекции Yersinia pestis. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл. мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588

Область техники

Настоящее изобретение относится к антителам, в частности к мышиным моноклональным антителам, связывающимся с белком F1 из Yersinia pestis, способу получения указанных антител с использованием дрожжей, применению указанных антител для детекции Yersinia pestis и к набору для указанного применения, содержащему указанные антитела.

Предшествующий уровень техники

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в непосредственной близости друг от друга благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in WO 91/09967.

Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497). Она включает в себя главным образом иммунизацию мыши антигеном, слияние клеток селезенки из иммунизированной мыши с клетками миеломы мыши и селекцию среди полученных таким образом гибридом одной или нескольких гибридом, которые секретируют моноклональное антитело, специфическое для целевого антигена.

Капсульный антиген F1 является основным иммунохимическим компонентом антигена, расположенного на поверхности Y. pestis. Антиген F1 присоединен к внешней мембране микроба Y. pestis в виде олигомерного белка, образующего гранулярный слой и постепенно диффундирующего в окружающую среду. Капсульный полимер состоит из множества похожих субъединиц гидрофобного белка, агрегированных при физиологических условиях. Субъединица F1 антигена изначально синтезируется из 170 аминокислот и обладает молекулярной массой 17.6 кДа, затем, после удаления сигнального пептида в ходе секреции на поверхность, формируется белок с молекулярной массой 15.6 кДа и изоэлектрической точкой 4.1 (Karlyshev et al., FEBS Lett. 1992 Feb 3; 297(1-2):77-80).

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения было получение реагента для детекции Yersinia pestis.

Указанная цель была достигнута путем выделения мышиного антитела, обладающего способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis, определения его последовательности и демонстрацией высокой специфичности указанного антитела в связывании антигена F1 из Yersinia pestis. Также указанная цель была достигнута путем создания способа получения указанного функционального антитела с использованием клеток дрожжей.

Настоящее изобретение предоставляет новое моноклональное мышиное антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Такое новое моноклональное мышиное антитело селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis.

Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий описанное выше антитело.

Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент с участком связывания антигена (fragment antigen binding, Fab) моноклонального мышиного антитела, который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1 и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2.

Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент с антигенсвязывающим участком (fragment antigen binding, Fab), описанный выше.

Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, трансформированную описанным выше фрагментом ДНК, обладающую способностью к продукции указанного Fab.

Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, описанную выше, где указанной клеткой дрожжей является Pichia pastoris.

Также настоящее изобретение предоставляет способ получения Fab, описанного выше, включающий выращивание указанных дрожжей в питательной среде и выделение указанного Fab из культуральной жидкости.

Также настоящее изобретение предоставляет способ детекции Yersinia pestis, включающий: (а) получение образца от животного или человека; (b) взаимодействие указанного образца с антителом или Fab, описанными выше; (с) детектирование комплекса, образованного указанным антителом или Fab и антигена F1; и, необязательно, (d) определение количества антигена F1, присутствующего в указанном образце на основании детектированного количества комплекса, образованного антителом и антигеном F1, или комплекса, образованного Fab и антигеном F1.

Также настоящее изобретение предоставляет набор для детекции антигена F1 из Yersinia pestis, содержащего изолированные моноклональные антитела, которые селективно связываются с антигеном F1 из Yersinia pestis, и средства, позволяющие детектировать указанный антиген F1 с использованием указанного антитела.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показан Вестерн-блоттинг (дорожки 1-2) и электрофорез в 12% SDS-ПААГ (восстановительные условия) антигена F1 из Y. pestis с мышиными антителами. Дорожки; 1 - конъюгат анти-IgG-POD (контроль), 2 - мышиные антитела (20 мкг/мл), 3 - антиген F1 из Y. pestis, 4 - стандарт молекулярных весов (97, 69, 45, 30, 20 кДа).

На Фиг.2 показана иммунореактивность антитела с использованием антигена F1 из Y. pestis, определенная с использованием метода ELISA.

На Фиг.3 показаны калибровочные кривые для определения константы диссоциации антитела и антигена F1 из Y. pestis, полученные с использованием метода ELISA determined by ELISA method.

На Фиг.4 показаны кривые смертности мышей как в экспериментальной, так и в контрольной группах.

На Фиг.5 показаны последовательности нуклеотидов и аминокислот участка VH. 5'-Праймер, использованный для клонирования гена, кодирующего фрагмент Fab мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis, указан голубым, каркасные участки показаны желтым, гипервариабельные петли (CDR) показаны зеленым, константный домен тяжелой (IgG1) цепи мышиного антитела показан красным.

На Фиг.6 показаны последовательности нуклеотидов и аминокислот участка VL. 5'-Праймер, использованный для клонирования гена, кодирующего фрагмент Fab мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis, указан голубым, каркасные участки показаны желтым, гипервариабельные петли (CDR) показаны зеленым, константный домен легкой (kappa) цепи мышиного антитела показан красным.

На Фиг.7 показана конструкция плазмид pPICZмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 A-F1-mouse-H и pPICZмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 A-F1-mouse-L.

На Фиг.8 показана схематическая карта плазмиды pPICZмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 A-F1-mouse-H-L.

На Фиг.9 показан Вестерн-блоттинг культуральной жидкости штамма GS115/AOX-F1-mouse-H-L, продуцирующего фрагмент Fab, с анти-мышиными антителами. Дорожки с мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 -меркаптоэтанолом: 1 - маркеры веса; 2 - GS115/AOX-F1-mouse-H-L, 3-GS115.

На Фиг.10 показаны данные анализа белков (12% SDS-ПААГ) для 4 фракций препарата Fab после очистки методом гель-фильтрации на колонке с Sephadex G50. Дорожки: 1 - стандарт, 2-5 - различные фракции препарата антитела.

На Фиг.11 показана калибровочная кривая для Fab против антигена F1 из Y. pestis, полученная методом ELISA.

На Фиг.12 показана кривая связывания для природного (а) и рекомбинантного (b) Fab против антигена F1 из Y. pestis в координатах Клоца (Klotz coordinates).

Подробное описание настоящего изобретения

Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (а) назначение животному эффективного количества белка, пептида или его мимотопа с целью получения антител и (b) выделение указанных антител. Антитела, полученные против определенных белков или мимотопов, могут обладать некоторыми преимуществами, поскольку такие антитела не сильно загрязнены антителами против других соединений, что могло бы, в противном случае, повлиять на точность диагностического метода. Способы получения таких антител известны из предшествующего уровня техники и подробно описаны Harlow и др. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988) и включают в себя иммунизацию животных с целью получения препаратов антител, которые выделяют из, например, плазмы или асцитной жидкости и очищают способами, известными из уровня техники, с получением препаратов, дающих реакцию с антигеном. Множество видов имеют белки с близкими последовательностями и поэтому могут возникнуть сложности в ходе использования стандартных протоколов иммунизации при получении антител, которые узнают белок только одного вида. Поэтому также стоит рассмотреть модификации стандартных методов получения антител, таких как, например, разностные (вычитательные) гибридизационные методики. Такие модификации могут быть известны специалисту в данной области техники, также они описаны в настоящем описании. В других методах антитела, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, получают с использованием рекомбинантных методов, описанных Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)).

Вкратце, моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин "выращенные клетки", использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, keyhole limpet hemacyanin, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).

В частности, антителами в соответствии с настоящим изобретением являются мышиные моноклональные антитела, обладающие способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis (Y. pestis). Указанные антитела являются мышиными моноклональными антителами, содержащими аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи антитела (VH), аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи антитела (VL) консервативных участков обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела, представлены, но не ограничиваются аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID NO:54 и SEQ ID NO:55. Указанные новые мышиные моноклональные антитела селективно связываются с антигеном F1 из Y. pestis.

Далее, участком связывания антигена (fragment antigen binding, Fab) согласно настоящему изобретению является изолированный Fab, который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 и вариабельный участок легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

В настоящем изобретении фраза "антитело или Fab, обладающий способностью к связыванию с антигеном F1 из Yersinia pestis" означает молекулу, которая связывается с антигеном F1 и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов. Термин "селективно связывает антиген F1 из Yersinia pestis" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с антигеном F1 в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к антигену F1, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом или Fab, которое предпочтительно связывается с антигеном F1, является антитело или Fab, которое связывается с антигеном F1, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с антигеном F1, с молекулой, не являющейся антигеном F1, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с антигеном F1, определить уровень антигена F1 из Y. pestis в образце. Примерами таких молекул и компонентов, которые могут присутствовать в образце, являются, но не ограничиваются ими, белки, не являющиеся антигеном F1, липиды и углеводы.

Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающимися методом ELISA и равновесным диализом. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).

Fab, пригодный для осуществления настоящего изобретения, - это Fab, обладающий способностью к связыванию антигена F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет от около 10 нг/мл и около 10 пг/мл. В частности, пригодные в рамках настоящего изобретения антитела связывают антиген F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет 10 нг/мл, около 1 нг/лм или менее, предпочтительно 100 пг/мл. Такие антитела и Fab описаны в сопутствующих Примерах.

Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело согласно настоящему изобретению, является экспрессирующийся фрагмент ДНК, содержащий промотор, сигнальную последовательность, последовательность нуклеотидов, кодирующую структурные части тяжелой и легкой цепей антитела, участок терминации транскрипции.

В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие структурные части тяжелой и легкой цепей антитела согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4), связанный с фрагментом ДНК, кодирующим консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Нуклеотидные последовательности, кодирующие консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела, представлены, но не ограничиваются последовательностями, представленными в SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:57.

Также, нуклеотидные последовательности, кодирующие Fab согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4).

Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO:3 или 4 при условии, что они кодируют участки цепей антитела с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2.

Клетками дрожжей согласно настоящему изобретению являются клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК, описанным выше, и обладающие способностью к продукции Fab против антигена F1 из Y. pestis.

Фраза «клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК» означает, что желаемый фрагмент ДНК был введен в клетку дрожжей с использованием методов, известных специалисту в данной области техники. Трансформация клетки дрожжей фрагментом ДНК приводит к увеличению экспрессии фрагмента ДНК, кодирующего антитело согласно настоящему изобретению. Присутствие сигнальной последовательности мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 -фактора приводит к секреции произведенного антитела в культуральную жидкость. Методы трансформации клеток дрожжей включают в себя все известные методы, например модифицированная версия процедуры, описанной для S. cerevisiae (Gietz and Schiesti, 1996).

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения Fab против антигена F1 из Y. pestis, включающий выращивание дрожжей в питательной среде и выделение полученного Fab из культуральной жидкости.

Примером клетки дрожжей, пригодных для продукции Fab согласно настоящему изобретению, являются, но не ограничивается ими, клетки дрожжей Pichia pastoris. Фраза "дрожжи Pichia pastoris" означает, что указанные дрожжи классифицируют как Pichia pastoris (Р. pastoris) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области микробиологии. Примерами дрожжей Р. pastoris, применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, дрожжи Р. pastoris GS115 (Invitrogen).

В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка Fab из культуральной жидкости и других жидкостей может быть осуществлена методом, сходным с традиционными методами ферментации, когда некий белок производится с использованием микроорганизма.

Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источник углерода, источник азота, минералы и, если это необходимо, подходящее количество питательных веществ, в которых нуждаются дрожжи для их роста. К источникам углерода относятся углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции у указанного микроорганизма может быть использован спирт, включая метанол, этанол, глицерин. В качестве источника азота могут быть использованы различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, источники природного азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, расщепленные ферментированные микроорганизмы. В качестве источника минералов могут быть использованы монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут быть использованы тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.

Выращивание предпочтительно осуществляют в аэробных условиях, таких как культивирование с перемешиванием, взбалтывание с аэрацией, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 28 до 30°С. рН среды обычно поддерживают в диапазоне от 2 до 9, предпочтительно в диапазоне от 6 до 7.5. рН среды может быть скорректирован с помощью аммиака, карбоната кальция, различных оснований и буферов. Обычно выращивание в течение от 1 до 7 дней приводит к накоплению Fab в культуральной жидкости.

После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем антитела или Fab могут быть выделены и очищены методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.

Моноклональные мышиные антитела в соответствии с настоящим изобретением, которые селективно связываются с антигеном F1 из Y. pestis, также могут быть получены с использованием подходящей гибридомы. Гибридомы могут быть выращены в питательной среде и накопленные антитела могут быть выделены. Здесь и далее термин "выращиваемые клетки" относится к гибридомам или другим линиям клеток, которые производят антитела. Способы получения и проверки таких выращиваемых клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Методы получения антигенного материала для инъекций в животное включают в себя методы, известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, пептидов, выбранных из иммуногенного участка этого белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, keyhole limpet hemacyanin, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методам, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).

Другим способом согласно настоящему изобретению является способ детекции Yersinia pestis. Указанный способ включает в себя: (а) получение образца из животного или человека; (b) взаимодействие указанного образца с антителом или Fab, описанными выше; (с) детектирование комплекса, образованного указанным антителом или Fab и антигена F1; и, необязательно, (d) определение количества антигена F1, присутствующего в указанном образце на основании детектированного количества комплекса, образованного антителом и антигеном F1, или комплекса, образованного Fab и антигеном F1. Присутствие в образце любого количества антигена F1 из Н. pestis является свидетельством наличия заболевания.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец получают или выделяют из животного или человека для того, чтобы протестировать на наличие Y. pestis. Животное может как быть под подозрением на наличие ранней стадии заболевания или нет. В качестве образца, который может быть использован для определения наличия Y. pestis, может быть использован образец любой ткани животного. Кровь, мокрота, содержание бубонов, образцы тканей являются подходящими образцами. Предпочтительным образцом является кровь. Специалист в данной области может без труда выбрать подходящие образцы.

Хотя это не является необходимым в рамках настоящего изобретения, образец может быть подвергнут желаемой предварительной обработке. Например, образец может быть нормирован до достижения желаемой степени специфической активности. Нормирование образца с использованием подходящего метода разведения, известного из уровня техники, позволяет определить количественное содержание антигена F1 из Y. pestis независимо от начальной концентрации (например, удельного веса) в образце.

После получения образца определяют уровень антигена F1 из Y. pestis в данном образце. Термины "определяют", "определяют уровень антигена F1 из Y. pestis", "определяют количество антигена F1 из Y. pestis" и подобные им, использованные здесь, используются для того, чтобы очертить круг методов, которые могут быть использованы для определения или измерения количества антигена F1 из Y. pestis в образце. Такие методы могут дать качественные или количественные результаты. Уровень содержания антигена F1 из Y. pestis может быть определен по содержанию целого белка антигена F1 из Y. pestis protein или по содержанию фрагментов, продуктов деградации или продуктов реакции антигена F1 из Y. pestis.

Антитела, связывающиеся с антигеном F1 из Y. pestis, пригодные в способах согласно настоящему изобретению, могут включать в себя многофункциональные антитела, например бифункциональные антитела, содержащие, по крайней мере, одну функциональную часть, которая специфически связывается с антигеном F1. Такие многофункциональные антитела могут включать в себя, например, химерные молекулы, включающие в себя молекулу, которая связывается с антигеном F1, и вторую часть, которая дает возможность данной химерной молекуле связываться с субстратом или позволяет детектировать ее способом, при котором связывание с антигеном F1 не ухудшается. Примерами таких вторых частей являются, но не ограничиваются ими, фрагменты молекулы иммуноглобулина, флуоресцентный белок или фермент.

Гибриды или слитые белки антител, которые сохраняют способность связываться с антигеном F1 из Y. pestis, также могут быть использованы. В таких гибридах часть, связывающая антиген F1, может быть связана со второй частью, которая может связываться с субстратом или может быть детектирована. Примеры таких вторых частей включают в себя, но не ограничиваются ими, фрагменты молекул иммуноглобулина, эпитопы, флуоресцентные белки или ферменты.

Антитело, обладающее способностью к связыванию с антигеном F1 из Y. pestis, использованное в рамках настоящего изобретения, может содержаться в составе для детекции. Например, антитело может содержаться в буфере, в котором это антитело растворено, и/или быть объединено с носителем. Подходящие буферы и носители известны для специалиста в данной области техники. Примеры подходящих буферов включают в себя любой буфер, в котором антитело может функционировать с селективным связыванием антигена F1, такой как, но не ограничивающийся, фосфатный солевой буфер, вода, буфер HEPES (буферная соль N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты), буфер TES (солевой буфер Трис-ЭДТА), буфер Трис и буфер ТАЭ (Трис-ацетат-ЭДТА). Примеры носителей включают в себя, но не ограничиваются ими, полимерные матрицы, токсоиды, сывороточные альбумины, такой как бычий сывороточный альбумин. Носители могут быть комбинированы с антителом или конъюгированы (присоединены) к антителу способом, который существенно не изменяет способность антитела к связыванию антигена F1.

Термин "взаимодействие", использованный здесь, означает введение, добавление образца, предположительно содержащего антиген F1 из Y. pestis, к антителу, связывающему антиген F1, например, путем объединения или смешения образца с антителом. В случае, если антиген F1 из Y. pestis присутствует в образце, образуется комплекс антигена F1 с антителом; образование такого комплекса означает способность антитела селективно связываться с антигеном F1 с образованием стабильного комплекса, который может быть детектирован. Детектирование может быть качественным, количественным или полуколичественным. Связывание антигена F1 из образца с антителом происходит в условиях, подходящих для формирования комплекса. Такие условия (например, подходящие концентрации, буферы, температура, время реакции), а также методы оптимизации таких условий хорошо известны специалисту в данной области техники. Связывание может быть обнаружено и измерено с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные методы иммунохимии (например, ELISA), иммунопреципитации, методы иммуноблотинга и другие методы иммунохимии, описанные, например, Sambrook и др. (см. выше) и Harlow и др. (см. выше). Эти ссылки также описывают примеры условий, в которых образуется комплекс.

