Способ разделения лактоферринов человека и козы с помощью дифференциальной иммуноаффинной хроматографии с использованием однодоменных мини-антител. Мини антитела


От рака вылечит… верблюд!

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Молекулярное биоразнообразие у позвоночных чрезвычайно велико. Однако недавнее открытие полнофункциональных антител сильно упрощенной структуры, существующих в природе в дополнение к традиционным антителам у представителей семейства Верблюдовых и некоторых хрящевых рыб, оказалось одним из важнейших сюрпризов молекулярной иммунологии последних 20 лет. Постоянное увеличение числа публикаций об этих антителах и потребность в технологиях их производства говорят о стремительно возрастающем интересе к этим уникальным молекулам.

Главный спонсор конкурса — дальновидная компания Генотек.Конкурс поддержан ОАО «РВК».

Обратите внимание!

Эта работа представлена на конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст»-2014 в номинации «Своя работа».

Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики. Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon. Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Верблюды — одни из самых необычных животных нашей планеты. Все мы с детства знаем, что они способны жить в довольно-таки экстремальных условиях: ни одно другое животное не выжило бы в жаркой пустыне, питаясь одними лишь колючками и обходясь практически без воды. Внешне верблюды выглядят весьма своеобразно, однако и их «внутренний мир» не менее необычен. Во-первых, эритроциты верблюдов имеют овальную форму, что защищает их организм от обезвоживания (у всех остальных млекопитающих эритроциты круглые, что при обезвоживании приводит к «слипанию» друг с другом). Но есть у верблюдов и другая, не менее удивительная особенность, а именно — наличие особых антител. Именно этому и будет посвящён дальнейший рассказ.

Наши защитники — антитела

Что такое антитела? Это особые молекулы иммунной системы, имеющие гликопротеиновую природу, и способные распознавать чужеродные для организма структуры, такие как вирусы, бактерии, и другие потенциально вредные агенты, называемые одним словом — антигены [1, 2]. При распознавании антигена антитела передают информацию о нём клеткам иммунной системы — лимфоцитам, — и те в свою очередь уничтожают вредоносный агент. У человека и у всех млекопитающих антитело — это структура, состоящая из двух тяжёлых и двух лёгких цепей. Антитела, обладающие такой структурой, называются классическими. Их тяжёлые и лёгкие цепи в свою очередь состоят из вариабельных (V) и константных (C) доменов. Тяжёлые цепи содержат один вариабельный (VH) и три константных домена (Сh2, Сh3, Сh4), лёгкие цепи — один вариабельный (VL) и один константный (СL) домены (рис. 1). Именно такое строение обеспечивает способность антител узнавать конкретные антигены (это называется вариабельностью антител и осуществляется V-доменами) и взаимодействовать с клетками собственной иммунной системы (эффекторная функция антител; за неё ответственны C-домены).

Рисунок 1. Схема строения классического антитела. Ch2, Ch3, Ch4 — константные домены тяжёлой цепи, СL — константный домен лёгкой цепи; VH — вариабельный домен тяжёлой цепи, VL — вариабельный домен лёгкой цепи. Вариабельные домены образуют антиген-распознающий фрагмент, а константные — эффекторный (связывающийся с лимфоцитами). Картинка из википедии с изменениями.

Рисунок 2. Схема строения верблюжьего антитела, HCAb. Ch2, Ch3 — константные домены. VHH — вариабельный домен. VHH сами по себе образуют наноантитела.

Молекулярный сюрприз

В 1993 году группа бельгийских учёных обнаружила в крови млекопитающих семейства Верблюдовых (верблюдов, лам, викуний и альпак) антитела, структура которых заметно отличалась от структуры вышеописанных классических антител [3]. Позднее подобные антитела были обнаружены также у некоторых видов акул и родственных им хрящевых рыб [4]. Поскольку казалось, что с травоядными млекопитающими работать всё же проще и безопаснее, чем с хищными рыбами, учёные решили взяться за основательное изучение именно верблюжьих антител. И сделали удивительное открытие: антитела, присутствующие в крови у Верблюдовых, имеют уникальную структуру — они состоят только из фрагмента одной укороченной тяжелой цепи, а лёгкие цепи у них отсутствуют (рис. 2).

Эти антитела были названы HCAb («heavy chain antibody»). Антиген-узнающий участок HCAb формируется лишь одним вариабельным доменом — VHH (Variable domain of the Heavy chain of the Heavychain antibody). Позднее учёные установили, что VHH — полностью функциональная молекула, которая способна распознавать и связывать антиген ничуть не хуже, чем вариабельные домены классических антител. Даже при их изоляции от константных доменов антитела они сохраняют способность связываться с антигенами так же, как и обычные антитела. Вдобавок к этому, они являются и самыми миниатюрными из всех известных белков с аналогичными свойствами. Их размер достигает примерно 2×4 нм. Поэтому этот фрагмент и получил название «наноантитело», «нанотело» или «мини-антитело».

«Мал да удал» — поговорка именно про нанотела. За счёт своих малых размеров эти антитела получают ряд преимуществ. В первую очередь, важно то, что они легко проникают в труднодоступные органы и ткани организма, куда классическим антителам проникнуть сложно или даже невозможно из-за их крупных размеров. Благодаря структурным особенностям, нанотела способны распознавать такие участки в антигенах, которые недоступны классическим антителам.

Важной особенностью является то, что наноантитела очень стабильны и не разрушаются ни при низких, ни при высоких температурах, ни при различных значениях pH. Их легче, проще и экономичнее синтезировать в больших количествах, что необходимо при производстве лекарств [5]. Также стоит отметить, что с наноантителами легко производить разнообразные генно-инженерные манипуляции, и то, что они практически не иммуногены (то есть не вызывают иммунного ответа). Итак, учёные поняли, что перед ними — мощный инструмент, который можно использовать в терапии и лечении множества заболеваний. Изучением верблюжьих наноантител занимается и наша Лаборатория молекулярных биотехнологий в Институте биологии гена РАН.

Нанотела по-русски

Итак, первое и самое главное условие — для того, чтобы получить уникальные наноантитела, нужен верблюд, в организме которого они будут синтезироваться. В 2004 году выбор пал на двугорбого верблюда (Camelus bactrianus), поскольку он является наиболее приспособленным к суровой русской зиме представителем семейства Верблюдовых. Далее начинается основная работа. В нашей лаборатории была отработана и усовершенствована следующая схема получения наноантител (рис. 3) [5]:

  • Иммунизация верблюда антигеном для того, чтобы вызвать образование конкретных антител.
  • Отбор крови животного. Примечание: ни одно животное при этом не пострадало! Потому что для дальнейших процедур достаточно взять всего 100 мл крови верблюда.
  • Клонирование последовательности генов наноантител из В-лимфоцитов, содержащихся в крови. Для этого выделяется РНК, и на её основе синтезируется комплементарная ДНК, а затем последовательности амплифицируются методом ПЦР.
  • Встраивание последовательностей наноантител в геном фага и отбор антител, специфических к необходимому антигену, методом фагового дисплея. Эта технология основана на встраивании чужеродных нуклеотидных последовательностей в один из генов, кодирующих белки оболочки бактериофага. Метод фагового дисплея позволяет «разместить» на поверхности бактериофага молекулу антитела, и таких вариантов получают множество. Методика заключается в следующем: бактериофаги, несущие миллионы различных фрагментов антител, наносят на колонку, содержащую нужный антиген. После отмывания ненужных фагов те, которые связывают данный антиген, снимают с колонки и размножают в бактериях. Нуклеотидная последовательность отобранных фагов может быть модифицирована, после чего мутированные фаги размножают в бактериях и повторяют процесс селекции [1].В нашей лаборатории была предложена модификация, повышающая эффективность отбора наноантител. Она носит универсальный характер и заключается в частичной делеции гена gIII фага M13, использование которого при соответствующих изменениях в процедуре приводит к значительному уменьшению фона и повышению эффективности процедуры селекции [6].
  • Анализ отбираемых клонов методом, предложенным в нашей лаборатории — методом параллельного рестрикционного анализа (фингерпринтинга) [7]. Этот метод позволяет лучше контролировать процесс селекции и частично заменяет секвенирование.

Рисунок 3. Схема получения библиотеки наноантител.

Рисунок 4. «Chromobody» — нанотело, связанное с красным флуоресцентным белком, RFP. Рисунок с сайта idw-online.de.

Верблюжьи наноантитела — на страже нашего здоровья

Область применения наноантител очень широка — это разные отрасли науки, биотехнологии и медицины. Была продемонстрирована возможность использования наноантител в качестве ингибиторов ферментов [8] за счёт их малого размера и способности проникать в каталитический центр. Также их можно использовать как аффинные лиганды [9], интратела [10], зонды в биосенсорах [11] и как инструмент изучения белок-белковых взаимодействий [12]. Благодаря своим малым размерам, наноантитела являются идеальными кандидатами для разработки небольших пептидомиметиков [13]. Наноантитела могут быть также использованы в пищевой промышленности, — например, при производстве сыра, поскольку способны предотвратить инфекцию молочнокислых бактерий фагом и ускорить брожение [14].

Сейчас стремительно развиваются методы оптической микроскопии, позволяющие исследовать такие биологические процессы как экспрессия белка, движение клеток, их локализацию и активность. В качестве инструмента визуализации этих процессов часто используют флуоресцентные белки. Эти белки после поглощения света определенной длины волны переизлучают его, но уже в более длинноволновом диапазоне [15]. Если объединить нанотело и флуоресцентный белок с помощью генно-инженерных методов, можно получить конструкцию, называемую «chromobody» (рис. 4) [10]. Подобный подход открывает принципиально новую возможность исследовать поведение антигенов в живых клетках.

Однако наиболее важная область применения наноантител — улучшение здоровья человека и животных. Особенно актуально их использование в профилактике и лечении раковых заболеваний. Область онкотерапии сейчас развивается бурными темпами. Например, одна из последних тенденций в терапии и лечении рака — применение специальных гликопротеинов лектинов [16]. Использование антител также является одним из новых и перспективных трендов в этой области. Можно синтезировать антитела, которые будут распознавать участки раковых клеток и прикрепляться к ним. За счёт этого опухоль станет более заметной и уязвимой для клеток иммунной системы. Для этих целей можно использовать классические антитела, однако наноантитела являются более удобными и эффективными, — опять же, благодаря малым размерам, поскольку для успешного лечения солидной опухоли прежде всего необходимо обеспечить доступ достаточного количества антител к различным её участкам [17].

Для этих целей как нельзя лучше подходят небольшие наноантитела. Они способны проникать в твердые опухоли более эффективно, чем более крупные классические антитела. Но и выводятся из организма они значительно быстрее, при этом успевая подействовать на опухоль [18]. Наноантитела можно использовать как эффективные тест-системы для диагностики рака. Было создано несколько нанотел, которые распознают человеческий простат-специфический антиген — молекулу, образующуюся при раке простаты у мужчин [19]. Эти нанотела определяют концентрацию простат-специфического антигена, за счёт чего можно установить, болен ли пациент, и предложить ему оптимальную схему лечения [11].

Еще одним из механизмов противоопухолевого действия антител является блокирование ими факторов роста, ускоряющих развитие раковых клеток. В норме эти вещества стимулируют деление и рост нормальных клеток. Однако действие факторов роста неспецифично, и они помогают злокачественным клеткам в том числе. В нашей лаборатории были получены наноантитела, специфичные к фактору роста эндотелия сосудов [19]. Блокирование взаимодействия этого фактора роста с рецептором опухолевой клетки предотвращает ангиогенный эффект, то есть вокруг опухоли не разрастается сеть кровеносных сосудов, и, не получая достаточного кровоснабжения, она перестаёт расти и метастазировать.

Наноантитела, помимо использования для диагностики и лечения рака, также можно применять и при других заболеваниях. Уже есть предварительные исследования, которые показывают, что с помощью нанотел можно лечить болезни Альцгеймера и Паркинсона, вызываемые «слипанием» белков. Нанотела способны не только предотвращать их агрегацию, но и, что более интересно, устранять уже существующие агрегаты [20].

Множество недавних исследований посвящено использованию наноантител для борьбы с вирусами и другими инфекциями [21]. В том числе, это изучается и в нашей лаборатории. Например, было показано, что введение мышам наноантител определённой конфигурации за 2 часа до или через 24 часа после инфицирования вирусом гриппа типа H5N2 защищает животных от летального исхода [22].

«Нет ничего более изобретательного, чем природа», — сказал Цицерон. Нет сомнений в том, что природа приготовила учёным ещё множество загадок. Одна из них — загадка о верблюжьих наноантителах — уже раскрыта. Сделано множество открытий, показывающих, что нанотела верблюда обладают поистине уникальными свойствами. В будущем наноантитела могут использоваться как эффективное дополнение к существующим подходам на основе моноклональных антител, так и в качестве самостоятельной технологии уникальных антиген-распознающих белков.

Рисунок 5. Верблюд — лекарь будущего. Источник: nationalgeographic.com.