В рамках одного из воплощений настоящего изобретения комплекс антигена F1 и антитела может образовываться в растворе. В рамках другого воплощения настоящего изобретения может образовываться комплекс антигена F1 с антителом, в котором антиген F1 или антитело иммобилизовано на подложке (например, нанесено на подложку). Методики иммобилизации хорошо известны специалисту в данной области техники. Подходящие материалы для подложки включают в себя, но не ограничиваются пластмассой, стеклом, гелем, целлулоидом, тканями, бумагой и другими материалами. Примеры материалов подложки включают в себя, но не ограничиваются латексом, полистиролом, нейлоном, нитроцеллюлозой, агарозой, хлопком, PVDF (поливинилиденфторидом) и магнитными смолами. Подходящие формы материала подложки включают в себя, но не ограничиваются углублениями (например, плашки для микротитрования), чашки для микротитрования, стержни, полоски, бусины, аппараты с ответвляющимся потоком, мембраны, фильтры, трубки, чашки, целлулоидный матрикс, магнитные частицы, другие макрочастицы. В частности, предпочтительными подложками являются, например, пластинки для ELISA, стержни, полоски для иммуноанализа, радиоиммунологические чашки, агарозные бусины, пластиковые бусины, бусины из латекса, гибки, хлопковые нити, пластиковые чипы, мембраны для иммуноблотинга, бумага для иммуноблотинга и проточные мембраны. В одном из вариантов воплощения изобретения подложка, указанная выше, может содержать маркер для детекции. Описание примеров материалов для подложки смотри, например, в Kemeny, D.М. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, Elmsford, N.Y. pp 33-44, and Price, С.) и Newman, D. eds. (Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition (1997) Stockton Press, NY, N.Y.).

Антитело может быть иммобилизовано на подложке, такой как плашка для микротитрования, стержне, полоске для иммуноанализа, аппараты с ответвляющимся потоком. Образец, полученный из животного или человека, наносят на подложку и инкубируют в условиях, подходящих (то есть, достаточных) для образования комплекса антигена F1 с антителом, связанным с подложкой.

В соответствии с настоящим изобретением комплекс антигена F1 с антителом детектируют. Термин "детектирование образования комплекса", использованный здесь, означает идентификацию присутствия антитела, связанного с антигеном F1. Если комплекс образуется, то количество образованного комплекса может быть оценено количественно, но это не является обязательным. Образование комплекса или селективное связывание между предполагаемым антигеном F1 с антителом может быть измерено (то есть, детектировано, определено) с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области (смотри, например, Sambrook и др., выше), примеры которых описаны здесь. Комплекс может быть детектирован множеством методов, включающих в себя, но не ограниченных использованием одного или нескольких методов: ферментоподобным иммунометодом, конкурентным ферментоподобным иммунометодом, радиоиммунным, флуоресцентным иммунометодом, хемилюминесцентным иммунометодом, методом с использованием аппаратов с ответвляющимся потоком, проточным методом, методом агглютинации, методом с использованием макрочастиц (например, с использованием частиц, таких как, но не ограниченных магнитными частицами или пластиковыми полимерами, такими как латекс или полистироловые бусины), методом иммунопреципитации, методом BioCoreмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 (например, с использованием коллоидного золота), методом иммунодота (например, Heska AG's Immunodot System, Фрибург, Швейцария) и методом иммуноблотинга (например, Вестерн-блотинг), методом фосфоресценции, проточным методом, методом хроматографии, методом с использованием полиакриламидного геля, методом поверхностного резонанса плазмонов, методом спектрофотометрии, методом с использованием частиц, методом электронных сенсоров. Указанные способы хорошо известны специалисту в данной области техники.

Эти методы могут быть использованы для получения количественных или качественных результатов в зависимости от того, как эти методы будут использованы. Результаты методов могут базироваться на детектировании нативной молекулы антигена F1 или ее фрагментов, продуктов их деградации или продуктов реакции антигена F1. Некоторые методы, такие как агглютинация, разделение с использованием макрочастиц и иммунопреципитация, могут дать визуальный результат (например, как наблюдение невооруженным глазом или с использованием устройств, таких как денситометр или спектрофотометр), не требующий применения маркера для детектирования.

В других методах конъюгация (то есть, присоединение) антитела с маркером для детектирования или с реагентом, который селективно связывается с антителом (например, антитело на антитело, связывающее антиген F1), помогает в детектировании образования комплекса. Такие соединения и реагенты являются примерами молекул для детектирования (то есть молекул, способных детектировать комплекс антитела с антигеном F1). Маркер для детектирования может быть присоединен к части молекулы, которая не влияет на способность этой молекулы связываться с антигеном F1. Методы конъюгации хорошо известны специалисту в данной области техники. Примеры маркеров для детектирования включают в себя, но не ограничиваются радиоактивными, флуоресцентными, хемилюминесцентными, хромофорными, ферментативными, фосфоресцентными, электронными маркерами; метками из золей металлов, цветных бусин, физическими метками или лигандами. Бусинами считаются макрочастицы, состоящие из материала в виде матрикса, такого как латекс или полистирол, который может быть ковалентно или нековалентно связан с молекулой для детекции. К лигандам относятся молекулы, которые селективно связываются с другой молекулой. Предпочтительные маркеры для детектирования включают в себя, но не ограничиваются флуоресцеином, радиоактивными изотопами, фосфатазой (например, щелочной фосфатазой), биотином, авидином, пероксидазой (например, пероксидазой хрена), мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 -галактозидазой, соединениями, подобными биотину или авидину (например, стрептовидин или ImmunoPure® NeutrAvidin). Например, в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела, связывающие антиген F1, конъюгируют с бусинами их латекса.

Настоящее изобретение также может включать в себя один или несколько слоев и/или типов вторичных молекул или других связывающих молекул, способных детектировать присутствие комплекса антитела с антигеном F1. Например, немодифицированные (то есть не связанные с молекулой для детектирования) вторичные антитела, которые селективно связываются с антителом, связывающим антиген F1, могут связываться модифицированным (то есть связанным с молекулой для детектирования) третичным антителом, которое селективно связывает вторичные антитела, что позволяет детектировать антиген F1. Подходящие вторичные антитела, третичные антитела и другие вторичные и третичные молекулы могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники. Предпочтительные третичные молекулы также могут быть выбраны специалистом в данной области техники на основании характеристик вторичной молекулы. Подобная стратегия может быть применена для последовательных слоев.

Также могут быть использованы не иммунологические методы. Для того чтобы детектировать антиген F1, могут быть использованы методы, такие как предварительное концентрирование образца, для повышения концентрации антигена F1 с целью повышения чувствительности к белку. Такие не иммунологические методы также включают в себя, например, электрофорез, где детектирование антигена F1 может быть произведено методами, известными из уровня техники, например окрашивание белка. В другом варианте осуществления изобретения тест на наличие антигена F1, основанный на использовании белков, может быть использован для определения антигена F1 в предварительно концентрированном образце из животного или человека.

Как только уровень антигена F1 измерен, может быть сделано заключение о наличии заболевания. Заключение о наличии заболевания означает сравнение уровня антигена F1 в образце для тестирования с уровнем, обнаруженным у здорового животного или человека. В рамках настоящего изобретения заключение о наличии заболевания делается, когда детектируется любое количество антигена F1.

Настоящее изобретение также включает в себя набор, подходящий для детекции (детектирования) антигена F1 из Y. pestis, использующий способ, описанный выше. Термин «подходящий» означает, что детекция включает в себя методы, описанные здесь, использующие антитела, связывающие антиген F1, в соответствии с настоящим изобретением. Такие антитела могут быть конъюгированы с маркером для детектирования. В другом варианте осуществления изобретения набор может содержать немеченые антитела в соответствии с настоящим изобретением, также как и меченые антитела с или без маркеров для детекции, обладающие способностью к детектированию антигена F1. Набор также может содержать сопутствующие компоненты, такие как, но не ограниченные буферами, метками, контейнерами, вставками, тюбингами, флаконами, шприцами и подобными предметами.

Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.

Пример 1. Очистка антигена F1.

Выращивание.

Выращивание микроорганизма Y. pestis EB76 (штамм с живой вакциной) осуществляли в плотной питательной среде, на агаре Хоттингера (Hottinger's agar) с добавлением сульфата магния до 0.25%, хлорида кальция до 0.025%, гемолизированной крови до 0.1% при 37°С в течение 48 часов.

Очистка антигена F1.

Культуру смывали с поверхности агара натрий-фосфатным буфером рН 8.5 (PBS 8.5). Клетки осаждали центрифугирование при 5000 g в течение 15 минут. Супернатант отбирали, осадок тщательно ресуспендировали в буфере PBS рН 8.5 и дважды промывали (на этой стадии капсульный антиген смывался в раствор с поверхности клеток). Супернатанты от промывок объединяли и использовали в качестве источника антигена F1 (грубый экстракт F1). Присутствие антигена F1 в растворе контролировали путем сбора данных ELISA с использованием приготовленных самостоятельно конъюгатов кроличьих антител против антигена F1 с пероксидазой и мышиных моноклональных антител против антигена F1.

Осаждение белков из грубых экстрактов антигена F1 осуществляли с помощью сульфата аммония с 30% насыщением. После инкубирования в течение 12 часов при 4°С образовавшийся осадок центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут, полученный осадок (осадок SA30) растворяли в буфере PBS и снова осаждали в изоэлектрической точке при рН 4.05±0.05 титрованием с использованием разбавленного раствора HCl. Полученные агрегаты отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 20 минут, растворяли в фосфатном буфере, а затем для подготовки к хранению полученные белки диализировали против деионизированной воды и лиофилизировали.

Определение количества белков в образцах с антигеном F1

Определение количества белков осуществляли методом Лоури. Раствор альбумина 1 мг/мл использовали в качестве стандарта.

Электрофорез образцов с антигеном F1

Электрофорез капсульного белка был произведен в 12.0% SDS-ПААГ методом Лемли (Laemmly). В качестве стандарта использовали белок F1 (Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии, Оболенск, Россия). Анализ с помощью электрофореза подтвердил, что очищенный образец F1 обладал такой подвижностью в геле, как и внутренний стандарт F1. Были получены препаративные количества антигена F1 из Y. pestis.

Пример 2. Накопление и характеристика мышиного моноклонального антитела к антигену F1 из Y. pestis

Иммунизация

Мыши линии Balb/c в возрасте 8 недель были трижды с интервалом в 2 недели внутрибрюшинно иммунизированы 50 мкг антигена. Для первой иммунизации использовали смесь 1:1 антигена и полным адъювантом Фройнда (complete Freund's adjuvant) в форме гомогенной эмульсии. Антиген для второй иммунизации был приготовлен похожим образом, но только с неполным адъювантом Фройнда. Третью, окончательную иммунизацию осуществляли с использованием 50 мкг антигена в буфере PBS.

Получение гибридом

Мыши были терминированы на 4-й день после третьей иммунизации, из них было извлечена кровь и получена сыворотка, которую использовали в качестве положительного контроля. Селезенку гомогенизировали, половину полученных лимфоцитов замораживали в жидком азоте с использованием 10% ДМСО, с использованием остальных лимфоцитов получали клетки, слитые с миеломой SP2/0, в соответствии со стандартным методом с применением 50% ПЭГ 4000.

Указанные клетки высевали в плашки с 96 лунками, содержащими питательную среду DMEM (Gibco, cat.No. 52100-039) с добавлением L-глутамина, пирувата натрия, гентамицина, HAT (100 мкМ гипоксантин, 0.4 мкМ аминоптерин, 16 мкМ тимидин) и 8% эмбриональной телячьей сыворотки. Сначала вносили в лунки суспензию клеток подкормки - перинатальных макрофагов, полученных путем промывки брюшной полости здоровой мыши. Рост первичной культуры определяли визуально с использованием микроскопа. По истечении 10-12 дней после гибридизации супернатанты из лунок проверяли на содержание специфических антител с использованием ELISA.

Первичные культуры из лунок, содержащие антитела, дважды клонировали с использованием метода ограниченных разведений в питательной среде DMEM с теми же добавками, за исключением HAT, на слой клеток подкормки. Проверку супернатантов осуществляли на 10-12 день. Если требовалось, положительные клоны переклонировали еще 1-3 раза, а затем определяли их изотипы с использованием EIA.

Получение асцитов

Выбранные клоны инокулировали в мышей, в которых предварительно ввели пристан (Pristane). Асциты выделяли на 7-10 день после инокуляции клетками.

Очистка моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis

Асциты (20 мл) разводили в буфере MES (150 мМ хлорид натрия, 50 мМ 2-[N-морфолино]этансульфоновая кислота, рН 5.7) в соотношении 1:4 и наносили на колонку Protein G-column (Protein G-Sepharose 4B Fast Flow (Pharmacia, 17-0618-03)). Выход мышиного изотипа IgG1 составлял 3.8 мг/мл асцитов. После очистки степень чистоты антител проверяли в SDS-ПААГ и с помощью иммунореактивности (непрямой метод ELISA). Чистота антител была около 95%.

В соответствии результатами иммуноблотинга (Фиг.1) антитела F19 специфически окрашивали одну полосу в образце F1, полоса с высоким молекулярным весом соответствует димеру F1.

Проверка кросс-реактивности с антигенами F. tularensis, В. anthracis PA и SP, Т. gondii, Salmonella О Ag, Legionella pn., VAg Y. pestis, SEB, E.coli была отрицательной.

Иммунореактивность очищенных антител

Иммунореактивность антител проверяли непрямым методом ELISA с использованием антигена F1 из Y. pestis (покрытие F1 - 5 мкг/мл в 0.1 М карбонатном буфере, антитела - 1 мкг/мл, конъюгат - мышиные анти-IgG, субстрат - 3,3',5,5'- тетраметил-[1,1'-бифенил]-4,4'-диамин (ТМВ). Данные были получены на многоканальном фотометре "Multiscan" при длине волны 450 нм. Результаты показаны на Фиг.2. Указанные моноклональные антитела демонстрировали высокую специфическую активность и чувствительность до 0.5 нг/мл.

Определение константы диссоциации для антител против антигена F1 из Y. pestis Константу диссоциации определяли методом Клотца (Klotz I.M., The Proteins, Vol.1, eds H.Neurath and K.Bailey, Academic Press, New York, 1953, p.727) в модифицированном варианте B.Friguet, A.F.Chaffotte, L.Djavadi-Ohaniance и M.E. Goldberg (Journal of Immunological Methods, 77 (1985), 305-319).

Для восстановления равновесия в системе антитело-антиген плашки, которые предварительно блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), покрывали 50 мкл раствора антигена F1 в буфере PBS-AT в концентрациях 10-8 и 10-9 M, 3 ряда для каждой, и титровали серийными разведениями по 1/2. Затем все лунки из этих 6 рядов покрывали 50 мкл антител в выбранной концентрации. Стандартные растворы антител 1; 0,8; 0,5; 0,2; 0,1 вносили в 3 ряда той же плашки, где 1 соответствовала концентрации антител для покрытия слоем оттитрованного антигена, несколько лунок покрывали 50 мкл антитела для определения Ао (оптическая плотность без антигена). Все лунки, содержащие антитела, также были покрыты слоем 50 мкл буфера PBS-AT (0.05 М фосфатный буфер (рН 7,5) с добавлением 0,2% БСА и 0,1% Tween 20). Инкубацию проводили в течение 2 часов при комнатной температуре в мешалке. После инкубации содержимое всех лунок переносили на чашку, предварительно покрытую слоем антигена концентрации 5 мкг/мл в буфере PBS. Инкубацию проводили в течение 1 часа, чашки отмывали буфером PBS-T (0.05 М фосфатный буфер (рН 7,5) с добавлением 0,1% Tween 20) и покрывали слоем анти-мышиного IgG конъюгата. После 1 часа инкубации чашку омывали и наносили ТМВ, по истечении 20 минут получали результаты путем измерения на многоканальном фотометре "Multiscan" при 450 нм. Если стандарты антител имели линейные значения, эксперименты считались действительными. Ao рассчитывали как среднее значение во всех лунках, в которых антитела были нанесены без антигена. Результаты были представлены на Фиг.2. Константы диссоциации определяли на основе калибровочной кривой.

мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588

мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588

Таким образом, Kd для моноклональных антител к антигену F1 из Y. pestis равно 4,5×10-9 M.

Пример 3. Изучение in vivo нейтрализующей активности мышиных моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis по способности к протекции животных от вирулентного штамма Y. pestis F1 (+).

Изучение способности мышиных антител против антигена F1 из Y. pestis к протекции мышей от вирулентного штамма Y. pestis F1 (+) проводили in vivo. Антитела вводили в мышей внутривенно перед и после заражения. Способность антител к протекции оценивали, сравнивая LD50 (с антителами) и LD50 (без антител). Параметр "средняя продолжительность жизни" оценивали в случае минимальной разницы значений LD 50.