  1. Моноклональные антитела;
  2. Иммунологическая Нобелевская премия (2011);
  3. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Bajyana Songa E., BendahmanN., Hamers R. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 446–448;;
  4. Greenberg A.S., Avila D., Hughes M., Hughes A., Mckinney E.C., Flajnik M.F. (1995). A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature 374, 168–173;;
  5. Тиллиб С.В. (2011). «Верблюжьи наноантитела» — эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 45, 1–9;;
  6. Вятчанин А.С., Тиллиб С.В. (2008). Модификации процедуры фагового дисплея для повышения эффективности селекции антиген—связывающих доменов особых одноцепочечных верблюжьих антител. Биотехнология 4, 32–34;;
  7. Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. (2010). Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 6, 100–108;;
  8. Koch-Nolte F., Reyelt J., Schössow B., Schwarz N., Scheuplein F., Rothenburg S., Haag F., Alzogaray V., Cauerhff A., Goldbaum F.A. (2007). Single domain antibodies fromllama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490–3498;;
  9. Klooster R., Maassen B.T.H., Stam J.C., Hermans P.W., ten Haaft M.R., Detmers F.J.M., de Haard H.J., Post J.A., Verrips C.T. (2007). Improved anti-IgG and HSA affinity ligands: clinical application of VHH antibody technology. J. Immunol. Methods 324, 1–12;;
  10. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl A., Backman N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt H. (2006). Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nat. Methods 3, 887–889;;
  11. Huang L., Reekmans G., Saerens D., Friedt J.M., Frederix F., Francis L., Muyldermans S., Campitelli A., Van Hoof C. (2005). Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483–490;;
  12. Huang Y., Verheesen P., Roussis A., Frankhuizen W., Ginjaar J., Haldane F., Laval S., Anderson L.V.B., Verrips T., Frants R.R. et al. (2005). Protein studies in dysferlinopathy patients using llama-derived antibody fragments selected by phage display. Eur. J. Hum. Genet. 13, 721–730;;
  13. Marquardt A., Muyldermans S., Przybylski M. (2006). A synthetic camel anti-lysozyme peptide antibody (peptibody) with flexible loop structure identified by high-resolution affinity mass spectrometry. Chem. Eur. J. 12, 1915–1923;;
  14. Ledeboer A.M., Bezemer S., de Haard J.J.W., Schaffers I.M., Verrips C.T., van Vliet C., Düsterhöft E.-M., Zoon P., Moineau S., Frenken L.G.J. (2002). Preventing phage lysis of Lactococcus lactis in cheese production using a neutralizing heavy-chain antibody fragment from llama. J. Dairy Sci. 85, 1376–1382;;
  15. Флуоресцентные репортеры и их молекулярные репортажи;
  16. Лектины — новые инструменты в диагностике и терапии злокачественных опухолей;
  17. Tunggal J.K., Cowan D.S., Shaikh H., Tannock I.F. (1999). Penetration of anticancer drugs through solid tissue: a factor that limits the effectiveness of chemotherapy for solid tumors. Clin. Cancer Res. 5, 1583–1586;;
  18. Milenic D.E., Yokota T., Filpula D.R., Finkelman M.A., Dodd S.W., Wood J.F., Whitlow M., Snoy P., Schlom J. (1991). Construction, binding properties, metabolism, and tumor targeting of a single-chain Fv derived from the pancarcinoma monoclonal antibody CC49. Cancer Res. 51, 6363–6371;;
  19. Tillib S.V., Ivanova T.I., Lyssuk E.Y., Larin S.S., Kibardin A.V., Korobko E.V., Vikhreva P.N., Gnuchev N.V., Georgiev G.P., Korobko I.V. (2012). Nanoantibodies for detection and blocking of bioactivity of human vascular endothelial growth factor A (165). Biochemistry 77, 659–665;;
  20. Dumoulin M., Last A.M., Desmyter A., Decanniere K., Canet D., Larsson G., Spencer A., Archer D.B., Sasse J., Muyldermans S. et al. (2003). A camelid antibody fragment inhibits the formation of amyloid fibrils human lysozyme. Nature 424, 783–788;;
  21. Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J., et al. (2009). Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med. Microbiol. Immunol. 198, 157–174;;
  22. Tillib S., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Saakyan S.A., Gribova I.Y., Tutykhina I.L., Sedova E.S., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. (2013). Formatted single-domain antibodies can protect mice against infection with influenza virus (H5N2). Antiviral Research 97, 245–254..

biomolecula.ru

Диссертация на тему «Генерирование мини-антител для исследования компонентов клеточного ядра» автореферат по специальности ВАК 03.00.03 - Молекулярная биология

1. Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies// FEBS Lett.- 1997.-414(3). P.521-6.

2. Azzazy, H.M. and Highsmith W.E., Jr. Phage display technology: clinical applications and recent innovations// Clin Biochem. 2002.- 35(6). P.425-45.

3. Begent, R.H. and Chester K.A. Single-chain Fv antibodies for targeting cancer therapy// Biochem Soc Trans. 1997.- 25(2). P.715-7.

4. Benvenuto, E., Ordas R.J., Tavazza R.s Ancora G., Biocca S., Cattaneo A., Galeffi P. 'Phytoantibodies': a general vector for the expression of immunoglobulin domains in transgenic plants//Plant Mol Biol. 1991.- 17(4). P.865-74.

5. Berry, M.J. and Davies J. Use of antibody fragments in immunoaffinity chromatography. Comparison of FV fragments, VH fragments and paralog peptides// J Chromatogr. 1992.-597(1-2). P.239-45.

6. Bird, R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee S.M., Lee T., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. Single-chain antigen-binding proteins// Science. 1988.-242(4877). P.423-6.

7. Boak, J.L., Mitchison N.A., Pattisson P.H. The carrier effect in the secondary response to hapten-protein conjugates. 3. The anatomical distribution of helper cells and antibody-forming-cell-precursors//Eur J Immunol. 1971.- 1(2). P.63-5.

8. Boulianne, G.L., Hozumi N., Shulman M.J. Production of functional chimaeric mouse/human antibody//Nature. 1984.- 312(5995). P.643-6.

9. Chester, K.A., Begent R.H., Robson L., Keep P., Pedley R.B., Boden J.A., Boxer G., Green A., Winter G., Cochet O., et al. Phage libraries for generation of clinically useful antibodies// Lancet. 1994,- 343(8895). P.455-6.

10. Conrath, K.E., Wernery U., Muyldermans S., Nguyen V.K. Emergence and evolution of functional heavy-chain antibodies in Camelidae// Dev Comp Immunol. 2003.- 27(2). P.87-103.

11. Cook, G.P. and Tomlinson I.M. The human immunoglobulin VH repertoire// Immunol Today. 1995.- 16(5). P.237-42.

12. Crissman, J.W. and Smith G.P. Gene-III protein of filamentous phages: evidence for a carboxyl-terminal domain with a role in morphogenesis// Virology. 1984.- 132(2). P.445-55.

13. Cwirla, S.E., Peters E.A., Barrett R.W., Dower W.J. Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands// Proc Natl Acad Sci USA.- 1990.- 87(16). P.6378-82.

14. Davies, J. and Riechmann L. 'Camelising' human antibody fragments: NMR studies on VH domains//FEBS Lett. 1994.- 339(3). P.285-90.

15. Davies, J. and Riechmann L. Antibody VH domains as small recognition units// Biotechnology (NY). 1995,- 13(5). P.475-9.

16. Davies, J. and Riechmann L. Affinity improvement of single antibody VH domains: residues in all three hypervariable regions affect antigen binding// Immunotechnology. 1996.- 2(3).1. P. 169-79.

17. Davies, J. and Riechmann L. Single antibody domains as small recognition units: design and in vitro antigen selection of camelized, human VH domains with improved protein stability// Protein Eng. 1996.- 9(6), P.531-7.

18. De Genst, E., Saerens D., Muyldermans S., Conrath K. Antibody repertoire development in camelids// Dev Comp Immunol. 2006.- 30(1-2). P. 187-98.

19. Decanniere, K., Muyldermans S., Wyns L. Canonical antigen-binding loop structures in immunoglobulins: more structures, more canonical classes?//J Mol Biol. 2000.- 300(1). P.83-91.

20. Desmyter, A., Transue T.R., Ghahroudi M.A., Thi M.H., Poortmans F., Hamers R., Muyldermans S., Wyns L. Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme// Nat Struct Biol. 1996,- 3(9). P.803-11.

21. Devlin, J. J., Panganiban L.C., Devlin P.E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules// Science. 1990.- 249(4967). P.404-6.

22. Dumoulin, M., Conrath K., Van Meirhaeghe A., Meersman F,, Heremans K., Frenken L.G., Muyldermans S., Wyns L,, Matagne A. Single-domain antibody fragments with high conformational stability// Protein Sci. 2002.- 11(3). P.500-15.

23. Elkabetz, Y., Argon Y., Bar-Nun S. Cysteines in CHI underlie retention of unassembled Ig heavy chains//J Biol Chem. 2005.- 280(15). P. 14402-12.

24. Els Conrath, K., Lauwereys M., Wyns L., Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs// J Biol Chem. 2001.-276(10). P.7346-50.

25. Ewert, S., Cambillau C., Conrath K., Pluckthun A. Biophysical properties of camelid V(HH) domains compared to those of human V(H)3 domains// Biochemistry. 2002.- 41(11). P.3628-36.

26. Frenken, L.G., Hessing J.G., Van den Hondel C.A., Verrips C.T. Recent advances in the large-scale production of antibody fragments using lower eukaryotic microorganisms// Res Immunol. 1998.- 149(6). P.589-99.

27. Galfre, G. and Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures// Methods Enzymol. 1981.- 73(Pt B). P.3-46.

28. George, A. J., Spooner R.A., Epenetos A. A. Applications of monoclonal antibodies in clinical oncology//Immunol Today. 1994,- 15(12). P.559-61.

29. Gilliland, L.K., Walsh L.A., Frewin M.R., Wise M.P., Tone M., Hale G., Kioussis D., Waldmann H. Elimination of the immunogenicity of therapeutic antibodies// J Immunol. -1999.- 162(6). P.3663-71.

30. Glockshuber, R., Malia M., Pfitzinger I., Pluckthun A. A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments// Biochemistry. 1990.- 29(6). P. 1362-7.

31. Gorman, S.D. and Clark M.R. Humanisation of monoclonal antibodies for therapy// Semin Immunol. 1990,- 2(6). P.457-66.

32. Greenberg, A.S., Avila D., Hughes M., Hughes A., McKinney E.C., Flajnik M.F. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks// Nature. 1995.- 374(6518). P. 168-73.

33. Hamers-Casterman, C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains// Nature. -1993.-363(6428). P.446-8.

34. Harmsen, M.M., Ruuls R.C., Nijman I.J., Niewold T.A., Frenken L.G., de Geus B. Llama heavy-chain V regions consist of at least four distinct subfamilies revealing novel sequence features// Mol Immunol. 2000,- 37(10). P.579-90.

35. Holliger, P., Prospero T., Winter G. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments// Proc Natl Acad Sci USA.- 1993.- 90(14). P.6444-8.

36. Hoogenboom, H.R. Overview of antibody phage-display technology and its applications// Methods Mol Biol. 2002.- 178 P. 1-37.

37. Hoogenboom, H.R., de Bruine A.P., Hufton S.E., Hoet R.M., Arends J.W., Roovers R.C. Antibody phage display technology and its applications// Immunotechnology. 1998.- 4(1). P. 1-20.

38. Hoogenboom, H.R. and Winter G. By-passing immunisation. Human antibodies from synthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro// J Mol Biol. 1992.- 227(2). P.381-8.

39. Huse, W.D., Sastry L., Iverson S.A., Kang A.S., Alting-Mees M., Burton D.R., Benkovic S.J., Lerner R.A. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda// Science. 1989.- 246(4935). P. 1275-81.

40. Jespers, L., Schon O., Famm K., Winter G. Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation//Nat Bioteehnol. 2004.- 22(9). P. 1161-5.

41. Jones, P.T., Dear P.H., Foote J., Neuberger M.S., Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse//Nature. 1986.-321(6069). P.522-5.

42. Klinman, N.R. The cellular origins of memory B cells// Semin Immunol. 1997.- 9(4). P.241-7.

43. Kohler, G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity//Nature. 1975.- 256(5517). P.495-7.

44. Kuus-Reichel, K., Grauer L.S., Karavodin L.M., Knott C., Krusemeier M., Kay N.E. Will immunogenicity limit the use, efficacy, and future development of therapeutic monoclonal antibodies?// Clin Diagn Lab Immunol. 1994.- 1(4). P.365-72.

45. Kuzin, B.s Tillib S., Sedkov Y., Mizrokhi L., Mazo A. The Drosophila trithorax gene encodes a chromosomal protein and directly regulates the region-specific homeotic gene fork head// Genes Dev. 1994.- 8(20). P.2478-90.

46. Laemrnli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970.- 227(5259). P.680-5.

47. Lauwereys, M., Arbabi Ghahroudi M., Desmyter A., Kinne J., Holzer W., De Genst E., Wyns L., Muyldermans S. Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy-chain antibodies// Embo J. 1998.- 17(13). P.3512-20.

48. Lebedeva, L.A. and Tillib S.V. Trithorax protein, a global factor for maintenance of tissue specific gene activation in Drosophila melanogaster, is associated with the nuclear matrix.// Genetika. 2003,- 39(2). P.250-8.

49. Lipovsek, D. and Pluckthun A. In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display//J Immunol Methods. 2004.- 290(1-2). P.51-67.

50. Maass, D.R., Sepulveda J., Pernthaner A., Shoemaker C.B. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs)// J Immunol Methods. 2007.- 324(1-2). P. 13-25.

51. Marks, J.D., Hoogenboom H.R., Bonnert T.P., McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage// J Mol Biol. 1991.-222(3). P.581-97.

52. Martensson, I.L., Keenan R.A., Licence S. The pre-B-cell receptor// Curr Opin Immunol. -2007.- 19(2). P. 137-42.

53. Marvin, D.A., Hale R.D., Nave C., Helmer-Citterich M. Molecular models and structural comparisons of native and mutant class I filamentous bacteriophages Ff (fd, fl, M13), Ifl and IKe// J Mol Biol. 1994.- 235(1). P.260-86.

54. McCafferty, J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains//Nature. 1990.- 348(6301). P.552-4.

55. Milstein, C. From the structure of antibodies to the diversification of the immune response// Embo J. 1985.- 4(5). P. 1083-92.

56. Morrison, S.L., Johnson M.J., Herzenberg L.A., Oi V.T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains// Proc Natl Acad Sci U S A. 1984.- 81(21). P.6851-5.

57. Muyldermans, S., Atarhouch T., Saldanha J., Barbosa J.A., Hamers R. Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains// Protein Eng. 1994.- 7(9). P. 1129-35.

58. Muyldermans, S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains// Trends Biochem Sci. 2001.- 26(4). P.230-5.

59. Muyldermans, S. and Lauwereys M. Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies// J Mol Recognit. 1999.- 12(2). P. 13140.

60. Nguyen, V.K., Desmyter A., Muyldermans S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae// Adv Immunol. 2001.- 79 P.261-96.

61. Nguyen, V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S. Loss of splice consensus signal is responsible for the removal of the entire C(H)1 domain of the functional camel IGG2A heavy-chain antibodies//Mol Immunol. 1999.- 36(8). P.515-24.

62. Nguyen, V.K., Hamers R., Wyns L., Muyldermans S. Camel heavy-chain antibodies: diverse germline V(H)H and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire// Embo J. -2000.- 19(5). P.921-30.

63. Nguyen, V.K., Muyldermans S., Hamers R. The specific variable domain of camel heavy-chain antibodies is encoded in the germline// J Mol Biol. 1998.- 275(3). P.413-8.