Мыши М. musculus Balb/c (18-20 г, десять в каждой экспериментальной группе) были подкожно инокулированы штаммом Y. pestis 231(F1+) (Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии, Оболенск, Россия) дозой в 30 клеток в 0.2 мл физиологического раствора на одну мышь. Обработку антителами проводили за 2 часа перед заражением. Антитела в дозировке, равной 1 мг (в 0,2 мл физиологического раствора) на одну мышь, вводили в брюшную область. Эффективность лечения оценивали по времени выживаемости животным в течение 21 дня и по количеству погибших животных. Специфику гибели определяли путем выделения единиц образования колоний (cfu) Y. pestis из органов после препарирования. Результаты представлены в Таблице.

Таблица
Антитела для лечения Погибшие мыши / общее число мышей Выжившие мыши, % Средняя продолжительность жизни, дни
Mab анти F1 C1 F19 2/1080 14
Mab Va5310/10 09,2
Mab Va68 10/100 9,2
Mab Va6710/10 06,0
Mab Va49 8/1020 6,5
Mab Va22410/10 0 6,0
Mab Va5210/10 08,0
Mab Va48 8/1020 6,5
Контроль 10/10 04,6

Выжившие животные на 21-й день после инфицирования распределились на три группы, получавшие иммунотерапию с антителами Mab анти F1 C1 F19, анти VAg C1 Va48 и Va49. В первом случае терапевтический эффект был высоким: 80% мышей выжило, в других случаях - только 20%. Необходимо отметить, что бактериологические исследования органов и крови выживших мышей на присутствие культуры Y. pestis 231 дало негативные результаты. Все погибшие животные содержали specific специфическую культуру патогена чумы. Кривые смертности мышей как в экспериментальной, так и в контрольной группах представлены на Фиг.4.

Таким образом, результаты испытаний показали, что Mab "анти F1 C1 F19" оказались высокоэффективными в протекции мышей против заражения вирулентным штаммом Y. pestis F1 (+).

Пример 4. Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты мышиных моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis, используя мРНК из подходящих линий клеток в качестве матриц.

Тотальная РНК была очищена из 1×107 клеток подходящих гибридом, содержащих антитела согласно настоящему изобретению Mab анти F1 C1 F19. Клетки (107 клеток) два раза промывали однократным буфером PBS. В пробирку со 100 мкл клеток добавляли 400 мкл раствора GTB (4 М гуанидинтиоцинат, 30 мМ цитрат натрия, 1% N-лаурилсаркозил натрия, 120 мМ мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 -меркалтоэтанол). Клетки суспендировали пипетированием в течение 2-3 минут и помещали на лед. Затем добавляли 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5.2) и 500 мкл фенола, насыщенного водой, и полученную суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex. Затем добавляли 100 мкл смеси хлороформ - изоамиловый спирт и суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex в течение 1 мин с перерывами в 1 минуту. Суспензию откручивали в течение 10 мин и супернатант переносили в новую пробирку. Процедуру повторяли. Добавляли равный объем изопропанола (500 мкл) и хранили при -20°С. Образец откручивали в течение 10 минут, осадок промывали этанолом (70%) и растворяли в воде (50 мкл). Выделили в целом 7.5 мкг РНК (0.15 мкг/мкл), которые использовали для дальнейшего синтеза кДНК.

кДНК синтезировали с использованием набора RevertAidмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) в соответствии с "протоколом синтеза кДНК, подходящего для ПЦР", рекомендованного производителем.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь.

Для того чтобы идентифицировать пару праймеров, пригодных для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь, проводили ПЦР для клонирования с использованием ДНК полимеразы Tag (реакционная смесь содержала 10X буфер для ДНК полимеразы Tag (67 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°С), 166 мМ (Nh5)2SO4, 100 мМ 2-меркаптоэтанола)+20 мМ MgCl2, 1.25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), ДНК полимераза Taq (2.5 U), кДНК 1 мл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Тотальную кДНК использовали в качестве матрицы. Программа ПЦР была следующей: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты; в конце 72°С в течение 10 минут.

5'-Концевой праймер соответствовал набору из 16 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO:5-20), узнающих 95% последовательностей сигнальных пептидов в генах, кодирующих тяжелую цепь, выложенных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Perry, Н. 1991. Sequences of proteins oflmmunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3'-концу тяжелой цепи фрагмента Fab (IgG1), с введенным на 5'-конец сайтом XhoI использовали праймер А26 (SEQ ID NO:21). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров (SEQ ID NO:16 и 21) приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 700 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена тяжелой цепи IgG Mus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего легкую цепь.

Ранее было показано, что изучаемое антитело содержит легкую цепь типа каппа. На основании этих данных в качестве 5'-концевого праймера использовали набор из 23 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO:22-44). Этот набор узнает 95% последовательностей, соответствующих сигнальным пептидам в генах, кодирующих каппа-цепь, опубликованных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Perry, Н. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3'-концу тяжелой цепи фрагмента Fab (IgG1), с введенным на 5'-конец сайтом XhoI использовали А31 (SEQ ID NO:45). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров (SEQ ID NO:39 и 45) приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 700 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена легкой цепи IgG Mus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.

Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты антител против антигена F1 из Y. pestis

Pfu ДНК полимеразу (Fermentas) использовали для клонирования генов, кодирующих цепи антитела. Условия ПЦР оптимизировали подбором температуры отжига и концентрации Mg 2+ (реакционная смесь содержала 10Х буфер для Pfu ДНК полимеразы (200 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°С), 100 мМ (Nh5 )2SO4, 100 мМ KCl, 1% Тритон Х-100, 1 мг/мл БСА)+20 мМ MgCl2, 1.25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), Pfu ДНК полимераза (1.25 U), кДНК 1 мкл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Каждый их продуктов двух независимых ПЦР элюировали из агарозного геля и фосфорилировали с использованием Т4 ДНК полинуклеотидкиназы. Программа для ПЦР была следующая: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 2 минут; в конце 72°С в течение 10 минут. Полученные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pUC18, линеаризованный рестриктазой SmaI. Рекомбинантные плазмиды, содержащие гены тяжелой и легкой цепей Fab указанного антитела, выделяли и назвали pUC18-F1-H и pUC18-F1-L, соответственно.

Пример 5. Секвенирование фрагментов генов, кодирующих вариабельные части Fab-фрагмента мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis.

Рекомбинантная плазмида pUC18-F1-Н, содержащая независимый фрагмент ПЦР, кодирующий тяжелую цепь антитела против антигена F1 из Y. pestis, и плазмида pUC18-F1-L, содержащая независимый фрагмент ПЦР, кодирующий легкую цепь указанного антитела, выделяли и фрагменты ПЦР секвенировали в обоих направлениях. Использовали стандартные праймеры для секвенирования SEQ ID NO:46 и 47. В соответствии с результатами WAMPredict (https://antibody.bath.ac.uk/WAMpredict.html), канонические классы гипервариабельных петель следующие: CDR-L1 - 1, CDR-L2 - 1, CDR-L3 - 1, CDR-h2 - 1, CDR-h3 - 2, CDR-h4, Длина: 6, Статус перегиба: Изогнуты.

Пример 6. Конструирование экспрессионной системы для продукции Fab фрагмента мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis и получение указанного антитела в дрожжах.

Конструирование экспрессионных кассет.

Гены, кодирующие цепи Fab фрагмента мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis, амплифицировали с помощью ПЦР для их введения в экспрессионные кассеты. Плазмиды pUC18-F1-L и pUC18-F1-H использовали в качестве матриц.

Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный домен легкой цепи, использовали 5'-праймер Lf (SEQ ID NO:48) и 3'-праймер Lr (SEQ ID NO:50. 5'-Праймер Lf содержит на 5'-конце сайт рестрикции XhoI, необходимый для дальнейшего присоединения к сигнальной последовательности мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 -фактора, 3'-праймер Lr содержит на 5'-конце сайт рестрикции XbaI. Фрагмент ДНК XhoI - XbaI с легкой цепью лигировали в модифицированную плазмиду pPICZмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 A (Invitrogen), в которой сайт рестрикции PmeI был разрушен методом сайт-направленного мутагенеза.

Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный домен тяжелой цепи, использовали 5'-праймер Hf (SEQ ID NO:51) и 3'-праймер Hr (SEQ ID NO:53). 5'-Праймер Hf содержит на 5'-конце сайт рестрикции XhoI, необходимый для дальнейшего присоединения к сигнальной последовательности мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 -фактора, 3'-праймер Hr содержит на 5'-конце сайт рестрикции XbaI. Фрагмент ДНК XhoI - XbaI с тяжелой цепью лигировали в оригинальную версию плазмиды pPICZмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 A.

Объединение генов

Объединение генов обеих цепей фрагмента Fab на одной плазмиде осуществляли путем двойного расщепления вектора с легкой цепью рестриктазами BglII и BamHI с последующим введением в уникальный сайт BamHI вектора с тяжелой цепью.

Таким образом был сконструирован экспрессионный вектор pPICZмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 A-F1-mouse-H-L, содержащий последовательности, кодирующие обе цепи фрагмента Fab мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis, каждая из которых непосредственно соединена в одной рамке считывания с сигнальной последовательность мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 -фактора из Saccharomyces cerevisiae под контролем промотора АОХ1 (Фиг.8).

Получение трансформантов дрожжей и анализ продукции Fab.

Экспрессионную плазмиду pPICZмышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 A-F1-mouse-H-L, линеаризованную с помощью рестриктазы PmeI, вводили в клетки GS115 в соответствии с протоколом INVITROGEN с помощью методики, использующей L1C1. Полученные трансформанты обозначили как GS115/AOX-F1-mouse-H-L.

12 независимых трансформантов клонов GS115/AOX-F1-mouse-H-L выращивали в пробирках (V=4 мл) в течение 45 часов при 30°С и рН 6.0 с использованием питательной среды BMMY (Invitrogen) (конечная оптическая плотность OD 40). Измерение количества фрагментов Fab в культуральной жидкости было произведено методом ELISA. В соответствии с результатами этого метода отбирали штаммы, продуцирующие фрагмент Fab мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis. Отобранные клоны штаммов-продуцентов GS115/AOX-F1-mouse-H-L выращивали в колбах (V=100 мл) в течение 45 часов при 30°С и рН 6.0 на среде YPM.

Культуральные жидкости штаммов-продуцентов анализировали с помощью Вестерн-блотинга. Полученные результаты представлены на Фиг.9. Из этих данных специалист может сделать заключение, что некоторые штаммы-продуценты GS115/АОХ-F1-mouse-H-L секретируют в культуральную жидкость белки, которые могут быть детектированы за счет взаимодействия с анти-мышиными антителами с использованием Вестерн-блотинга. Предположительно эти белки являются отдельными цепями фрагмента Fab мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis.

Метод ELISA для анализа фрагментов антител в культуральной жидкости:

- Сорбция белков культуральной жидкости 100 мкл на лунку в течение 2 часов при комнатной температуре;

- Промывка лунок три раза буфером PBS;

- Блокировка 3% БСА в PBS (200 мкл на лунку) в течение 2 часов при комнатной температуре;

- Промывка лунок три раза буфером PBS с 0,05% Tween 20;

- Инкубирование с козьими анти-мышиными антителами;

- Промывка 5 раз буфером PBS с 0,05% Tween 20;

- Добавление о-фенилендиамина 100 мкл (4 мг/10 мл) с h3O2 в буфере рН 5.0;

- Остановка реакции добавлением 100 мкл 10% h3SO4.

Пример 7. Характеристика аффинности фрагментов Fab мышиных моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis, произведенных дрожжами.

Продукция и характеристика природного мышиного фрагмента Fab из MoAb F19. Протеолиз MoAb F19 проводили пепсином в соотношении 1:100 к тотальному IgG в присутствии 10 мМ цистеина в течение 20 часов при 37°С, в результате бы получен фрагмент Fab. Как следует из данных электрофореза, полученный препарат содержал определенное количество других продуктов гидролиза, которые затрудняли определение количества фрагмента Fab, поэтому очистку успешно осуществили методом гель-фильтрации на колонке с Sephadex G50. Анализ 4 полученных фракций приведен на Фиг.10. Все 4 фракции содержали как фрагменты Fab, так и фрагменты Fab'. Фрагменты Fab, преобладающие в четвертой фракции, выбрали для последующих экспериментов.

Разработка метода ELISA для оценки количества рекомбинантного фрагмента Fab.

Для разработки метода ELISA для детекции рекомбинантного фрагмента Fab была предпринята попытка использовать конъюгат с «хвостом» анти-His6, которая не увенчалась успехом из-за неполной доступности всех 6 гистидинов для связывания. Был приготовлен конъюгат с пероксидазой хрена и MoAb против мышиных Ig каппа-легких цепей. Для этого 0.5 мл асцитов MoAb против мышиных каппа-легких цепей, клон ЕМ-34.1 (Sigma, cat. No K-2132), очищали троекратным осаждением в сульфате натрия и конъюгировали с пероксидазой хрена. Природные мышиные фрагменты Fab MoAb F19 использовали в качестве стандарта. Результаты показаны на Фиг.11.

Определение констант диссоциации рекомбинантных и природных фрагментов Fab.

Константы диссоциации (Kd) определяли в ходе двухступенчатого метода ELISA, как описано в Примере 2. Результаты представлены на Фиг.12.

Таким образом, Kd для природного моноклонального фрагмента Fab природного мышиного антитела MoAb F19 против антигена F1 из Y. pestis составляет

мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588

Kd для рекомбинантного фрагмента Fab против антигена F1 из Y. pestis составляет

мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588

Таким образом был получен рекомбинантный фрагмент Fab, обладающий высокой специфичностью против антигена F1 из Y. pestis и высокой константой диссоциации.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы являются частью настоящей заявки, включенные путем ссылки.

мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588 мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis, патент № 2420588

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Изолированное мышиное антитело, селективно связывающееся с антигеном F1 из Yersinia pestis, отличающееся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи (VH) указанного антитела включает в себя последовательность аминокислот SEQ ID NO:1, а вариабельный домен легкой цепи (VL) указанного антитела включает в себя последовательность аминокислот SEQ ID NO:2.

2. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антитело по п.1.

3. Антигенсвязывающий фрагмент (Fab), селективно связывающийся с антигеном F1 из Yersinia pestis, который включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2.

4. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий фрагмент (Fab) по п.3.

5. Клетка дрожжей, трансформированная фрагментом ДНК по п.4 и обладающая способностью к продукции Fab по п.3.

6. Клетка дрожжей по п.5, отличающаяся тем, что указанными дрожжами являются дрожжи Pichia pastoris.

7. Способ получения Fab по п.3, включающий в себя выращивание клеток дрожжей по п.5 в питательной среде и выделение указанного Fab из культуральной жидкости.

8. Способ детекции Yersinia pestis, включающий в себя: (а) получение образца от животного или человека; (b) взаимодействие указанного образца с антителом по п.1 или Fab по п.3; (с) детектирование комплекса, образованного указанным антителом или Fab, и антигена F1; и, необязательно, (d) определение количества антигена F1, присутствующего в указанном образце, на основании детектированного количества комплекса, образованного антителом и антигеном F1, или комплекса, образованного Fab и антигеном F1.

9. Набор для детекции антигена F1 из Yersinia pestis, содержащий изолированные моноклональные антитела по п.1 или Fab по п.3, которые селективно связываются с антигеном F1 из Yersinia pestis, и средства, позволяющие детектировать указанный антиген F1 с использованием указанного антитела или Fab.

www.freepatent.ru

Моноклональные антитела мыши

4.3. Замечания к различным стадиям процедуры гибридизации

1.  Важно, чтобы .плазмацитома находилась в логарифмической фазе роста. Нельзя допускать полного использования клетками культуральной среды. За день до слияния желательно сменить среду. Если есть опасения, что ко дню слияния клетки могут перерасти, то можно приготовить два или три флакона с клетками плазмацитомы в различной концентрации. Б этом случае вы можете выбрать для слияния наиболее подходящую культуру. Жизнеспособность клеток, о которой судят по исключению красителя, должна быть высокой. Клеточные суспензии обычно готовят непосредственно перед слиянием, но клетки можно оставить на два часа в H-RPMI — 2% СПК,при 4°С.

2. Спленоциты лучше получать, вымывая их из селезенки, чем измельчая или раздавливая орган в гомогенизаторе. В первом случае получают листые однородные суспензии с высокой жизнеспособностью клеток. Клетки прекрасно сохраняют жизнеспособность в среде H-RPMI — 2% СПК на холоду. Это обеспечивает и более удобное (Последовательное приготовление двух селезенок. Иногда можно столкнуться с патологически измененной селезенкой, содержащей избыточное количество «леток гранулоцитарного или моноцитарног» ряда, что может быть причиной неудачной гибридизации.

3. Ореда RPMI-1640, используемая для промывания клеток, может быть заменена на среду Дюльбекко.

4.3.1. Замечания к процедуре А

1. Пробные тесты показали, что суспендирование клеток в щелочной среде RPMI-1640 (или среде Дюльбекко) представляет собой решающий этап для стадии слияния. По некоторым причинам слияние лучше происходит в щелочной среде и при этом благодаря кратковременности инкубации клетки не повреждаются. Распределение клеток по стенкам пробирки при ее вращении тоже повышает эффективность слияния, по-видимому, потому, что это гарантирует равномерное перемешивание и тесный контакт клеток. Не возникает необходимости в использовании бани на 37 °С в ламинарном боксе, но клетки следует держать при температуре около 37 °С.