64. Nissim, A., Hoogenboom H.R., Tomlinson I.M., Flynn G., Midgley C., Lane D., Winter G. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents// Embo J. 1994.- 13(3). P.692-8.

65. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation// Trends Biochem Sci. 2000.- 25(3). P.99-104.

66. Padlan, E.A. A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties// Mol Immunol. 1991.- 28(4-5). P.489-98.

67. Padlan, E.A. Anatomy of the antibody molecule// Mol Immunol. 1994.-31(3). P. 169-217.

68. Parker, D.C. T cell-dependent B cell activation// Annu Rev Immunol. 1993.- 11 P.331-60.

69. Paul, W.E. Fundamental immunology. New York Raven Press 1993. xvii, 1490 p.c.

70. Paul-Murphy, J., Gershwin L.J., Thatcher E.F., Fowler M.E., Habig W.H. Immune response of the llama (Lama glama) to tetanus toxoid vaccination// Am J Vet Res. 1989.- 50(8). P. 127981.

71. Possee, R.D. Baculoviruses as expression vectors// Curr Opin Biotechnol. 1997.- 8(5). P.569-72.

72. Rader, C., Cheresh D.A., Barbas C.F., 3rd A phage display approach for rapid antibody humanization: designed combinatorial V gene libraries// Proc Natl Acad Sci USA.- 1998.-95(15). P.8910-5.

73. Rapoza, M.P. and Webster R.E. The products of gene I and the overlapping in-frame gene XI are required for filamentous phage assembly// J Mol Biol. 1995.- 248(3). P.627-38.

74. Ren, Z. and Black L.W. Phage T4 SOC and HOC display of biologically active, full-length proteins on the viral capsid// Gene. 1998.- 215(2). P.439-44.

75. Renisio, J.G., Perez J., Czisch M., Guenneugues M., Bornet O., Frenken L., Cambillau C., Darbon H. Solution structure and backbone dynamics of an antigen-free heavy chain variable domain (VHH) from Llama// Proteins. 2002.- 47(4). P.546-55.

76. Riechmann, L., Clark M., Waldmann H., Winter G. Reshaping human antibodies for therapy// Nature. 1988.- 332(6162). P.323-7.

77. Rodi, D.J. and Makowski L. Phage-display technology—finding a needle in a vast molecular haystack// Curr Opin Biotechnol. 1999.- 10(1). P.87-93.

78. Rondot, S., Anthony K.G., Dubel S., IdaN., Wiemann S., Beyreuther K., Frost L.S., Little M., Breitling F. Epitopes fused to F-pilin are incorporated into functional recombinant pili// J Mol Biol. 1998.- 279(3). P.589-603.

79. Santini, C., Brennan D., Mennuni C., Hoess R.H., Nicosia A., Cortese R., Luzzago A. Efficient display of an HCV cDNA expression library as C-terminal fusion to the capsid protein D of bacteriophage lambda//J Mol Biol. 1998,- 282(1). P.125-35.

80. Scott, J.K. and Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library// Science. -1990.- 249(4967). P.386-90.

81. Sidhu, S.S. Engineering M13 for phage display// Biomol Eng. 2001.- 18(2). P.57-63.

82. Skerra, A. and Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli// Science. 1988.- 240(4855). P.1038-41.

83. Smith, G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface// Science. 1985.- 228(4705). P.1315-7.

84. Smith, G.P. and Petrenko V.A. Phage Display// Chem Rev. 1997,- 97(2). P.391-410.

85. Spinelli, S., Frenken L., Bourgeois D., de Ron L., Bos W., Verrips T., Anguille C., Cambillau C., Tegoni M. The crystal structure of a llama heavy chain variable domain// Nat Struct Biol. 1996,- 3(9). P.752-7.

86. Spinelli, S., Frenken L.G., Hermans P., Verrips T., Brown K., Tegoni M., Cambillau C. Camelid heavy-chain variable domains provide efficient combining sites to haptens// Biochemistry. 2000.- 39(6). P.1217-22.

87. Tanha, J., Xu P., Chen Z., Ni F., Kaplan H., Narang S.A., MacKenzie C.R. Optimal design features of camelized human single-domain antibody libraries// J Biol Chem. 2001.- 276(27). P.24774-80.

88. Tavladoraki, P., Benvenuto E., Trinca S., De Martinis D., Cattaneo A., Galeffi P. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack//Nature. 1993.- 366(6454). P:469-72.

89. Terskikh, A.V., Le Doussal J.M., Crameri R., Fisch I., Mach J.P., Kajava A.V. "Peptabody": a new type of high avidity binding protein// Proc Natl Acad Sci USA.- 1997.-94(5). P. 1663-8.

90. Verhoeyen, M., Milstein C., Winter G. Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity// Science. 1988.- 239(4847). P. 1534-6.

91. Vu, K.B., Ghahroudi M.A., Wyns L., Muyldermans S. Comparison of llama VH sequences from conventional and heavy chain antibodies// Mol Immunol. 1997.- 34(16-17). P.1121-31.

92. Ward, E.S., Gussow D„ Griffiths A.D., Jones P.T., Winter G. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli// Nature. 1989.-341(6242). P.544-6.

93. Wessel, D. and Flugge U.I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids// Anal Biochem. 1984.- 138(1). P.141-3.

94. Winter, G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology// Annu Rev Immunol. 1994,- 12 P.433-55.

95. Woolven, B.P., Frenken L.G., van der Logt P., Nicholls P.J. The structure of the llama heavy chain constant genes reveals a mechanism for heavy-chain antibody formation// Immunogenetics. 1999.- 50(1-2). P.98-101.

96. Zou, X., Smith J.A., Nguyen V.K., Ren L., Luyten K., Muyldermans S., Bruggemann M. Expression of a dromedary heavy chain-only antibody and B cell development in the mouse// J Immunol. 2005,- 175(6). P.3769-79.

www.dissercat.com

Способ разделения лактоферринов человека и козы с помощью дифференциальной иммуноаффинной хроматографии с использованием однодоменных мини-антител

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу разделения лактоферринов человека и козы. Способ включает иммуноафинную хроматографию с использованием мини-антител a-hLF-1 и a-hLF-4, аминокислотные последовательности которых представлены как SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Изобретение может применяться для получения высокоочищенной фракции лактоферрина человека. Предложенное изобретение позволяет с высокой эффективностью осуществлять разделение белков лактоферринов человека и козы, содержащегося в молоке, с помощью однодоменных мини-антител. 6 ил., 2 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии. Изобретение позволяет осуществить разделение белков лактоферрина козы и рекомбинантного лактоферрина человека, содержащегося в молоке трансгенных коз, с помощью однодоменных мини-антител. Изобретение может применяться для получения высокоочищенной фракции лактоферрина человека с целью его использования в клиническом, специализированном, в том числе восстановительном питании у недоношенных детей, ослабленных пациентов, для восстановления неспецифического иммунитета, активации противомикробной защиты, в том числе в сочетании с антибиотикотерапией, а также в качестве самостоятельного иммуномодулирущего средства, в том числе вводимого пациенту путем инъекции.

Уровень техники

Известен способ разделения и очистки лактоферрина из молока с использованием сульфатного соединения; способ заключается в адсорбировании лактоферринсодержащего молока сульфатным полисахаридным соединением с последующим элюированием адсорбированного лактоферрина. Элирование адсорбированного лактоферрина предпочтительно проводится с использованием буфера, содержащего 0,4 до 1,5 M поваренной соли (патент ЕР 0348508). Данный способ не предполагает использования иммуноаффинной хроматографии и использования антител для разделения лактоферрина.

Известен способ очистки белков, способных связывать железо, в том числе лактоферрина, за счет взаимодействия со специфическим сорбентом, представляющим собой полисахарид с иммобилизованным железом (патент ЕР 0418704). Данный способ также не предполагает использование иммуноаффинной хроматографии и использование антител для разделения лактоферрина.

Известен метод выделения и очистки бычьего лактоферрина с использованием иммуноаффинной хроматографии с фиксированными антителами против бычьего лактоферрина на нерастворимом носителе с последующей элюцией (патент US 4668771). Метод не предполагает использования специфических однодоменных мини-антител для разделения лактоферрина человека.

Известен способ выделения и очистки лактоферрина человека с применением иммуноаффинной хроматографии с использованием моноклональных антител, полученных с применением гибридомной технологии (патент JP 60166619). Способ также не предполагает использования специфических однодоменных мини-антител для разделения лактоферрина человека, при этом основным недостатком данного подхода является относительная дороговизна технологии выделения и очистки целевого белка.

Известен способ очистки рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных животных (патент CN 101117351). Вначале подготавливают молочную сыворотку, удаляя молочный жир и казеин, затем сыворотку очищают катионно-обменной хроматографией, элюируют буфером 0,4-1 M NaCl и 20 мМ Na3PO4, для повышения чистоты рекомбинантного белка проводят ультрафильтрацию и диализ элюэнта. Способ не предполагает использования иммуноаффинной хроматографии и специфических однодоменных мини-антител для разделения лактоферрина человека.

Наиболее близким к заявленному изобретению является известный способ очистки лактоферрина с использованием анти-LF-одноцепочечных антител (патент CN 1730492). Способ предполагает получение анти-LF-одноцепочечных антител, выражающийся в последовательном выполнении следующих шагов: селекции и получения фаговых анти-LF-одноцепочечных антител, определение спектра антител, подходящих для дальнейшей экспрессии, выбор антител с наилучшей афинностью к антигену, трансформации в экспрессионный вектор для наработки и дальнейшая очистка с применением никель-хелатной хроматографии. Однако способ не предполагает использования иммуноаффинной хроматографии.

Таким образом, известные из уровня техники способы выделения и очистки лактоферрина предполагают, в основном, традиционные подходы для разделения белков, основанные на популярных методических приемах с различными модификациями. Согласно уровню техники способ разделения лактоферринов человека и козы с помощью дифференциальной иммуноаффинной хроматографии с использованием однодоменных мини-антител предложен авторами впервые.

Постановка задачи и раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание эффективного способа разделения лактоферринов человека и козы с использованием высокоспецифичных «мини-антител», позволяющих осуществлять высокоспецифическое и эффективное связывание лактоферрина человека (в том числе и рекомбинантного), при этом не связывая лактоферрин козы (эндогенный хозяйский лактоферрин трансгенного животного), что повысит выход целевого (экспрессирующегося с трансгенной конструкции) белка и существенно повысит степень его специфической очистки.

Техническая задача решается путем последовательного выполнения следующих этапов:

- Иммунизация животного (верблюда) препаратом афинноочищенного лактоферрина из женского молока. Анализ эффективности иммунизации проводится с помощью слежения за нарастанием титра соответствующих антител в сыворотке животного в ходе иммунизации.

- Генерирование специфически обогащенной библиотеки «мини-антител» путем клонирования последовательностей всего репертуара вариабельных доменов особых одноцепочечных верблюдоспецифических антител, используя мРНК из В-лимфоцитов периферической крови иммунизированного верблюда и проводя ряд последовательных генно-инженерных процедур (синтез кДНК, ПЦР-амплификации, клонирование наработанных фрагментов ДНК в фагмиде для фагового дисплея, высокоэффективная трансформация бактериальных клеток) и анализ качества получаемой библиотеки.

- Использование генерированной библиотеки «мини-антител» для различных процедур селекции методом фагового дисплея клонов мини-антител, специфически узнающих различные эпитопы человеческого лактоферрина.

- Отбор и анализ моноклонов, кодирующих мини-антитела, с помощью которых можно детектировать и осуществлять дифференциальную очистку именно человеческого лактоферрина от лактоферрина козы.

- Наработка отобранных мини-антител.

- Проверка эффективности их работы на модельных экспериментах.

Термин «однодоменные мини-антитела» означает антигенузнающие фрагменты (вариабельные домены) особых одноцепочечных антител (состоящих из димера только тяжелой цепи иммуноглобулина при отсутствии легких цепей), встречающихся в норме лишь у представителей семейства верблюдовых и некоторых видов хрящевых рыб.

Термин «элюат» означает материал, связавшийся с мини-антителами, а затем проэлюированный в щелочных условиях, разрушающих взимодействие антиген - антитело.

Термин «проскок» означает материал, не связавшийся с иммобилизованными мини-антителами.

Термин «очищенный рекомбинантный hLF» означает материал, связавшийся с мини-антителами на колонке, отмытый от примесей и затем проэлюированный.

Термин «hLF» означает лактоферрин человека.

Термин «gLF» означает лактоферрин козы.

Термины «a-hLF-1» и «a-hLF-4» означают однодоменные мини-антитела.

Основание осуществления изобретения

Лактоферрин является высококонсервативным, мономерным 80 - кДа белком, полипептидная цепь состоит из 690 аминокислот. Основным источником лактоферрина в организме млекопитающих являются мукозальные клетки эпителия, которые обеспечивают секрецию лактоферрина и обогащение им грудного молока. Кроме мукозальных клеток, его также секретируют нейтрофилы.

Лактоферрин представляет собой наиболее ценную белковую фракцию грудного молока млекопитающих. Биологические функции лактоферрина весьма разнообразны; будучи выделенным в высокоочищенную субстанцию, он обладает иммуномодулирующим, противовирусным, противобактериальным эффектом. Лактоферрин принадлежит к семейству т.н. трансферринов - особый вид специфических белков, осуществляющих транспортную функцию железа. Будучи ano-белком, лактоферрин осуществляет секвестрацию железа у микроорганизмов, что способствует обеднению их железом и дальнейшей гибели. Дополнительным преимуществом лактоферрина является его способность к связыванию с липополисахаридами бактериальной стенки, что усиливает вероятность сближения с микроорганизмами и, соответственно, создает условия для секвестрации железа.

Лактоферрин является одним из немногих белков, чья пространственная структура при попадании в желудочно-кишечный тракт не разрушается ферментами на пептиды в отличие от многих других белков. Это обстоятельство позволяет использовать лактоферрин для перорального введения, что дает ценные преимущества при изготовлении готовой лекарственной или пищевой формы белка.

Таким образом, лактоферрин представляет собой уникальное природное соединение, которое может применяться для лечения и профилактики иммунодефицитов, бактериальных и вирусных инфекций, как у взрослых, так и у детей. Отдельной строкой можно выделить использование лактоферрина при вскармливании недоношенных младенцев. Кроме вышеперечисленных свойств, у лактоферрина обнаруживаются и другие, не менее уникальные биологические активности, а именно - укрепление костной ткани (Amini & Nair, 2011), заживлении ран (Ashby et al., 2011), индукции апоптоза опухолевых клеток (Wang et al., 2011; Xu et al., 2010), многие другие.