2. Большинство авторов рекомендуют добавлять ПЭГ мед-ленно. Пробные тесты показали, что это не дает преимущества в случае методики А. Однако если, поместив ПЭГ на дно пробирки, попытаться распределить его в среде так, чтобы обеспечить контакт со всеми клетками, расположенными на стенках пробирки, то смешивание ПЭГа со средой происходит очень медленно. Тем не менее крайне важно, чтобы после слияния ПЭГ разбавляли медленно. Несколько порций среды, добавленные приблизительно с интервалом в 1 мин, создают условия, удовлетворяющие этому требованию. Быстрое же разбавление ведет к осмотическому повреждению клеток.

3. Обычно после слияния раскапывают по одной капле ресуспендированную клеточную смесь в пустые лунки и оставляют панели в тепле. Мы обнаружили, что целесообразно до внесения клеточной суспензии добавить в лунки по одной капле холодной 50%-ной лошадиной сыворотки. Это, по-видимому, подавляет рост «фоновых» клеток, в то же время не влияя на рост гибридом.

4.3.2. Замечания к процедуре Б

1.  При осуществлении этой методики не использовалась щелочная среда RPMI-1640 или Дюльбекко. Щелочные значения рН достигаются еще до стадии слияния промыванием клеток в свободной от сыворотки среде RPMI-1640, после чего клетки оставляют в очень небольшом объеме среды на 5 мин для достижения температуры 37 °С. За это время среда защелачивается.

2.  Крайне важно, чтобы после слияния разбавление ПЭГ происходило медленно. Цвет клеточного осадка после центрифугирования, следующего за процедурой слияния, служат индикатором осмотического повреждения клеток. Если осадок клеток значительно бледнее, чем исходной смеси спленоцитов и клеток плазмацитомы, то произошел некоторый лизис эритроцитов, а следовательно, и осмотическое повреждение гибридных клеток. Если клеточный осадок выглядит беловатым, то вероятность успешного слияния очень низка. В этом случае не имеет смысла вносить клеточную суспензию в лунки.

5. Селекция гибридом

Селекция гибридом, образующих специфические антитела, обычно происходит в два этапа. Сначала культуральную жид-кость анализируют на содержание антител, специфичных к данному иммуногену. Положительные супернатанты затем подвергают скринингу с использованием тест-панели антигенов, чтобы обнаружить, связываются ли выявленные антитела селективно с интересующим исследователя антигеном. Лунки с нужными гибридомами неизменно составляют только небольшой процент от общего числа лунок с растущими или антителопродуцирующими клетками. Важно идентифицировать нужные гибридомные клоны как можно скорее, в противном случае непроизводительно расходуются время и материалы для размножения большого числа бесполезных линий. Успех процедуры гибридизации для получения специфических антител в большой степени зависит от тщательного выполнения скрининга. Необходимо выявить данные антитела и отбросить ненужные клоны быстро и без сомнения.

Выбор используемой процедуры скрининга зависит от дальнейшего возможного использования моноклональных антител. Другими словами, если вы намерены получить моноклональные антитела, которые предполагаете использовать для лизиса клеток в присутствии комплемента, то и для скрининга следует использовать соответствующий тест (реакцию комплемент-зависимого лизиса). Подобно этому, если моноклональные антитела предполагается использовать в реакциях преципитации или для окрашивания заключенных в парафин препаратов тканей при иммуногистологических исследованиях, то именно эти методы и должны использоваться для скрининга гибридом. Тест, используемый для скрининга, в идеале должен удовлетворять следующим критериям:

1. Быть настолько простым, чтобы его мог успешно и уверенно проводить технический персонал лаборатории. Если используется простая тест-система, то более информативно собрать аликвоты со всей культуральной панели и, таким образом, отобрать положительные клоны на фоне контамини-рующих антител, продуцируемых выживающими клетками селезенки.

2. Тест необходимо по возможности автоматизировать для быстрого скрининга большого количества проб из лунок. Этого можно достичь, используя многоканальную пипетку (8 проб за один раз) и проводя тестирование в планшетах.

3. Чувствительность теста должна составлять менее 1-10 мкг антител в 1 мл. Учитываемые величины должны превышать фон не менее чем в 3 раза.

4. Результаты скрининга должны быть известны исследова-телю не позднее следующего дня, чтобы своевременно уделить внимание нужным клонам и предупредить перерастание клеток.

5. Важна достоверность результатов, поэтому процедура скрининга должна предусматривать постановку положительных и отрицательных контролей.

6. Если используют антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные флуоресцеином, пероксидазой или 1251 (антиглобулиновый реагент), то следует тщательно проверить их специфичность по отношению к чистым белкам соответствующих под¬классов (IgGi, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM).

7. С учетом того что в процессе скрининга исследуют большое количество проб, рекомендуется проводить скрининг, используя недорогостоящие реагенты и оборудование.

Помните, что необходимо отбирать для анализа супернатанты из лунок с хорошим ростом гибридом: такая проба будет содержать оптимальное количество антител. Очень простой радиоиммунологический метод может быть использован для тестирования адекватных уровней антител в супернатантах и для повседневного контроля за образованием антител в лунках [13]. Особую ценность данный метод приобретает в том случае, если наблюдается рост в большом числе лунок, а скрининг супернатантов еще не дает положительных результатов. Обнаружение с помощью антиглобулиновых реагентов значительных титров антител означает, что чувствительность первичного скрининг-теста недостаточна и его необходимо усовершенствовать. Если выявляют мышиные иммуноглобулины в незначительной концентрации, то необходимо подождать, пока гибридомные клетки вырастут, а затем взять повторные пробы для скрининга. Можно сконцентрировать анализируемые супернатанты, хотя обычно в этом нет необходимости.

Суммируя вышесказанное, можно утверждать, что тесты, обычно используемые в лаборатории при исследовании поликлональных сывороток с высокими титрами антител, могут быть адаптированы для скрининга гибридом. Некоторые из них могут оказаться довольно сложными; например, цель исследователя может заключаться в получении моноклональных антител, которые определяют по торможению функции в каком-либо биологическом тесте. При использовании сложных и продолжительных тестов целесообразно уменьшить количество анализируемых проб. Для идентификации антителопродуцирующих клонов может быть использована простая процедура скрининга мышиного иммуноглобулина, а затем уже только эти пробы вместе с отрицательным контрольным супернатантом исследуют более сложным путем. При получении антител к поверхностным клеточным антигенам мы обнаружили, что примерно в половине лунок с растущими клонами образуются мышиные иммуноглобулины, а примерно половина или более содержащих антитела супернатантов реагировала положительно с клетками, использовавшимися для иммунизации.

5.1. Процедуры скрининга при получении антител к антигенам клеточной поверхности и другим корпускулярным антигенам

Существует определенная схема выявления специфического связывания антител с антигеном. Клетки-мишени могут быть живыми, зафиксированными глутаровым альдегидом, высушенными на стекле или же присутствовать в замороженных гистологических срезах. Тест неизбежно является непрямым, и реагентом для второй стадии могут служить антимышиные иммуноглобулины овцы, козы или кролика, меченные флуоресцеином, ферментом или радиоактивным иодом. Обычно пробу (одну каплю) супернатанта добавляют к 0,5-106 клеток-мишеней в небольшом объеме в маленькой пластиковой пробирке или в лунке панели. После 30—60 мин инкубации при 4°С суспензию разбавляют, клетки осаждают центрифугированием, отмывают один раз и инкубируют в течение 30 мин при 4°С с соответствующими разведениями поливалентного антимышино-го иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином. Клетки вновь отмывают и регистрируют флуоресценцию непосредственно под флуоресцентным микроскопом или с помощью проточного цитофлуориметра системы FACS [14].

5.2.  Процедуры скрининга при получении антител к растворимым антигенам

Основные альтернативные тесты — это ELISA, РИА или реакция гемагглютинации. В первых двух случаях в лунках пластиковой панели для микротитрования адсорбируют антиген (1 ч) и затем отмывают остаток несвязавшегося антигена. Далее в каждую лунку вносят по одной капле исследуемого супернатанта. Инкубацию продолжают в течение 30 мин или ночи, после чего отмывают избыток антител и добавляют антиглобулиновый реагент к иммуноглобулинам мыши, конъюгированный с ферментом или радиоактивным иодом. Инкубацию продолжают в течение часа, затем вновь осуществляют процедуру отмывания и в зависимости от выбранного теста либо выявляют ферментативную активность (ELISA), либо измеряют уровень радиоактивности в лунках (РИА). 

В реакции пассивной гемагглютинации эритроциты нагружают антигеном с помощью хлорного хрома. Такие эритроциты хранят в стерильных условиях до употребления [15]. Реакция, заключается в следующем. Добавляют одну каплю супернатанта к одной капле 0,5%-ной суспензии нагруженных антигеном эритроцитов барана. Оставляют в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем оценивают результаты.

Если следуют процедуре гибридизации А и гибридомные клетки растут в лунках панели для микротитрования, то забор образцов для тестирования одновременно со всех панелей можно осуществлять с помощью многоканальной пипетки. Отобранные пробы переносят непосредственно в панель для микротитрования с круглодонными лунками. Когда все панели с пробами полностью укомплектованы, в каждую лунку добавляют по одной капле 0,5%-ной суспензии нагруженных антигеном эритроцитов барана. Конкурирующий агент может быть добавлен в буфер для разведения с целью проверки специфичности моноклональных антител. Например, если нужно отобрать моноклональные антитела к IgG2 человека, то используют эритроциты барана, нагруженные IgG2, a IgGi добавляют к буферу для разведения. В этом случае только те МКА, которые специфически распознают IgG2, будут агглютинировать нагруженные антигеном эритроциты барана, а МКА, которые связываются и с IGg2, и с IgGi, в основном взаимодействуют с избытком IgGi в буфере для разведения. Нужные клоны выращивают в культуре, как описано в разд. 6.

6. Клонирование линий гибридомных клеток

Моноклональность антител обеспечивается клонированием гибридом. Осуществляют ли клонирование непосредственно после слияния или же на более поздней стадии, в некоторой степени зависит от того, выращивались ли первичные гибридомные культуры в лунках панели для микротитрования (процедура гибридизации А) или в объеме 2 мл в лунках 24-х луночной, панели для культуры тканей (процедура гибридизации Б).

6.1. Процедура гибридизации А

Если клетки после слияния рассевают в лунки панели для микротитрования, то гибридомы, продуцирующие антитела нужной специфичности, затем пересаживают в 24 луночные панели для культуры тканей с объемом лунок 2 мл. Далее при образовании монослоя и окрашивания среды в желтый цвет, супернатант можно повторно тестировать, используя определенный набор антигенов. Если результаты тестирования удовлетворительные, то гибридому наращивают в нескольких лунках, затем в универсальных контейнерах и далее во флаконах постепенно возрастающего объема. К этому времени обычно уже происходит самопроизвольное клонирование клеток. Тот клон, который отличается наилучшим ростом (предполагаемый источник антител), постепенно получает преимущество над всеми другими в культуре.

Клонирование лучше всего проводить или на ранней стадии, чтобы не допустить вытеснения медленно растущего клона клетками быстрорастущих соседних клонов, или на конечной стадии, когда получена стабильная линия антителообразующих клеток. В последнем случае клонирование, как правило, лишь формально подтверждает моноклональность. Если до стадии продукции антител клонирования не проводили, то его необходимо осуществить позднее, в том числе и с уже клонированными линиями. Цель такого подхода-удаление непродуцирующих антитела клонов, которые иногда образуются после длительного культивирования. Если данные клоны не отделить в процессе последующего клонирования, то они могут постепенно вытеснить другие антителообразующие клоны. Некоторые линии чрезвычайно стабильны и не требуют повторного клонирования. У других гибридомных линий изменяются ростовые характеристики и антителообразующая активность. В этом случае иногда целесообразно повторное клонирование, но некоторым линиям свойственна нестабильность. Поэтому сразу после клонирования линии клеток следует немедленно заморозить (по меньшей мере 10 ампул) в жидком азоте. Ими можно будет воспользоваться, если клонированная линия окажется нестабильной при дальнейшем культивировании.

Чем эффективнее гибридизация, тем больше вероятность, что в каждой лунке вырастет более одного клона и что два клона со сходными темпами роста будут сосуществовать в одной лунке. Наличие двух и более клонов можно выявить по обнаружению в супернатанте антител более чем одной специфичности и более чем одного класса и подкласса, а также с помощью изоэлектрофокусирования (сложный спектр анализируемых антител). При получении соответствующего результата необходимо безотлагательное клонирование.

6.2. Процедура гибридизации Б

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридому продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее снижение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки. В таком случае важно отобрать антителообразующие гибридные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный, на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клонирование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью» лимитирующих разведений.

 

6.3. Клонирование клеток в полужидком агаре

Для этой процедуры клонирования необходимы следующие материалы:

1. Клетки гибридомы (3-105 клеток в 1 мл полной среды ГАТ).

2. Среда ГАТ, содержащая 50 мкМ 2-меркаптоэтанола. Дер-жат в водяной бане на 44 °С.

3. 3%-ный и 5%-ный растворы бактоагара, приготовленные на 0,9%-ном растворе NaCl. Агар автоклавируют небольшими порциями.

4. Чашки Петри диаметром 5 см для работ с клеточными культурами. Процедура клонирования описана в табл. 3.2.

Таблица 3.2. Процедура клонирования клеток в полужидком агаре

1.  Расплавленный при 100 °С в сосуде с кипящей водой агар помещают в водяную баню на 44-45 °С. При обращении с горячим агаром соблюдают осторожность.

2.  Разбавляют 5%-ный агар средой ГАТ до конечной концентрации 0,5% (1 : 10), хорошо перемешивают и помещают в водяную баню на 44 °С. Удобно одновременно готовить раствор агара на три чашки Петри (1,5 мл рас¬твора агара +13,5 мл среды).

3.  Пипеткой наслаивают на дно 9 чашек Петри (диаметр 5 см) по Ъ мл 0,5%-ного агара. 

Дают агару застыть.

4. Разбавляя 3%-ный агар, готовят 9 аликвот по 5 мл 0,3%-ного раствора агара в среде ГАТ и держат их в водяной бане на 44 °С.

5.  Одну или две капли суспензии гибридомных клеток тщательно смешивают с аликвотами 0,3%-ного агара, хорошо перемешивают и распределяет ровным слоем по поверхности 0,5%-ного агара. Для каждой дозы гибридных клеток готовят по три чашки.

6. Складывают чашки в чистый пластиковый сандвич-бокс, р. который помещены чашки Петри, наполненные стерильной дистиллированной водой. Это обеспечивает влажную атмосферу в боксе. Переносят бокс с негерметично закрытой крышкой в С02-термостат с увлажнителем. Дают возможность воздуху в боксе прийти в равновесное состояние с атмосферой термостата, содержащей 5% С02, закрывают крышку бокса и оставляют на 10—14 дней.

7. На 10-14-й день с помощью пастеровских пипеток собирают колонии и переносят их в лунки панели для микротитрования.

8.  После образования монослоя тестируют супернатанты на содержание антител. Одновременно удаляют всю среду и заменяют ее свежей средой ГАТ.

9. Отобранные положительные клоны наращивают сначала в панелях для микротитрования, затем в лунках панели для культуры тканей объемом 2 мл и, наконец, в небольших флаконах порциями в стеклянных универсальных контейнерах и хранят при 4 °С;

10.  Замораживают для хранения в жидком азоте по меньшей мере 10 ампул с образцами клеток клонированной линии.

6.4. Клонирование клеток методом лимитирующих разведений

Если гибридомные клетки выращивали в панелях для кульуры тканей с объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лунках, в которые предварительно засеяли по одной клетке, может быть просто проконтролировано. Метод лимитирующих разведений легко воспроизводится. Он позволяет избежать проблем, связанных с технологией приготовления агара, когда эффективность клонирования часто зависит от качества агара и его консистенции.

Метод лимитирующих разведений -это трехстадийная процедура. Поэтому для получения клонированных клеточных линий с его помощью требуется больше времени.

6.4.1.   Первая стадия метода лимитирующих разведений

В процессе клонирования необходимо отобрать наиболее жизнеспособные, хорошо растущие гибридомы с высоким уровнем продукции антител. Цель первой стадии-отделить субкультуру, характеризующуюся более высоким уровнем продукции антител, от первоначальной культуры, которую выращивают в лунках объемом 2 мл.

1. Помещают клетки гибридомы, взятые из первоначальной культуры, в панель для микротитрования из расчета 100 клеток на лунку в 200 мкл среды ГАТ (5-102 клеток в 1 мл).

Используют 48 центральных лунок панели (6 рядов по 8 лу¬нок каждый). Лунки, расположенные по периферии панели, заполняют средой RPMI-1640, содержащей антибиотики (для предотвращения испарения влаги и концентрирования среды ГАТ в лунках, содержащих клетки).

2. Инкубируют панель в С02-термостате с увлажненным воздухом.

3. Спустя приблизительно 7 дней, когда клетки в лунках практически образуют монослой, исследуют супернатанты на содержание антител. Целесообразно протестировать неразбавленный супернатант и, если возможно, одно или два разведения (1 :4 и 1 : 16). Из тех лунок, где антитела содержатся в наиболее высоких титрах, отбирают для клонирования единичные, наиболее жизнеспособные и хорошо растущие клетки. Выбирают две лунки, из которых клетки рассевают на второй стадии метода лимитирующих разведений.

 

6.4.2.   Вторая стадия метода лимитирующих разведений

Цель этой стадии — отобрать линии гибридных клеток, образовавшиеся из одной клетки, и осуществить рассев гибридом на фидерный слой клеток селезенки.