Поскольку источником лактоферрина является грудное молоко, для получения высококонцентрированной фракции целевого белка необходимо разработать ряд высокотехнологичных приемов. Учитывая тот факт, что для получения лактоферрина в промышленных масштабах использовать в качестве сырья грудное женское молоко не представляется возможным, с этой целью необходимо разработать технологии получения, идентификации и разделения лактоферринов из молока трансгенных животных, в частности - коз.

Для эффективной очистки белка лактоферрина из биологического материала (в данном случае, молока) традиционно в ряде случаев применяется стадия иммуноаффинной хроматографии с использованием специфических антител. Данные антитела представляют собой моноклональные мышиные антитела, получение и наработка которых является весьма дорогостоящей процедурой. Эта проблема препятствует масштабному производству лактоферина. В этой связи необходимо применять иной подход, позволяющий минимизировать стоимость наработки специфических антител. Поэтому предпринимается попытка получить высокоспецифичные малые антитела, с помощью которых можно бы было целенаправленно очищать именно рекомбинантный (трансгенный) лактоферрин человека, отделяя его от козьего, мышиного либо других лактоферринов в зависимости от вида трансгенного животного.

Однодоменные мини-антитела представляют собой новый весьма перспективный инструмент для специфической детекции и очистки широкого спектра антигенов. В 1993 году группой бельгийских ученых было обнародовано важное открытие: в дополнение к классическим антителам у представителей семейства Camelidae (верблюды, ламы, викуньи) в крови присутствует значительная часть особых неканонических антител с упрощенной структурой (Hamers-Casterman et al, 1993). Они состоят из димера только одной укороченной (без СН1-домена) тяжелой цепи при отсутствии легкой цепи («heavy-chain antibody», HCAb). Антигенузнающий участок HCAb формируется лишь одним вариабельным доменом, который через шарнирный район непосредственно связан с Fc-доменом. Позднее, подобные неканонические одноцепочечные антитела были также обнаружены у некоторых видов акул и родственных им хрящевых рыб-химер. Антигенузнающий вариабельный домен этих антител обычно называют «nanobody» (нанотело), однодоменное мини-антитело или «наноантитело» (Ghassabeh et al., 2010; Тиллиб, 2011). Однодоменное мини-антитело (с размерами ~2,5 нм в диаметре и ~4 нм в высоту, 12-15 кДа) может быть эффективно клонировано и экспрессировано в бактериях и дрожжах в виде мономера и является наименьшим из известных на сегодня белков, обладающих свойством специфически связывать антиген. Репертуар возможных паратопов (антигенсвязывающих структур антитела) в случае однодоменных мини-антител, по-видимому, может заметно отличаться от репертуара классических антител. Было показано, что гипервариабельный COR3-участок в мини-антителе (но не в VH или VL классического антитела) может образовывать необычные длинные пальцеобразные выступающие структуры, которые могут входить в щели, выемки антигена, в частности, узнавать активные центры ферментов. Малый размер антигенсвязывающего участка (VHH) и его способность формировать необычные выступающие паратопы объясняют возможность получения мини-антител, способных узнавать недоступные для классических антител эпитопы. Разработана весьма эффективная процедура генерирования и селекции однодоменных мини-антител. Получаемые мини-антитела в отличие от большинства рекомбинантных антител обычно обладают весьма высокой аффинностью к заданному антигену благодаря тому, что первая стадия их получения обычно подразумевает иммунизацию животного (из сем. Верблюдовых), в организме которого происходит их аффинное созревание in vivo. Мини-антитела обладают преимуществами, предполагающими большой потенциал их использования как для различного рода исследований и создания новых биотехнологических устройств, так и для диагностики и лечения заболеваний (Ghassabeh et al., 2010; Тиллиб, 2011).

Краткое описание фигур чертежей

Фиг 1. Схема функционально значимых нуклеотидных последовательностей, кодирующих адаптированное мини-антитело в экспрессионном плазмидном векторе. Слева направо: pelB - лидерный пептид, определяющий выход образующегося мини-антитела в периплазматическое пространство бактерии; собственно последовательность мини-антитела; (His)6 - последовательность, кодирующая пептид из шести остатков гистидина, позволяющая эффективно очищать мини-антитело с помощью с Ni2+-NTA- (или иной) хелатной группой коммерчески доступного препарата геля (агарозы) для аффинной хроматографии.

Фиг 2. А - результаты электрофоретического разделения hLF и gLF лактоферринов с помощью иммуноаффинной хроматографии на полученных колонках с иммобилизованными однодоменными антителами a-hLF-1 и a-hLF-4; Б - Сравнительная детекция hLF и gLF в элюатах после очистки на колонках с однодоменными антителами.

Фиг 3. Последовательности мини-антител a-hLF-1 и a-hLF-4. Аминокислотные последовательности представлены как SEQ ID NO:1 (Фиг. 3А) и SEQ ID NO:2 (Фиг. 3Б) (подчеркнуты гипервариабельные участки, - CDR1, CDR2 и CDR3), а нуклеотидные - как SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 (Фиг. 3В и 3Г) соответственно.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Получение мини-антител для детекции лактоферрина человека Схема выбранного варианта адаптированной нуклеотидной последовательности мини-антитела в используемых экспрессионных плазмидных векторах представлена на Фиг. 1. Экспрессионными плазмидными ДНК трансформировали бактериальные клетки E. coli (штамм XL1 или BL21). Наработку адаптированных мини-антител проводили следующим образом. Из одной свежевыросшей (после инкубации в течение ночи) колонии на чашке Петри выращивали 10 мл дневной культуры продуцента мини-антитела. Эти 10 мл культуры переносили в литровую колбу с 300 мл свежеприготовленной среды (ТВ или 2xTY) и растили до плотности, соответствующей поглощению 0.6 при длине волны 600 нм, после чего добавляли 1 мМ IPTG и инкубировали культуру на шейкере при 28°С в течение ночи при интенсивном перемешивании (220-250 об./мин). Клетки осаждали центрифугированием при 3000xg в течение 10 минут в случае бакет-ротора, или при 5000g в течение 30 минут в случае углового ротора. Осадок клеток суспендировали в 4 мл буфера TES (100 мМ Трис-HCl, рН 8.0; 0.5 М сахарозы; 0.5 мМ ЭДТА, 10 мМ имидазола, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF)), переносили в 15-мл пробирку и затем инкубировали 30-60 мин в ледяной бане. Делали осмотический шок, добавляя 6 мл TES/5 в каждую пробирку и быстро перемешивая переворачиванием. После инкубации в ледяной бане еще раз в течение 30-60 минут проводили центрифугирование при 4°С при 15000 g в течение 20 минут. Супернатант отбирали в свежую пробирку и добавляли к нему хлорид натрия до конечной концентрации 300 мМ. Из полученного периплазматического экстракта проводили очистку адаптированного мини-антитела с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе (согласно протоколу фирмы-производителя, Sigma-Aldrich). Полученные препараты мини-антител были диализованы против стандартного фосфатного буфера, содержащего 150 мМ хлорида натрия. Мини-антитела после диализа эффективно узнавали в ИФА рекомбинантный лактоферрин человека. Полученные мини-антитела, a-hLF-1 и а-hLF-4 подготовлены для связывания с материалом хроматографической колонки (BrCN-сефарозой). Аминокислотные последовательности мини-антител a-hLF-1 и a-hLF-4 представлены как SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, а нуклеотидные - как SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, соответственно (Фиг. 3).