1. Готовят суспензию спленоцитов (как описано для процедур гибридизации) за день до постановки   эксперимента по клонированию и ресуспендируют клетки (106 клеток в 1 мл среды ГАТ, содержащей 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).

2. Оставляют клетки селезенки в универсальном контейнере на ночь при комнатной температуре в ламинарном боксе для стерильных работ. Преимущество этой процедуры заключается в том, что она позволяет экспериментатору на следующий день проверить спленоциты под микроскопом и убедиться, что они не загрязнены. Вероятно, это подавляет и рост фоновых клеток селезенки в лунках, где проводят клонирование.

3. Подготавливают две панели для микротитрования следующим образом. Опять используют только 48 центральных лунок панели (6 рядов по 8 лунок), а расположенные по периферии заполняют средой RPMI-1640, содержащей антибиотики. В 8 лунок первого ряда добавляют по 100 мкл полной среды ГАТ. В 8 лунок каждого ряда (со 2-го по 6-й) добавляют по 100 мкл суспензии клеток селезенки в концентрации 105 клеток на лунку.

4. Помещают обе панели в С02-термостат на время, необходимое для приготовления последовательных разведений гибридных клеток. Очень важно приготовить разведения и поместить их в панели как можно скорее. Если клетки оставить на длительное время в суспензии (в которой число клеток невелико), то они потеряют свою жизнеспособность. Две панели с повторными разведениями готовят, используя клетки двух выбранных лунок первой панели. Серии разведений двух популяций клеток гибридомы готовят последовательно и отбирают клетки из лунок первой панели по мере необходимости.

5. Готовят суспензии клеток в полной среде ГАТ: 1 мл суспензии с концентрацией 103 клеток в 1 мл, 1 мл суспензии с концентрацией 102 клеток в 1 мл, 1 мл суспензии с концентрацией 50 клеток в 1 мл, 2 мл суспензии с концентрацией 10 клеток в 1 мл и 1 мл суспензии с концентрацией 5 клеток в 1 мл. Следует заметить, что готовят последовательные разведения клеток, поэтому начать необходимо приблизительно с 1,5 мл суспензии с концентрацией 103 клеток в 1 мл.

6. Достают одну из приготовленных панелей для микротитрования из термостата. В каждую из восьми лунок первого ряда, который содержит только среду ГАТ, добавляют по 100 мкл суспензии с концентрацией 103 клеток в 1 мл. Таким образом, эти лунки содержат по 100 клеток, что обеспечивает постоянный запас клеток, отбираемых из панелей с первым разведением. В лунки второго ряда добавляют по 100 мкл суспензии с концентрацией 102 клеток в 1 мл, поместив таким образом по 10 клеток на лунку. Второй и все -последующие ряды содержат фидерный слой клеток селезенки. В лунки третьего ряда добавляют по 100 мкл суспензии с концентрацией 50 клеток в 1 мл (5 клеток на лунку), в лунки четвертого и пятого ряда — по 100 мкл суспензии с концентрацией 10 клеток в 1 мл (1 клетка на лунку) и в лунки шестого ряда — по 100 мкл суспензии с концентрацией 5 клеток в 1 мл (1 клетка на каждые две лунки). Конечная концентрация 2-меркаптоэтанола в лунках, содержащих спленоциты и гибридные клетки, составляет 60 мкМ.

7. Переносят панель в С02-термостат и повторяют описанную процедуру для второй лунки с клетками, выбранной на панели с первыми разведениями.

8. Меняют в лунках среду, если она в результате роста колоний закислилась. При этом следует соблюдать осторожность, чтобы не нарушить клеточный слой, поскольку гибридные клетки будут затем расти на фидерном слое спленоцитов в виде отдельных колоний. При смене среды необходимо избегать перекрестной контаминации лунок.

9. Через 10—14 дней гибридные клоны следует осмотреть невооруженным глазом, а затем более тщательно, с помощью инвертированного микроскопа под малым увеличением, чтобы различить отдельные белые пятна в лунках. Записывают число колоний, растущих в каждой лунке. Лучше отбирать колонии, выросшие в тех лунках, которые засевали из расчета 1—0,5 клеток на лунку. Однако если эффективность роста данной линии низка, то, возможно, придется выбирать клон из лунок, в которые было посеяно по 10—5 клеток на лунку, при условии присутствия в лунке только одного клона.

10. Когда колонии ясно видны невооруженным глазом, они обычно достаточно большие, чтобы проверить их антителообразующую активность. На. этой стадии проверяют супернатанты

со всей панели. Затем снова, если возможно, проверяют неразбавленный супернатант, а также одно или два разведения. Отбирают три отдельные колонии, которые продуцируют высокие титры антител. Предпочтительно выбирают колонии из тех рядов, в которые изначально клетки были рассеяны из расчета 1 или 0,5 клеток на лунку.

 

6.4.3. Третья стадия метода лимитирующих разведений

Чтобы быть уверенными, что данные клоны получены из одной клетки, а не из двух, целесообразно повторить описанную выше процедуру второй стадии метода лимитирующих разведений для каждой из трех отобранных колоний. Повторение процедуры клонирования единичных клеток имеет и то преимущество, что при проверке индивидуальных колоний, полученных после третьей стадии процедуры лимитирующих разведений, они все должны продуцировать антитела. Таким образом, гибридомная линия, которую в конечном итоге наращивают до значительных объемов, — это линия, которая образовалась из одной клетки. Целесообразно пересадить три отдельные коло¬нии после осуществления второй стадии метода лимитирующих разведений, поскольку одна или две колонии могут отличаться низкой эффективностью роста. Перенеся три колонии, вы можете быть уверены, что нарастите достаточно клеток для анализа на третьей стадии метода лимитирующих разведений.

Колонии, возникшие из одной единственной клетки, выращенные на третьей стадии и проанализированные на секрецию антител, переносят в новые панели для микротитрования. При известных обстоятельствах предпочтительно сначала вести ли-нию в лунках панели для микротитрования, затем в 2-мл лунках и далее, наконец, в небольших флаконах. По крайней мере 10 ампул следует заморозить в жидком азоте для хранения.

6.4.4. Замечания по процедуре разаедения

На первый взгляд кажется, что описанная выше процедура требует много времени. Результат оказывается наиболее хорошим, если проверяют одно или два разведения супернатанта из каждой лунки и, таким образом, оценивают титр антител. Соответственно в процессе клонирования могут быть отобраны клетки, продуцирующие возрастающее количество антител. В нашей лаборатории с целью отбора проб для приготовления разведений в нестерильных панелях для микротитрования, а также последующего переноса проб в панели для проведения РИА мы используем многоканальную пипетку. Благодаря этому исследование 48 проб из каждой панели занимает совсем немного времени. Имея соответствующие навыки, процедуру лимитирующих разведений можно осуществить за короткое время.

Очень важно детально описывать все этапы культивирования клеток и регистрировать содержание антител в культуральной жидкости во время роста гибридом и по ходу экспериментов по клонированию.

7. Выделение антител из культурального супернатанта и из асцитной жидкости

Моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомной технологии, можно выделять из двух источников.

7.1. Культуральная жидкость

Культуральная жидкость не содержит других мышиных иммуноглобулинов, кроме моноклональных антител, но, разумеется, содержит большое количество белков СПК. Концентрация антител в культуральной жидкости обычно составляет несколь-ко мкг в 1 мл. Для получения чистых моноклональных антител все большее применение находят современные бессывороточные культуральные среды.

Для достижения оптимального содержания антител в культуральной жидкости гибридомные клетки растят до высокой плотности (культуральная среда становится при этом желтой). Однако важно не допустить того, чтобы клетки росли до такой степени, чтобы возникла угроза снижения их жизнеспособности и наступила гибель клеток. Культуры гибридных клеток, содержащие высокий процент нежизнеспособных клеток, часто трудно восстановимы и их приходится выбрасывать. Культуральную жидкость собирают и затем центрифугируют при 500 g в течение 5 мин для удаления клеток. Культуральную жидкость, собранную из нескольких флаконов с одной гибридомной линией и полностью освобожденную от клеток, сливают в чистые стеклянные бутыли. Чтобы запасти достаточное количество культуральной жидкости для собственных нужд и снабдить им других исследователей, авторы рекомендуют приготовить 500 мл культуральной жидкости, содержащей 0,1% азида натрия. Так, ее можно хранить при 4°С. Большинство антител в такой культуральной жидкости стабильно. Контролируя содержание антител ее можно использовать в течение нескольких лет.

7.2. Асцитная жидкость, полученная в результате интраперитонеальной инъекции гибридных клеток мышам

1. За 1—3 нед до инъекции клеток гибридомы, выращенных в культуре, мышам линии BALB/c, в возрасте 3—4 мес, проводят интраперитонеальную инъекцию 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекана; Koch-Light, Великобритания).

2. Каждой мыши вводят по меньшей мере 106, а желательно по 107 клеток в PBS. Гибридома растет в виде асцитной опухоли, и асцитная жидкость содержит антитела в концентрации, приблизительно в 10—500 раз превышающей таковую в культуральной жидкости (концентрация антител в асцитной жидкости составляет несколько мг в 1 мл).

3. Для того чтобы собрать асцитную жидкость, мышь забивают дислокацией шейных позвонков. Делают надрез таким образом, чтобы обеспечить доступ в перитонеальную полость, и дренируют ее пастеровской пипеткой, отбирая асцитную жидкость.

4. Центрифугируют асцитную жидкость (при высоком числе оборотов в минуту) для удаления клеток и клеточного дебриса. Супернатант лучше всего хранить при —20 °С, разлив на аликвоты по 1 мл, либо в большом объеме, если антитела1 будут подвергать дальнейшей очистке.

Разумеется, асцитная жидкость загрязнена другими иммуноглобулинами мыши. Содержание примесей зависит от чистоты содержания животных. Предпочтительно использовать мышей, свободных от видоспецифических патогенных возбудителей, если таковые доступны. Степень загрязнения антител увеличивается и при значительном излиянии крови в асцитную жидкость. Некоторые гибридомы хорошо растут в брюшной полости. Другие же линии, образующие достаточное количество антител в культуре, in vivo продуцируют мало антител, несмотря на хороший рост в виде асцитных опухолей. Некоторые гибридомы формируют солидные опухоли или метастазы. Иногда, еще не достигнув значительного роста, такие опухоли служат причиной гибели хозяинаносителя.

8. Контроль качества: клеточные линии и препараты антител

Первостепенное значение для осуществления контроля ка-чества имеет создание запаса замороженных гибридомных кле-точных линий с указанием даты заморозки. Следует замораживать образцы культивируемых клеток на каждой фазе роста. Образцы асцитных жидкостей следует замораживать с обозначением номера каждого пассажа.

8.1. Замораживание клеток

Ниже представлена простая и эффективная технология за-мораживания.

1. Используют клетки хорошо делящейся, здоровой культуры. Центрифугируют в специальном контейнере приблизитель¬но по 107 клеток на каждую ампулу, которая будет заморо¬жена.

2. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки (в концентрации 1 -107 клеток в 1 мл) в 1 мл холодной СПК, содержащей 5 % диметилсульфоксида. Смесь для замораживания следует приготовить заранее и хранить при —20°С, разлив на аликвоты.

3.         Переносят суспензию клеток в маленькие полипропилено-вые ампулы, которые подписывают, используя несмываемый карандаш, с указанием кода замораживаемой линии и даты.

4.         Помещают замораживаемые ампулы в большую коробку из полистирола с толщиной стенок приблизительно 2—3 см, снабженную крышкой. Коробку переносят в морозильник на —20 °С и оставляют на 30 мин. Подходящими для заморажи¬\

вания контейнерами служат маленькие коробки, в которых лаборатории получают легкобьющиеся материалы. Объемные полистироловые контейнеры обеспечивают медленное охлажде¬ние ампул с клетками (идеально 1 °С в мин) до температуры —20 "С.

5. Спустя 30 мин переносят коробку в морозильник на —70 "С и оставляют либо на 6 ч, либо на ночь. Затем ампулы переносят в контейнер с жидким азотом для хранения.

Согласно альтернативной методике замораживания, поли-пропиленовые пробирки переносят в 50%-ный глицерин, охлаж-денный до —32 °С. Спустя 40 мин пробирки извлекают, проти-рают тканью и переносят непосредственно в контейнер с жид¬ким азотом.

8.2. Размораживание клеток

1.         Чтобы восстановить культуру, нужно быстро разморозить пробирки, держа их в струе горячей воды из крана и легко по-качивая до тех пор, пока лед в пробирке почти не исчезнет.

2.         Клетки переносят в универсальный контейнер и затем медленно, по каплям, добавляют 2 мл теплой (37 °С) среды H-RPMI.

3.         Закрывают контейнер крышкой и перемешивают содер-жимое. Центрифугируют в течение 5 мин приблизительно при 500 g.

4.         Удаляют супернатант, заливают клетки 4 мл среды ГАТ и помещают суспензию в две лунки панели для культуры тка¬ней объемом 2 мл.

5.         Панели инкубируют в термостате с регулируемым соста¬вом атмосферы, а затем рассевают клетки. Жизнеспособность клеток обычно составляет 50—78% при условии, что была за¬морожена здоровая, хорошо растущая (непереросшая) куль¬тура.

Время от времени необходимо проверять содержание специ-фических антител в культуральной жидкости с помощью опре-деленного набора контрольных антигенов. Очень важно оценить не только уровень специфических антител, но и возможных примесей. Обнаружение последних может быть обусловлено за-грязнением гибридомы клетками другой линии, что легко может случиться, когда одновременно культивируют много линий.

' Асцитные жидкости можно хранить в замороженном виде, но в этом случае отпадает необходимость в соблюдении сте¬рильности (препараты будут использованы для последующих в/б инъекций), которая должна быть обеспечена при замора¬живании клеток для последующего культивирования in vitrp. После центрифугирования асцитной жидкости осадок ресуспен¬дируют в PBS, а не в среде ГАТ.

Самый простой путь определения концентрации моноклональных иммуноглобулинов в асцитных жидкостях — электро-форез с последующим окрашиванием гелей. На электрофоре-грамме должны быть видны отдельные полосы, характеризую¬щиеся определенным положением в случае антител данной специфичности. Их интенсивность можно сравнить с интенсив¬ностью полос, полученных при исследовании проб, отобранных на более ранних пассажах. Данный метод более удобен и ин¬формативен, чем титрование специфических антител, хотя время от времени следует применять и последний.

9. Применение моноклональных антител

Клиническое и экспериментальное применение моноклональных антител разнообразно и многочисленно. Ряд обзоров полностью посвящены этой теме и могут быть рекомендованы читателю [2, 4, 6]. Здесь мы рассмотрим практические выводы, имеющие отношение к использованию моноклональных антител.

Во-первых, в зависимости от области применения существу¬ет возможность выбора наиболее подходящего и удобного ис-точника получения моноклональных антител: культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцит¬ной жидкости возникают определенные трудности при интер¬претации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 :1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуно¬глобулинов (например, при использовании моноклональных ан¬тител для выделения и очистки небольшого количества белко¬вого антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологиче-ских реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду при-сутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природ¬ных антител, реагирующих с антигеном, специфически распо-знаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях.

Культуральная жидкость представляет собой удобный и адекватный источник моноклональных антител с целью использования их для идентификации антигена как в собственной лаборатории, так и для снабжения этим реагентом коллег. При использовании одной капли чистой культуральной жидкости на тест, 10 мл достаточно для проведения приблизительно 200 тес¬тов. Если моноклональные антитела получают коммерческим путем или используют в крупномасштабных исследованиях в ряде центров, то наиболее экономичным источником их полу-чения служит асцитная жидкость. При использовании одной капли на тест и при работе с разведением около 1 : 10\ 1 мл хватает на 20 000 тестов. В этом случае моноклональные ан-титела обычно выделяют из асцитной жидкости в виде иммуно-глобулиновой фракции.

В разд. 5 мы рекомендовали выбирать метод скрининга, адекватный использованию МКА. Следует иметь в виду, что в неадекватных системах МКА иногда не обнаруживают антиге¬на. Например, моноклональные антитела к растворимым бел¬кам, отобранные методом пассивной гемагглютинации с по¬мощью эритроцитов, нагруженных антигеном, могут распозна¬вать только одну антигенную детерминанту. Такие антитела не обладают преципитирующими свойствами. В таком случае пре-ципитация антигена достигается при использовании комбинации моноклональных антител различной специфичности, которые распознают две различные детерминанты на молекуле белка.

Дальнейшие исследования возможностей использования мо-ноклональных антител неожиданно встретили затруднения, обусловленные распознаванием моноклональными антителами только нативной формы антигена. Например, моноклональные антитела к клеточным антигенам часто не распознают антиген, перенесенный на нитроцеллюлозную мембрану с полиакрил-амидных гелей после проведения электрофореза растворимых клеточных экстрактов в присутствии ДСН. В данном случае антиген денатурируется и поэтому не связывается с антитела¬ми. Подобным образом моноклональные антитела, которые окрашивают клетки в суспензии, могут оказаться непригодны¬ми для иммуногистологических исследований парафиновых сре¬зов зафиксированного формалином материала. Эти соображе¬ния наводят на мысль, что как выбор метода скрининга, так и природа материала, используемого для иммунизации мышей, являются важными факторами, влияющими на свойства полу¬ченных в конечном итоге моноклональных антител.

Серологические свойства моноклональных антител не всегда можно предсказать по известным серологическим свойствам адсорбированных поликлональных антисывороток. В случае поликлональных реагентов взаимодействие с антигеном осуще-ствляется благодаря комбинированному эффекту различной специфичности антител, которые 6 совокупности идентифициру-

ют определенные типы клеток или белков и не распознают другие образования и структуры. Моноклональные антитела к корпускулярным антигенам или гликопротеинам могут прояв¬лять неожиданные серологические свойства, а именно окраши¬вать различные клетки или же связывать большое число раз-нообразных гликопротеинов. Такие антитела, как правило, распознают специфические углеводные структуры, которые мо-гут входить в состав самых разнообразных белков. Примером служит углеводная структура З-фукозил-М-ацетиллактозамина, которая может быть обнаружена в кислом гликопротеине a-U лактоферрине, а-амилазе секрета околоушной железы, церви-кальном муцине и в секреторном компоненте. Моноклональные антитела различной специфичности могут найти практическое применение во многих областях биологии и медицины. С по¬мощью серологических исследований следует предварительно определить, что определенные моноклональные антитела действительно проявляют специфичность именно в данной тестирующей системе.

В целом использование моноклональных антител в экспери-ментальных и клинических исследованиях помогает устранить проблему, связанную с неспецифическими реакциями обычной поликлональной антисыворотки, обусловленными присутствием посторонних антител, а также связыванием с антигеном ком-понентов неиммуноглобулиновой природы. Однако, как бы¬ло сказано выше, исследователю может потребоваться более одного препарата моноклональных антител, специфичных к оп-ределенному антигену, с тем чтобы использовать такую ком-бинацию антител для проведения широкого спектра экспериментов.

histopathology.narod.ru

Мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном f1 из yersinia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции yersinia pestis

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны изолированное мышиное антитело, селективно связывающееся с антигеном F1 из Yersinia pestis, и антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Представлена клетка дрожжей, продуцирующая описанный антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Предложен способ получения описанного антигенсвязывающего фрагмента. Также предложен способ детекции Yersinia pestis и набор для детекции антигена F1 из Yersinia pestis. Изобретение предоставляет реагент для детекции Yersinia pestis. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к антителам, в частности к мышиным моноклональным антителам, связывающимся с белком F1 из Yersinia pestis, способу получения указанных антител с использованием дрожжей, применению указанных антител для детекции Yersinia pestis и к набору для указанного применения, содержащему указанные антитела.

Предшествующий уровень техники

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в непосредственной близости друг от друга благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in WO 91/09967.

Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497). Она включает в себя главным образом иммунизацию мыши антигеном, слияние клеток селезенки из иммунизированной мыши с клетками миеломы мыши и селекцию среди полученных таким образом гибридом одной или нескольких гибридом, которые секретируют моноклональное антитело, специфическое для целевого антигена.

Капсульный антиген F1 является основным иммунохимическим компонентом антигена, расположенного на поверхности Y. pestis. Антиген F1 присоединен к внешней мембране микроба Y. pestis в виде олигомерного белка, образующего гранулярный слой и постепенно диффундирующего в окружающую среду. Капсульный полимер состоит из множества похожих субъединиц гидрофобного белка, агрегированных при физиологических условиях. Субъединица F1 антигена изначально синтезируется из 170 аминокислот и обладает молекулярной массой 17.6 кДа, затем, после удаления сигнального пептида в ходе секреции на поверхность, формируется белок с молекулярной массой 15.6 кДа и изоэлектрической точкой 4.1 (Karlyshev et al., FEBS Lett. 1992 Feb 3; 297(1-2):77-80).

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения было получение реагента для детекции Yersinia pestis.

Указанная цель была достигнута путем выделения мышиного антитела, обладающего способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis, определения его последовательности и демонстрацией высокой специфичности указанного антитела в связывании антигена F1 из Yersinia pestis. Также указанная цель была достигнута путем создания способа получения указанного функционального антитела с использованием клеток дрожжей.

Настоящее изобретение предоставляет новое моноклональное мышиное антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Такое новое моноклональное мышиное антитело селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis.

Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий описанное выше антитело.

Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент с участком связывания антигена (fragment antigen binding, Fab) моноклонального мышиного антитела, который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1 и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2.

Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент с антигенсвязывающим участком (fragment antigen binding, Fab), описанный выше.

Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, трансформированную описанным выше фрагментом ДНК, обладающую способностью к продукции указанного Fab.

Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, описанную выше, где указанной клеткой дрожжей является Pichia pastoris.

Также настоящее изобретение предоставляет способ получения Fab, описанного выше, включающий выращивание указанных дрожжей в питательной среде и выделение указанного Fab из культуральной жидкости.

Также настоящее изобретение предоставляет способ детекции Yersinia pestis, включающий: (а) получение образца от животного или человека; (b) взаимодействие указанного образца с антителом или Fab, описанными выше; (с) детектирование комплекса, образованного указанным антителом или Fab и антигена F1; и, необязательно, (d) определение количества антигена F1, присутствующего в указанном образце на основании детектированного количества комплекса, образованного антителом и антигеном F1, или комплекса, образованного Fab и антигеном F1.

Также настоящее изобретение предоставляет набор для детекции антигена F1 из Yersinia pestis, содержащего изолированные моноклональные антитела, которые селективно связываются с антигеном F1 из Yersinia pestis, и средства, позволяющие детектировать указанный антиген F1 с использованием указанного антитела.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показан Вестерн-блоттинг (дорожки 1-2) и электрофорез в 12% SDS-ПААГ (восстановительные условия) антигена F1 из Y. pestis с мышиными антителами. Дорожки; 1 - конъюгат анти-IgG-POD (контроль), 2 - мышиные антитела (20 мкг/мл), 3 - антиген F1 из Y. pestis, 4 - стандарт молекулярных весов (97, 69, 45, 30, 20 кДа).

На Фиг.2 показана иммунореактивность антитела с использованием антигена F1 из Y. pestis, определенная с использованием метода ELISA.

На Фиг.3 показаны калибровочные кривые для определения константы диссоциации антитела и антигена F1 из Y. pestis, полученные с использованием метода ELISA determined by ELISA method.

На Фиг.4 показаны кривые смертности мышей как в экспериментальной, так и в контрольной группах.

На Фиг.5 показаны последовательности нуклеотидов и аминокислот участка VH. 5'-Праймер, использованный для клонирования гена, кодирующего фрагмент Fab мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis, указан голубым, каркасные участки показаны желтым, гипервариабельные петли (CDR) показаны зеленым, константный домен тяжелой (IgG1) цепи мышиного антитела показан красным.

На Фиг.6 показаны последовательности нуклеотидов и аминокислот участка VL. 5'-Праймер, использованный для клонирования гена, кодирующего фрагмент Fab мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis, указан голубым, каркасные участки показаны желтым, гипервариабельные петли (CDR) показаны зеленым, константный домен легкой (kappa) цепи мышиного антитела показан красным.

На Фиг.7 показана конструкция плазмид pPICZαA-F1-mouse-H и pPICZαA-F1-mouse-L.

На Фиг.8 показана схематическая карта плазмиды pPICZαA-F1-mouse-H-L.

На Фиг.9 показан Вестерн-блоттинг культуральной жидкости штамма GS115/AOX-F1-mouse-H-L, продуцирующего фрагмент Fab, с анти-мышиными антителами. Дорожки с β-меркаптоэтанолом: 1 - маркеры веса; 2 - GS115/AOX-F1-mouse-H-L, 3-GS115.

На Фиг.10 показаны данные анализа белков (12% SDS-ПААГ) для 4 фракций препарата Fab после очистки методом гель-фильтрации на колонке с Sephadex G50. Дорожки: 1 - стандарт, 2-5 - различные фракции препарата антитела.

На Фиг.11 показана калибровочная кривая для Fab против антигена F1 из Y. pestis, полученная методом ELISA.

На Фиг.12 показана кривая связывания для природного (а) и рекомбинантного (b) Fab против антигена F1 из Y. pestis в координатах Клоца (Klotz coordinates).

Подробное описание настоящего изобретения

Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (а) назначение животному эффективного количества белка, пептида или его мимотопа с целью получения антител и (b) выделение указанных антител. Антитела, полученные против определенных белков или мимотопов, могут обладать некоторыми преимуществами, поскольку такие антитела не сильно загрязнены антителами против других соединений, что могло бы, в противном случае, повлиять на точность диагностического метода. Способы получения таких антител известны из предшествующего уровня техники и подробно описаны Harlow и др. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988) и включают в себя иммунизацию животных с целью получения препаратов антител, которые выделяют из, например, плазмы или асцитной жидкости и очищают способами, известными из уровня техники, с получением препаратов, дающих реакцию с антигеном. Множество видов имеют белки с близкими последовательностями и поэтому могут возникнуть сложности в ходе использования стандартных протоколов иммунизации при получении антител, которые узнают белок только одного вида. Поэтому также стоит рассмотреть модификации стандартных методов получения антител, таких как, например, разностные (вычитательные) гибридизационные методики. Такие модификации могут быть известны специалисту в данной области техники, также они описаны в настоящем описании. В других методах антитела, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, получают с использованием рекомбинантных методов, описанных Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)).

Вкратце, моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин "выращенные клетки", использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, keyhole limpet hemacyanin, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).

В частности, антителами в соответствии с настоящим изобретением являются мышиные моноклональные антитела, обладающие способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis (Y. pestis). Указанные антитела являются мышиными моноклональными антителами, содержащими аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи антитела (VH), аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи антитела (VL) консервативных участков обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела, представлены, но не ограничиваются аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID NO:54 и SEQ ID NO:55. Указанные новые мышиные моноклональные антитела селективно связываются с антигеном F1 из Y. pestis.

Далее, участком связывания антигена (fragment antigen binding, Fab) согласно настоящему изобретению является изолированный Fab, который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 и вариабельный участок легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

В настоящем изобретении фраза "антитело или Fab, обладающий способностью к связыванию с антигеном F1 из Yersinia pestis" означает молекулу, которая связывается с антигеном F1 и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов. Термин "селективно связывает антиген F1 из Yersinia pestis" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с антигеном F1 в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к антигену F1, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом или Fab, которое предпочтительно связывается с антигеном F1, является антитело или Fab, которое связывается с антигеном F1, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с антигеном F1, с молекулой, не являющейся антигеном F1, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с антигеном F1, определить уровень антигена F1 из Y. pestis в образце. Примерами таких молекул и компонентов, которые могут присутствовать в образце, являются, но не ограничиваются ими, белки, не являющиеся антигеном F1, липиды и углеводы.

Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающимися методом ELISA и равновесным диализом. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).

Fab, пригодный для осуществления настоящего изобретения, - это Fab, обладающий способностью к связыванию антигена F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет от около 10 нг/мл и около 10 пг/мл. В частности, пригодные в рамках настоящего изобретения антитела связывают антиген F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет 10 нг/мл, около 1 нг/лм или менее, предпочтительно 100 пг/мл. Такие антитела и Fab описаны в сопутствующих Примерах.

Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело согласно настоящему изобретению, является экспрессирующийся фрагмент ДНК, содержащий промотор, сигнальную последовательность, последовательность нуклеотидов, кодирующую структурные части тяжелой и легкой цепей антитела, участок терминации транскрипции.

В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие структурные части тяжелой и легкой цепей антитела согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4), связанный с фрагментом ДНК, кодирующим консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Нуклеотидные последовательности, кодирующие консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела, представлены, но не ограничиваются последовательностями, представленными в SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:57.

Также, нуклеотидные последовательности, кодирующие Fab согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4).

Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO:3 или 4 при условии, что они кодируют участки цепей антитела с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2.

Клетками дрожжей согласно настоящему изобретению являются клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК, описанным выше, и обладающие способностью к продукции Fab против антигена F1 из Y. pestis.

Фраза «клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК» означает, что желаемый фрагмент ДНК был введен в клетку дрожжей с использованием методов, известных специалисту в данной области техники. Трансформация клетки дрожжей фрагментом ДНК приводит к увеличению экспрессии фрагмента ДНК, кодирующего антитело согласно настоящему изобретению. Присутствие сигнальной последовательности α-фактора приводит к секреции произведенного антитела в культуральную жидкость. Методы трансформации клеток дрожжей включают в себя все известные методы, например модифицированная версия процедуры, описанной для S. cerevisiae (Gietz and Schiesti, 1996).

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения Fab против антигена F1 из Y. pestis, включающий выращивание дрожжей в питательной среде и выделение полученного Fab из культуральной жидкости.

Примером клетки дрожжей, пригодных для продукции Fab согласно настоящему изобретению, являются, но не ограничивается ими, клетки дрожжей Pichia pastoris. Фраза "дрожжи Pichia pastoris" означает, что указанные дрожжи классифицируют как Pichia pastoris (Р. pastoris) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области микробиологии. Примерами дрожжей Р. pastoris, применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, дрожжи Р. pastoris GS115 (Invitrogen).

В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка Fab из культуральной жидкости и других жидкостей может быть осуществлена методом, сходным с традиционными методами ферментации, когда некий белок производится с использованием микроорганизма.

Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источник углерода, источник азота, минералы и, если это необходимо, подходящее количество питательных веществ, в которых нуждаются дрожжи для их роста. К источникам углерода относятся углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции у указанного микроорганизма может быть использован спирт, включая метанол, этанол, глицерин. В качестве источника азота могут быть использованы различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, источники природного азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, расщепленные ферментированные микроорганизмы. В качестве источника минералов могут быть использованы монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут быть использованы тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.

Выращивание предпочтительно осуществляют в аэробных условиях, таких как культивирование с перемешиванием, взбалтывание с аэрацией, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 28 до 30°С. рН среды обычно поддерживают в диапазоне от 2 до 9, предпочтительно в диапазоне от 6 до 7.5. рН среды может быть скорректирован с помощью аммиака, карбоната кальция, различных оснований и буферов. Обычно выращивание в течение от 1 до 7 дней приводит к накоплению Fab в культуральной жидкости.

После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем антитела или Fab могут быть выделены и очищены методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.

Моноклональные мышиные антитела в соответствии с настоящим изобретением, которые селективно связываются с антигеном F1 из Y. pestis, также могут быть получены с использованием подходящей гибридомы. Гибридомы могут быть выращены в питательной среде и накопленные антитела могут быть выделены. Здесь и далее термин "выращиваемые клетки" относится к гибридомам или другим линиям клеток, которые производят антитела. Способы получения и проверки таких выращиваемых клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Методы получения антигенного материала для инъекций в животное включают в себя методы, известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, пептидов, выбранных из иммуногенного участка этого белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, keyhole limpet hemacyanin, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методам, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).

Другим способом согласно настоящему изобретению является способ детекции Yersinia pestis. Указанный способ включает в себя: (а) получение образца из животного или человека; (b) взаимодействие указанного образца с антителом или Fab, описанными выше; (с) детектирование комплекса, образованного указанным антителом или Fab и антигена F1; и, необязательно, (d) определение количества антигена F1, присутствующего в указанном образце на основании детектированного количества комплекса, образованного антителом и антигеном F1, или комплекса, образованного Fab и антигеном F1. Присутствие в образце любого количества антигена F1 из Н. pestis является свидетельством наличия заболевания.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец получают или выделяют из животного или человека для того, чтобы протестировать на наличие Y. pestis. Животное может как быть под подозрением на наличие ранней стадии заболевания или нет. В качестве образца, который может быть использован для определения наличия Y. pestis, может быть использован образец любой ткани животного. Кровь, мокрота, содержание бубонов, образцы тканей являются подходящими образцами. Предпочтительным образцом является кровь. Специалист в данной области может без труда выбрать подходящие образцы.

Хотя это не является необходимым в рамках настоящего изобретения, образец может быть подвергнут желаемой предварительной обработке. Например, образец может быть нормирован до достижения желаемой степени специфической активности. Нормирование образца с использованием подходящего метода разведения, известного из уровня техники, позволяет определить количественное содержание антигена F1 из Y. pestis независимо от начальной концентрации (например, удельного веса) в образце.

После получения образца определяют уровень антигена F1 из Y. pestis в данном образце. Термины "определяют", "определяют уровень антигена F1 из Y. pestis", "определяют количество антигена F1 из Y. pestis" и подобные им, использованные здесь, используются для того, чтобы очертить круг методов, которые могут быть использованы для определения или измерения количества антигена F1 из Y. pestis в образце. Такие методы могут дать качественные или количественные результаты. Уровень содержания антигена F1 из Y. pestis может быть определен по содержанию целого белка антигена F1 из Y. pestis protein или по содержанию фрагментов, продуктов деградации или продуктов реакции антигена F1 из Y. pestis.

Антитела, связывающиеся с антигеном F1 из Y. pestis, пригодные в способах согласно настоящему изобретению, могут включать в себя многофункциональные антитела, например бифункциональные антитела, содержащие, по крайней мере, одну функциональную часть, которая специфически связывается с антигеном F1. Такие многофункциональные антитела могут включать в себя, например, химерные молекулы, включающие в себя молекулу, которая связывается с антигеном F1, и вторую часть, которая дает возможность данной химерной молекуле связываться с субстратом или позволяет детектировать ее способом, при котором связывание с антигеном F1 не ухудшается. Примерами таких вторых частей являются, но не ограничиваются ими, фрагменты молекулы иммуноглобулина, флуоресцентный белок или фермент.

Гибриды или слитые белки антител, которые сохраняют способность связываться с антигеном F1 из Y. pestis, также могут быть использованы. В таких гибридах часть, связывающая антиген F1, может быть связана со второй частью, которая может связываться с субстратом или может быть детектирована. Примеры таких вторых частей включают в себя, но не ограничиваются ими, фрагменты молекул иммуноглобулина, эпитопы, флуоресцентные белки или ферменты.

Антитело, обладающее способностью к связыванию с антигеном F1 из Y. pestis, использованное в рамках настоящего изобретения, может содержаться в составе для детекции. Например, антитело может содержаться в буфере, в котором это антитело растворено, и/или быть объединено с носителем. Подходящие буферы и носители известны для специалиста в данной области техники. Примеры подходящих буферов включают в себя любой буфер, в котором антитело может функционировать с селективным связыванием антигена F1, такой как, но не ограничивающийся, фосфатный солевой буфер, вода, буфер HEPES (буферная соль N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты), буфер TES (солевой буфер Трис-ЭДТА), буфер Трис и буфер ТАЭ (Трис-ацетат-ЭДТА). Примеры носителей включают в себя, но не ограничиваются ими, полимерные матрицы, токсоиды, сывороточные альбумины, такой как бычий сывороточный альбумин. Носители могут быть комбинированы с антителом или конъюгированы (присоединены) к антителу способом, который существенно не изменяет способность антитела к связыванию антигена F1.

Термин "взаимодействие", использованный здесь, означает введение, добавление образца, предположительно содержащего антиген F1 из Y. pestis, к антителу, связывающему антиген F1, например, путем объединения или смешения образца с антителом. В случае, если антиген F1 из Y. pestis присутствует в образце, образуется комплекс антигена F1 с антителом; образование такого комплекса означает способность антитела селективно связываться с антигеном F1 с образованием стабильного комплекса, который может быть детектирован. Детектирование может быть качественным, количественным или полуколичественным. Связывание антигена F1 из образца с антителом происходит в условиях, подходящих для формирования комплекса. Такие условия (например, подходящие концентрации, буферы, температура, время реакции), а также методы оптимизации таких условий хорошо известны специалисту в данной области техники. Связывание может быть обнаружено и измерено с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные методы иммунохимии (например, ELISA), иммунопреципитации, методы иммуноблотинга и другие методы иммунохимии, описанные, например, Sambrook и др. (см. выше) и Harlow и др. (см. выше). Эти ссылки также описывают примеры условий, в которых образуется комплекс.

В рамках одного из воплощений настоящего изобретения комплекс антигена F1 и антитела может образовываться в растворе. В рамках другого воплощения настоящего изобретения может образовываться комплекс антигена F1 с антителом, в котором антиген F1 или антитело иммобилизовано на подложке (например, нанесено на подложку). Методики иммобилизации хорошо известны специалисту в данной области техники. Подходящие материалы для подложки включают в себя, но не ограничиваются пластмассой, стеклом, гелем, целлулоидом, тканями, бумагой и другими материалами. Примеры материалов подложки включают в себя, но не ограничиваются латексом, полистиролом, нейлоном, нитроцеллюлозой, агарозой, хлопком, PVDF (поливинилиденфторидом) и магнитными смолами. Подходящие формы материала подложки включают в себя, но не ограничиваются углублениями (например, плашки для микротитрования), чашки для микротитрования, стержни, полоски, бусины, аппараты с ответвляющимся потоком, мембраны, фильтры, трубки, чашки, целлулоидный матрикс, магнитные частицы, другие макрочастицы. В частности, предпочтительными подложками являются, например, пластинки для ELISA, стержни, полоски для иммуноанализа, радиоиммунологические чашки, агарозные бусины, пластиковые бусины, бусины из латекса, гибки, хлопковые нити, пластиковые чипы, мембраны для иммуноблотинга, бумага для иммуноблотинга и проточные мембраны. В одном из вариантов воплощения изобретения подложка, указанная выше, может содержать маркер для детекции. Описание примеров материалов для подложки смотри, например, в Kemeny, D.М. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, Elmsford, N.Y. pp 33-44, and Price, С.) и Newman, D. eds. (Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition (1997) Stockton Press, NY, N.Y.).

Антитело может быть иммобилизовано на подложке, такой как плашка для микротитрования, стержне, полоске для иммуноанализа, аппараты с ответвляющимся потоком. Образец, полученный из животного или человека, наносят на подложку и инкубируют в условиях, подходящих (то есть, достаточных) для образования комплекса антигена F1 с антителом, связанным с подложкой.

В соответствии с настоящим изобретением комплекс антигена F1 с антителом детектируют. Термин "детектирование образования комплекса", использованный здесь, означает идентификацию присутствия антитела, связанного с антигеном F1. Если комплекс образуется, то количество образованного комплекса может быть оценено количественно, но это не является обязательным. Образование комплекса или селективное связывание между предполагаемым антигеном F1 с антителом может быть измерено (то есть, детектировано, определено) с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области (смотри, например, Sambrook и др., выше), примеры которых описаны здесь. Комплекс может быть детектирован множеством методов, включающих в себя, но не ограниченных использованием одного или нескольких методов: ферментоподобным иммунометодом, конкурентным ферментоподобным иммунометодом, радиоиммунным, флуоресцентным иммунометодом, хемилюминесцентным иммунометодом, методом с использованием аппаратов с ответвляющимся потоком, проточным методом, методом агглютинации, методом с использованием макрочастиц (например, с использованием частиц, таких как, но не ограниченных магнитными частицами или пластиковыми полимерами, такими как латекс или полистироловые бусины), методом иммунопреципитации, методом BioCore™ (например, с использованием коллоидного золота), методом иммунодота (например, Heska AG's Immunodot System, Фрибург, Швейцария) и методом иммуноблотинга (например, Вестерн-блотинг), методом фосфоресценции, проточным методом, методом хроматографии, методом с использованием полиакриламидного геля, методом поверхностного резонанса плазмонов, методом спектрофотометрии, методом с использованием частиц, методом электронных сенсоров. Указанные способы хорошо известны специалисту в данной области техники.

Эти методы могут быть использованы для получения количественных или качественных результатов в зависимости от того, как эти методы будут использованы. Результаты методов могут базироваться на детектировании нативной молекулы антигена F1 или ее фрагментов, продуктов их деградации или продуктов реакции антигена F1. Некоторые методы, такие как агглютинация, разделение с использованием макрочастиц и иммунопреципитация, могут дать визуальный результат (например, как наблюдение невооруженным глазом или с использованием устройств, таких как денситометр или спектрофотометр), не требующий применения маркера для детектирования.

В других методах конъюгация (то есть, присоединение) антитела с маркером для детектирования или с реагентом, который селективно связывается с антителом (например, антитело на антитело, связывающее антиген F1), помогает в детектировании образования комплекса. Такие соединения и реагенты являются примерами молекул для детектирования (то есть молекул, способных детектировать комплекс антитела с антигеном F1). Маркер для детектирования может быть присоединен к части молекулы, которая не влияет на способность этой молекулы связываться с антигеном F1. Методы конъюгации хорошо известны специалисту в данной области техники. Примеры маркеров для детектирования включают в себя, но не ограничиваются радиоактивными, флуоресцентными, хемилюминесцентными, хромофорными, ферментативными, фосфоресцентными, электронными маркерами; метками из золей металлов, цветных бусин, физическими метками или лигандами. Бусинами считаются макрочастицы, состоящие из материала в виде матрикса, такого как латекс или полистирол, который может быть ковалентно или нековалентно связан с молекулой для детекции. К лигандам относятся молекулы, которые селективно связываются с другой молекулой. Предпочтительные маркеры для детектирования включают в себя, но не ограничиваются флуоресцеином, радиоактивными изотопами, фосфатазой (например, щелочной фосфатазой), биотином, авидином, пероксидазой (например, пероксидазой хрена), β-галактозидазой, соединениями, подобными биотину или авидину (например, стрептовидин или ImmunoPure® NeutrAvidin). Например, в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела, связывающие антиген F1, конъюгируют с бусинами их латекса.

Настоящее изобретение также может включать в себя один или несколько слоев и/или типов вторичных молекул или других связывающих молекул, способных детектировать присутствие комплекса антитела с антигеном F1. Например, немодифицированные (то есть не связанные с молекулой для детектирования) вторичные антитела, которые селективно связываются с антителом, связывающим антиген F1, могут связываться модифицированным (то есть связанным с молекулой для детектирования) третичным антителом, которое селективно связывает вторичные антитела, что позволяет детектировать антиген F1. Подходящие вторичные антитела, третичные антитела и другие вторичные и третичные молекулы могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники. Предпочтительные третичные молекулы также могут быть выбраны специалистом в данной области техники на основании характеристик вторичной молекулы. Подобная стратегия может быть применена для последовательных слоев.

Также могут быть использованы не иммунологические методы. Для того чтобы детектировать антиген F1, могут быть использованы методы, такие как предварительное концентрирование образца, для повышения концентрации антигена F1 с целью повышения чувствительности к белку. Такие не иммунологические методы также включают в себя, например, электрофорез, где детектирование антигена F1 может быть произведено методами, известными из уровня техники, например окрашивание белка. В другом варианте осуществления изобретения тест на наличие антигена F1, основанный на использовании белков, может быть использован для определения антигена F1 в предварительно концентрированном образце из животного или человека.

Как только уровень антигена F1 измерен, может быть сделано заключение о наличии заболевания. Заключение о наличии заболевания означает сравнение уровня антигена F1 в образце для тестирования с уровнем, обнаруженным у здорового животного или человека. В рамках настоящего изобретения заключение о наличии заболевания делается, когда детектируется любое количество антигена F1.

Настоящее изобретение также включает в себя набор, подходящий для детекции (детектирования) антигена F1 из Y. pestis, использующий способ, описанный выше. Термин «подходящий» означает, что детекция включает в себя методы, описанные здесь, использующие антитела, связывающие антиген F1, в соответствии с настоящим изобретением. Такие антитела могут быть конъюгированы с маркером для детектирования. В другом варианте осуществления изобретения набор может содержать немеченые антитела в соответствии с настоящим изобретением, также как и меченые антитела с или без маркеров для детекции, обладающие способностью к детектированию антигена F1. Набор также может содержать сопутствующие компоненты, такие как, но не ограниченные буферами, метками, контейнерами, вставками, тюбингами, флаконами, шприцами и подобными предметами.

Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.

Пример 1. Очистка антигена F1.

Выращивание.

Выращивание микроорганизма Y. pestis EB76 (штамм с живой вакциной) осуществляли в плотной питательной среде, на агаре Хоттингера (Hottinger's agar) с добавлением сульфата магния до 0.25%, хлорида кальция до 0.025%, гемолизированной крови до 0.1% при 37°С в течение 48 часов.

Очистка антигена F1.

Культуру смывали с поверхности агара натрий-фосфатным буфером рН 8.5 (PBS 8.5). Клетки осаждали центрифугирование при 5000 g в течение 15 минут. Супернатант отбирали, осадок тщательно ресуспендировали в буфере PBS рН 8.5 и дважды промывали (на этой стадии капсульный антиген смывался в раствор с поверхности клеток). Супернатанты от промывок объединяли и использовали в качестве источника антигена F1 (грубый экстракт F1). Присутствие антигена F1 в растворе контролировали путем сбора данных ELISA с использованием приготовленных самостоятельно конъюгатов кроличьих антител против антигена F1 с пероксидазой и мышиных моноклональных антител против антигена F1.

Осаждение белков из грубых экстрактов антигена F1 осуществляли с помощью сульфата аммония с 30% насыщением. После инкубирования в течение 12 часов при 4°С образовавшийся осадок центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут, полученный осадок (осадок SA30) растворяли в буфере PBS и снова осаждали в изоэлектрической точке при рН 4.05±0.05 титрованием с использованием разбавленного раствора HCl. Полученные агрегаты отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 20 минут, растворяли в фосфатном буфере, а затем для подготовки к хранению полученные белки диализировали против деионизированной воды и лиофилизировали.

Определение количества белков в образцах с антигеном F1

Определение количества белков осуществляли методом Лоури. Раствор альбумина 1 мг/мл использовали в качестве стандарта.

Электрофорез образцов с антигеном F1

Электрофорез капсульного белка был произведен в 12.0% SDS-ПААГ методом Лемли (Laemmly). В качестве стандарта использовали белок F1 (Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии, Оболенск, Россия). Анализ с помощью электрофореза подтвердил, что очищенный образец F1 обладал такой подвижностью в геле, как и внутренний стандарт F1. Были получены препаративные количества антигена F1 из Y. pestis.

Пример 2. Накопление и характеристика мышиного моноклонального антитела к антигену F1 из Y. pestis

Иммунизация

Мыши линии Balb/c в возрасте 8 недель были трижды с интервалом в 2 недели внутрибрюшинно иммунизированы 50 мкг антигена. Для первой иммунизации использовали смесь 1:1 антигена и полным адъювантом Фройнда (complete Freund's adjuvant) в форме гомогенной эмульсии. Антиген для второй иммунизации был приготовлен похожим образом, но только с неполным адъювантом Фройнда. Третью, окончательную иммунизацию осуществляли с использованием 50 мкг антигена в буфере PBS.

Получение гибридом

Мыши были терминированы на 4-й день после третьей иммунизации, из них было извлечена кровь и получена сыворотка, которую использовали в качестве положительного контроля. Селезенку гомогенизировали, половину полученных лимфоцитов замораживали в жидком азоте с использованием 10% ДМСО, с использованием остальных лимфоцитов получали клетки, слитые с миеломой SP2/0, в соответствии со стандартным методом с применением 50% ПЭГ 4000.

Указанные клетки высевали в плашки с 96 лунками, содержащими питательную среду DMEM (Gibco, cat.No. 52100-039) с добавлением L-глутамина, пирувата натрия, гентамицина, HAT (100 мкМ гипоксантин, 0.4 мкМ аминоптерин, 16 мкМ тимидин) и 8% эмбриональной телячьей сыворотки. Сначала вносили в лунки суспензию клеток подкормки - перинатальных макрофагов, полученных путем промывки брюшной полости здоровой мыши. Рост первичной культуры определяли визуально с использованием микроскопа. По истечении 10-12 дней после гибридизации супернатанты из лунок проверяли на содержание специфических антител с использованием ELISA.

Первичные культуры из лунок, содержащие антитела, дважды клонировали с использованием метода ограниченных разведений в питательной среде DMEM с теми же добавками, за исключением HAT, на слой клеток подкормки. Проверку супернатантов осуществляли на 10-12 день. Если требовалось, положительные клоны переклонировали еще 1-3 раза, а затем определяли их изотипы с использованием EIA.

Получение асцитов

Выбранные клоны инокулировали в мышей, в которых предварительно ввели пристан (Pristane). Асциты выделяли на 7-10 день после инокуляции клетками.

Очистка моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis

Асциты (20 мл) разводили в буфере MES (150 мМ хлорид натрия, 50 мМ 2-[N-морфолино]этансульфоновая кислота, рН 5.7) в соотношении 1:4 и наносили на колонку Protein G-column (Protein G-Sepharose 4B Fast Flow (Pharmacia, 17-0618-03)). Выход мышиного изотипа IgG1 составлял 3.8 мг/мл асцитов. После очистки степень чистоты антител проверяли в SDS-ПААГ и с помощью иммунореактивности (непрямой метод ELISA). Чистота антител была около 95%.

В соответствии результатами иммуноблотинга (Фиг.1) антитела F19 специфически окрашивали одну полосу в образце F1, полоса с высоким молекулярным весом соответствует димеру F1.

Проверка кросс-реактивности с антигенами F. tularensis, В. anthracis PA и SP, Т. gondii, Salmonella О Ag, Legionella pn., VAg Y. pestis, SEB, E.coli была отрицательной.

Иммунореактивность очищенных антител

Иммунореактивность антител проверяли непрямым методом ELISA с использованием антигена F1 из Y. pestis (покрытие F1 - 5 мкг/мл в 0.1 М карбонатном буфере, антитела - 1 мкг/мл, конъюгат - мышиные анти-IgG, субстрат - 3,3',5,5'- тетраметил-[1,1'-бифенил]-4,4'-диамин (ТМВ). Данные были получены на многоканальном фотометре "Multiscan" при длине волны 450 нм. Результаты показаны на Фиг.2. Указанные моноклональные антитела демонстрировали высокую специфическую активность и чувствительность до 0.5 нг/мл.

Определение константы диссоциации для антител против антигена F1 из Y. pestis Константу диссоциации определяли методом Клотца (Klotz I.M., The Proteins, Vol.1, eds H.Neurath and K.Bailey, Academic Press, New York, 1953, p.727) в модифицированном варианте B.Friguet, A.F.Chaffotte, L.Djavadi-Ohaniance и M.E. Goldberg (Journal of Immunological Methods, 77 (1985), 305-319).

Для восстановления равновесия в системе антитело-антиген плашки, которые предварительно блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), покрывали 50 мкл раствора антигена F1 в буфере PBS-AT в концентрациях 10-8 и 10-9 M, 3 ряда для каждой, и титровали серийными разведениями по 1/2. Затем все лунки из этих 6 рядов покрывали 50 мкл антител в выбранной концентрации. Стандартные растворы антител 1; 0,8; 0,5; 0,2; 0,1 вносили в 3 ряда той же плашки, где 1 соответствовала концентрации антител для покрытия слоем оттитрованного антигена, несколько лунок покрывали 50 мкл антитела для определения Ао (оптическая плотность без антигена). Все лунки, содержащие антитела, также были покрыты слоем 50 мкл буфера PBS-AT (0.05 М фосфатный буфер (рН 7,5) с добавлением 0,2% БСА и 0,1% Tween 20). Инкубацию проводили в течение 2 часов при комнатной температуре в мешалке. После инкубации содержимое всех лунок переносили на чашку, предварительно покрытую слоем антигена концентрации 5 мкг/мл в буфере PBS. Инкубацию проводили в течение 1 часа, чашки отмывали буфером PBS-T (0.05 М фосфатный буфер (рН 7,5) с добавлением 0,1% Tween 20) и покрывали слоем анти-мышиного IgG конъюгата. После 1 часа инкубации чашку омывали и наносили ТМВ, по истечении 20 минут получали результаты путем измерения на многоканальном фотометре "Multiscan" при 450 нм. Если стандарты антител имели линейные значения, эксперименты считались действительными. Ao рассчитывали как среднее значение во всех лунках, в которых антитела были нанесены без антигена. Результаты были представлены на Фиг.2. Константы диссоциации определяли на основе калибровочной кривой.

Таким образом, Kd для моноклональных антител к антигену F1 из Y. pestis равно 4,5×10-9 M.

Пример 3. Изучение in vivo нейтрализующей активности мышиных моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis по способности к протекции животных от вирулентного штамма Y. pestis F1 (+).

Изучение способности мышиных антител против антигена F1 из Y. pestis к протекции мышей от вирулентного штамма Y. pestis F1 (+) проводили in vivo. Антитела вводили в мышей внутривенно перед и после заражения. Способность антител к протекции оценивали, сравнивая LD50 (с антителами) и LD50 (без антител). Параметр "средняя продолжительность жизни" оценивали в случае минимальной разницы значений LD50.

Мыши М. musculus Balb/c (18-20 г, десять в каждой экспериментальной группе) были подкожно инокулированы штаммом Y. pestis 231(F1+) (Государственный научно-исследовательский центр прикладной микробиологии, Оболенск, Россия) дозой в 30 клеток в 0.2 мл физиологического раствора на одну мышь. Обработку антителами проводили за 2 часа перед заражением. Антитела в дозировке, равной 1 мг (в 0,2 мл физиологического раствора) на одну мышь, вводили в брюшную область. Эффективность лечения оценивали по времени выживаемости животным в течение 21 дня и по количеству погибших животных. Специфику гибели определяли путем выделения единиц образования колоний (cfu) Y. pestis из органов после препарирования. Результаты представлены в Таблице.

Таблица
Антитела для лечения Погибшие мыши / общее число мышей Выжившие мыши, % Средняя продолжительность жизни, дни
Mab анти F1 C1 F19 2/10 80 14
Mab Va53 10/10 0 9,2
Mab Va68 10/10 0 9,2
Mab Va67 10/10 0 6,0
Mab Va49 8/10 20 6,5
Mab Va224 10/10 0 6,0
Mab Va52 10/10 0 8,0
Mab Va48 8/10 20 6,5
Контроль 10/10 0 4,6

Выжившие животные на 21-й день после инфицирования распределились на три группы, получавшие иммунотерапию с антителами Mab анти F1 C1 F19, анти VAg C1 Va48 и Va49. В первом случае терапевтический эффект был высоким: 80% мышей выжило, в других случаях - только 20%. Необходимо отметить, что бактериологические исследования органов и крови выживших мышей на присутствие культуры Y. pestis 231 дало негативные результаты. Все погибшие животные содержали specific специфическую культуру патогена чумы. Кривые смертности мышей как в экспериментальной, так и в контрольной группах представлены на Фиг.4.

Таким образом, результаты испытаний показали, что Mab "анти F1 C1 F19" оказались высокоэффективными в протекции мышей против заражения вирулентным штаммом Y. pestis F1 (+).

Пример 4. Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты мышиных моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis, используя мРНК из подходящих линий клеток в качестве матриц.

Тотальная РНК была очищена из 1×107 клеток подходящих гибридом, содержащих антитела согласно настоящему изобретению Mab анти F1 C1 F19. Клетки (107 клеток) два раза промывали однократным буфером PBS. В пробирку со 100 мкл клеток добавляли 400 мкл раствора GTB (4 М гуанидинтиоцинат, 30 мМ цитрат натрия, 1% N-лаурилсаркозил натрия, 120 мМ β-меркалтоэтанол). Клетки суспендировали пипетированием в течение 2-3 минут и помещали на лед. Затем добавляли 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5.2) и 500 мкл фенола, насыщенного водой, и полученную суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex. Затем добавляли 100 мкл смеси хлороформ - изоамиловый спирт и суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex в течение 1 мин с перерывами в 1 минуту. Суспензию откручивали в течение 10 мин и супернатант переносили в новую пробирку. Процедуру повторяли. Добавляли равный объем изопропанола (500 мкл) и хранили при -20°С. Образец откручивали в течение 10 минут, осадок промывали этанолом (70%) и растворяли в воде (50 мкл). Выделили в целом 7.5 мкг РНК (0.15 мкг/мкл), которые использовали для дальнейшего синтеза кДНК.

кДНК синтезировали с использованием набора RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) в соответствии с "протоколом синтеза кДНК, подходящего для ПЦР", рекомендованного производителем.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь.

Для того чтобы идентифицировать пару праймеров, пригодных для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь, проводили ПЦР для клонирования с использованием ДНК полимеразы Tag (реакционная смесь содержала 10X буфер для ДНК полимеразы Tag (67 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°С), 166 мМ (Nh5)2SO4, 100 мМ 2-меркаптоэтанола)+20 мМ MgCl2, 1.25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), ДНК полимераза Taq (2.5 U), кДНК 1 мл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Тотальную кДНК использовали в качестве матрицы. Программа ПЦР была следующей: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты; в конце 72°С в течение 10 минут.

5'-Концевой праймер соответствовал набору из 16 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO:5-20), узнающих 95% последовательностей сигнальных пептидов в генах, кодирующих тяжелую цепь, выложенных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Perry, Н. 1991. Sequences of proteins oflmmunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3'-концу тяжелой цепи фрагмента Fab (IgG1), с введенным на 5'-конец сайтом XhoI использовали праймер А26 (SEQ ID NO:21). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров (SEQ ID NO:16 и 21) приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (≈700 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена тяжелой цепи IgG Mus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего легкую цепь.

Ранее было показано, что изучаемое антитело содержит легкую цепь типа каппа. На основании этих данных в качестве 5'-концевого праймера использовали набор из 23 дегенеративных праймеров (SEQ ID NO:22-44). Этот набор узнает 95% последовательностей, соответствующих сигнальным пептидам в генах, кодирующих каппа-цепь, опубликованных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, Т., Perry, Н. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3'-концу тяжелой цепи фрагмента Fab (IgG1), с введенным на 5'-конец сайтом XhoI использовали А31 (SEQ ID NO:45). С использованием электрофореза продуктов ПЦР было показано, что использование единственной пары праймеров (SEQ ID NO:39 и 45) приводило к появлению фрагмента ПЦР. Размер полученного продукта ПЦР (≈700 пар оснований) находился в хорошем соответствии с предсказанной последовательностью кДНК гена легкой цепи IgG Mus musculus из баз данных Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.

Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты антител против антигена F1 из Y. pestis

Pfu ДНК полимеразу (Fermentas) использовали для клонирования генов, кодирующих цепи антитела. Условия ПЦР оптимизировали подбором температуры отжига и концентрации Mg2+ (реакционная смесь содержала 10Х буфер для Pfu ДНК полимеразы (200 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°С), 100 мМ (Nh5)2SO4, 100 мМ KCl, 1% Тритон Х-100, 1 мг/мл БСА)+20 мМ MgCl2, 1.25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), Pfu ДНК полимераза (1.25 U), кДНК 1 мкл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Каждый их продуктов двух независимых ПЦР элюировали из агарозного геля и фосфорилировали с использованием Т4 ДНК полинуклеотидкиназы. Программа для ПЦР была следующая: 95°С в течение 3 минут; 35 циклов 94°С в течение 1 минуты, 45°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 2 минут; в конце 72°С в течение 10 минут. Полученные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pUC18, линеаризованный рестриктазой SmaI. Рекомбинантные плазмиды, содержащие гены тяжелой и легкой цепей Fab указанного антитела, выделяли и назвали pUC18-F1-H и pUC18-F1-L, соответственно.

Пример 5. Секвенирование фрагментов генов, кодирующих вариабельные части Fab-фрагмента мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis.

Рекомбинантная плазмида pUC18-F1-Н, содержащая независимый фрагмент ПЦР, кодирующий тяжелую цепь антитела против антигена F1 из Y. pestis, и плазмида pUC18-F1-L, содержащая независимый фрагмент ПЦР, кодирующий легкую цепь указанного антитела, выделяли и фрагменты ПЦР секвенировали в обоих направлениях. Использовали стандартные праймеры для секвенирования SEQ ID NO:46 и 47. В соответствии с результатами WAMPredict (https://antibody.bath.ac.uk/WAMpredict.html), канонические классы гипервариабельных петель следующие: CDR-L1 - 1, CDR-L2 - 1, CDR-L3 - 1, CDR-h2 - 1, CDR-h3 - 2, CDR-h4, Длина: 6, Статус перегиба: Изогнуты.

Пример 6. Конструирование экспрессионной системы для продукции Fab фрагмента мышиного моноклонального антитела против антигена F1 из Y. pestis и получение указанного антитела в дрожжах.

Конструирование экспрессионных кассет.

Гены, кодирующие цепи Fab фрагмента мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis, амплифицировали с помощью ПЦР для их введения в экспрессионные кассеты. Плазмиды pUC18-F1-L и pUC18-F1-H использовали в качестве матриц.

Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный домен легкой цепи, использовали 5'-праймер Lf (SEQ ID NO:48) и 3'-праймер Lr (SEQ ID NO:50. 5'-Праймер Lf содержит на 5'-конце сайт рестрикции XhoI, необходимый для дальнейшего присоединения к сигнальной последовательности α-фактора, 3'-праймер Lr содержит на 5'-конце сайт рестрикции XbaI. Фрагмент ДНК XhoI - XbaI с легкой цепью лигировали в модифицированную плазмиду pPICZαA (Invitrogen), в которой сайт рестрикции PmeI был разрушен методом сайт-направленного мутагенеза.

Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный домен тяжелой цепи, использовали 5'-праймер Hf (SEQ ID NO:51) и 3'-праймер Hr (SEQ ID NO:53). 5'-Праймер Hf содержит на 5'-конце сайт рестрикции XhoI, необходимый для дальнейшего присоединения к сигнальной последовательности α-фактора, 3'-праймер Hr содержит на 5'-конце сайт рестрикции XbaI. Фрагмент ДНК XhoI - XbaI с тяжелой цепью лигировали в оригинальную версию плазмиды pPICZαA.

Объединение генов

Объединение генов обеих цепей фрагмента Fab на одной плазмиде осуществляли путем двойного расщепления вектора с легкой цепью рестриктазами BglII и BamHI с последующим введением в уникальный сайт BamHI вектора с тяжелой цепью.

Таким образом был сконструирован экспрессионный вектор pPICZαA-F1-mouse-H-L, содержащий последовательности, кодирующие обе цепи фрагмента Fab мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis, каждая из которых непосредственно соединена в одной рамке считывания с сигнальной последовательность α-фактора из Saccharomyces cerevisiae под контролем промотора АОХ1 (Фиг.8).

Получение трансформантов дрожжей и анализ продукции Fab.

Экспрессионную плазмиду pPICZαA-F1-mouse-H-L, линеаризованную с помощью рестриктазы PmeI, вводили в клетки GS115 в соответствии с протоколом INVITROGEN с помощью методики, использующей L1C1. Полученные трансформанты обозначили как GS115/AOX-F1-mouse-H-L.

12 независимых трансформантов клонов GS115/AOX-F1-mouse-H-L выращивали в пробирках (V=4 мл) в течение 45 часов при 30°С и рН 6.0 с использованием питательной среды BMMY (Invitrogen) (конечная оптическая плотность OD 40). Измерение количества фрагментов Fab в культуральной жидкости было произведено методом ELISA. В соответствии с результатами этого метода отбирали штаммы, продуцирующие фрагмент Fab мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis. Отобранные клоны штаммов-продуцентов GS115/AOX-F1-mouse-H-L выращивали в колбах (V=100 мл) в течение 45 часов при 30°С и рН 6.0 на среде YPM.

Культуральные жидкости штаммов-продуцентов анализировали с помощью Вестерн-блотинга. Полученные результаты представлены на Фиг.9. Из этих данных специалист может сделать заключение, что некоторые штаммы-продуценты GS115/АОХ-F1-mouse-H-L секретируют в культуральную жидкость белки, которые могут быть детектированы за счет взаимодействия с анти-мышиными антителами с использованием Вестерн-блотинга. Предположительно эти белки являются отдельными цепями фрагмента Fab мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis.

Метод ELISA для анализа фрагментов антител в культуральной жидкости:

- Сорбция белков культуральной жидкости 100 мкл на лунку в течение 2 часов при комнатной температуре;

- Промывка лунок три раза буфером PBS;

- Блокировка 3% БСА в PBS (200 мкл на лунку) в течение 2 часов при комнатной температуре;

- Промывка лунок три раза буфером PBS с 0,05% Tween 20;

- Инкубирование с козьими анти-мышиными антителами;

- Промывка 5 раз буфером PBS с 0,05% Tween 20;

- Добавление о-фенилендиамина 100 мкл (4 мг/10 мл) с h3O2 в буфере рН 5.0;

- Остановка реакции добавлением 100 мкл 10% h3SO4.

Пример 7. Характеристика аффинности фрагментов Fab мышиных моноклональных антител против антигена F1 из Y. pestis, произведенных дрожжами.

Продукция и характеристика природного мышиного фрагмента Fab из MoAb F19. Протеолиз MoAb F19 проводили пепсином в соотношении 1:100 к тотальному IgG в присутствии 10 мМ цистеина в течение 20 часов при 37°С, в результате бы получен фрагмент Fab. Как следует из данных электрофореза, полученный препарат содержал определенное количество других продуктов гидролиза, которые затрудняли определение количества фрагмента Fab, поэтому очистку успешно осуществили методом гель-фильтрации на колонке с Sephadex G50. Анализ 4 полученных фракций приведен на Фиг.10. Все 4 фракции содержали как фрагменты Fab, так и фрагменты Fab'. Фрагменты Fab, преобладающие в четвертой фракции, выбрали для последующих экспериментов.

Разработка метода ELISA для оценки количества рекомбинантного фрагмента Fab.

Для разработки метода ELISA для детекции рекомбинантного фрагмента Fab была предпринята попытка использовать конъюгат с «хвостом» анти-His6, которая не увенчалась успехом из-за неполной доступности всех 6 гистидинов для связывания. Был приготовлен конъюгат с пероксидазой хрена и MoAb против мышиных Ig каппа-легких цепей. Для этого 0.5 мл асцитов MoAb против мышиных каппа-легких цепей, клон ЕМ-34.1 (Sigma, cat. No K-2132), очищали троекратным осаждением в сульфате натрия и конъюгировали с пероксидазой хрена. Природные мышиные фрагменты Fab MoAb F19 использовали в качестве стандарта. Результаты показаны на Фиг.11.

Определение констант диссоциации рекомбинантных и природных фрагментов Fab.

Константы диссоциации (Kd) определяли в ходе двухступенчатого метода ELISA, как описано в Примере 2. Результаты представлены на Фиг.12.

Таким образом, Kd для природного моноклонального фрагмента Fab природного мышиного антитела MoAb F19 против антигена F1 из Y. pestis составляет

Kd для рекомбинантного фрагмента Fab против антигена F1 из Y. pestis составляет

Таким образом был получен рекомбинантный фрагмент Fab, обладающий высокой специфичностью против антигена F1 из Y. pestis и высокой константой диссоциации.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы являются частью настоящей заявки, включенные путем ссылки.

1. Изолированное мышиное антитело, селективно связывающееся с антигеном F1 из Yersinia pestis, отличающееся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи (VH) указанного антитела включает в себя последовательность аминокислот SEQ ID NO:1, а вариабельный домен легкой цепи (VL) указанного антитела включает в себя последовательность аминокислот SEQ ID NO:2.

2. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антитело по п.1.

3. Антигенсвязывающий фрагмент (Fab), селективно связывающийся с антигеном F1 из Yersinia pestis, который включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2.

4. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий фрагмент (Fab) по п.3.

5. Клетка дрожжей, трансформированная фрагментом ДНК по п.4 и обладающая способностью к продукции Fab по п.3.

6. Клетка дрожжей по п.5, отличающаяся тем, что указанными дрожжами являются дрожжи Pichia pastoris.

7. Способ получения Fab по п.3, включающий в себя выращивание клеток дрожжей по п.5 в питательной среде и выделение указанного Fab из культуральной жидкости.

8. Способ детекции Yersinia pestis, включающий в себя: (а) получение образца от животного или человека; (b) взаимодействие указанного образца с антителом по п.1 или Fab по п.3; (с) детектирование комплекса, образованного указанным антителом или Fab, и антигена F1; и, необязательно, (d) определение количества антигена F1, присутствующего в указанном образце, на основании детектированного количества комплекса, образованного антителом и антигеном F1, или комплекса, образованного Fab и антигеном F1.

9. Набор для детекции антигена F1 из Yersinia pestis, содержащий изолированные моноклональные антитела по п.1 или Fab по п.3, которые селективно связываются с антигеном F1 из Yersinia pestis, и средства, позволяющие детектировать указанный антиген F1 с использованием указанного антитела или Fab.

www.findpatent.ru


Смотрите также