Пример 2. Способ разделения целевого белка лактоферрина человека от лактоферрина козы.

Способ разделения лактоферринов человека и козы основывается на использовании иммуноаффинной хроматографической очистки препаратов с лактоферринами на колонке, состоящей из иммобилизованных на Sepharose 4В (GE Healthcare) специфических мини-антител a-hLF-1 и a-hLF-4, дифференциально связывающих только лактоферрин человека и не связывающих лактоферрин козы.

Два препарата сефарозы с пришитыми мини-антителами, узнающими лактоферрин человека (a-hLF-1, a-LF-4), были суспендированы в буфере PB S и перенесены в 1,5-мл пробирки. Над осевшим гелем оставляли примерно 200 мкл буфера, остальной объем буфера удаляли. В каждую из 2 пробирок с соответствующими иммобилизованными на сефарозе однодоменными антителами добавляли 500 мкл раствора (в PBS), содержащего смесь 200 мкг козьего и 200 мкг рекомбинантного человеческого лактоферринов. Суспензии инкубировали, перемешивая на ротомиксе, в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем суспензии переносили в 10-мл колонки (фирмы Bio-Rad), давали суспензии осесть (сформировать колонку), после чего пропускали через колонку раствор с несвязавшимися лактоферринами 3 раза. Дополнительно промывали колонку 300 мкл PBS. Проскоки (суммарный объем примерно 1 мл) собирали для последующего анализа. Колонки (объемом примерно 0,7 мл) со связавшимися лактоферринами тщательно промывали буфером PBS: 2 раза 5 мл и затем один раз 10 мл. Элюцию связавшихся белков проводили в свежеприготовленном 1,4% растворе триэтиламина в воде (рН~11), последовательно в три этапа пропуская через колонку по 0,7 мл элюирующего раствора. Элюаты сразу же нейтрализовали, добавляя 1М Трис-HCl, рН 7,0 (пол-объема на один объем элюата). Таким образом, полный объем нейтрализованного элюата составлял примерно 3,1 мл (примерно в 3 раза больше объема соответствующего проскока). После элюции колонки с мини-антителами сразу же регенерировали промыванием в PBS.

На Фиг. 2 продемонстрированы результаты разделения лактоферринов человека и козы с использованием мини-антител a-hLF-1 и a-hLF-4; приведены данные распределения hLF и gLF в исходной смеси, в элюатах и проскоках в случае двух параллельно проведенных фракционирований. На Фиг. 2А показаны результаты электрофоретического анализа (по Лэммли) разделения лактоферринов с использованием мини-антител a-hLF-1 и a-hLF-4. На электрофорезе рекомбинантный лактоферрин человека (rec-hLF, или hLF) и козий лактоферрин (gLF) движутся с детектируемой разницей в подвижности; gLF движется немного медленнее, чем hLF. Поэтому на электрофорограмме можно ясно видеть результат проведенного фракционирования лактоферринов: hLF количественно выявляется только в элюатах, a gLF - только в проскоках. На Фиг. 2Б показаны результаты иммуноферментного анализа разделения лактоферринов с помощью иммуноаффинной хроматографии на полученных колонках с иммобилизованными однодоменными антителами, - количественного метода оценки эффективности фракционирования этих типов лактоферринов.

На Фиг. 3 приведены последовательности однодоменных антител, a-hLF-1 и а-hLF-4, аминокислотные последовательности которых представлены как SEQ ID NO:1 (Фиг.3А) и SEQ ID NO:2 (Фиг. 3Б) (подчеркнуты гипервариабельные участки, - CDR1, CDR2 и CDR3), а нуклеотидные - как SEQ ID NO:3 (Фиг 3В) и SEQ ID NO:4 (Фиг. 3Г), соответственно.

Литертурные источники

- Actor JK, Hwang SA, Kruzel ML. Lactoferrin as a natural immune modulator. Curr Pharm Des. 2009; 15(17):1956-73.

- Amini AA, Nair LS. Lactoferrin: a biologically active molecule for bone regeneration. Curr Med Chem. 2011; 18(8):1220-9.

- Artym J. [Antitumor and chemopreventive activity of lactoferrin). Postepy Hig Med Dosw (Online). 2006;60:352-69.

- Ashby B, Garrett Q, Willcox M. Bovine lactoferrin structures promoting corneal epithelial wound healing in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Apr 25; 52(5):2719-26.

- Ghassabeh G.H., Muyldermans S., Saerens D. 2010. Nanobodies, single-domain antigen-binding fragments of camelid heavy-shain antibodies. In Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Eds. S.J. Shire et al. Springer New York., 29-48.

- Hamers-Casterman,C, Atarhouch,T., Muyldermans,S., Robinson, G., Hamers, C, Bajyana Songa, E., Bendahman, N., Hamers, R. 1993. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 446-448.

- Kruzel ML, Actor JK, Boldogh I, Zimecki M. Lactoferrin in health and disease. Postepy Hig Med Dosw (Online). 2007; 61:261-7.

- Lacasse Ρ, Lauzon К, Diarra MS, Petitclerc D. Utilization of lactoferrin to fight antibiotic-resistant mammary gland pathogens. J Anim Sci. 2008 Mar; 86(13 Suppl):66-71.

- Lacasse Ρ, Lauzon K, Diarra MS, Petitclerc D. Utilization of lactoferrin to fight antibiotic-resistant mammary gland pathogens. J Anim Sci. 2008 Mar; 86(13 Suppl):66-71.

- Wally J, Buchanan SK. A structural comparison of human serum transferrin and human lactoferrin. Biometals. 2007 Jun;20(3-4):249-62.

- Wally J, Buchanan SK. A structural comparison of human serum transferrin and human lactoferrin. Biometals. 2007 Jun; 20(3-4):249-62.

- Wang J, Li Q, Ou Y, Han Ζ, Li Κ, Wang Ρ, Zhou S. Inhibition of tumor growth by recombinant adenovirus containing human lactoferrin through inducing tumor cell apoptosis in mice bearing EMT6 breast cancer. Arch Pharm Res. 2011 Jun; 34(6):987-95.

- Xu XX, Jiang HR, Li HB, Zhang TN, Zhou Q, Liu N. Apoptosis of stomach cancer cell SGC-7901 and regulation of Akt signaling way induced by bovine lactoferrin. J Dairy Sci. 2010 Jun;93(6):2344-50.

- Zimecki M, Artym J, Chodaczek G, Kocieba M, Kuryszko J, Houszka M, Kruzel ML. Immunoregulatory function of lactoferrin in immunosuppressed and autoimmune animals. Postepy Hig Med Dosw (Online). 2007; 61:283-7.

- Zimecki M, Artym J, Chodaczek G, Kocieba M, Kuryszko J, Houszka M, Kruzel ML. Immunoregulatory function of lactoferrin in immunosuppressed and autoimmune animals. Postepy Hig Med Dosw (Online). 2007; 61:283-7.

- Тиллиб С.В. «Верблюжьи антитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45, №1, 77-85.

Способ разделения лактоферринов человека и козы, характеризующийся тем, что проводится с помощью иммуноафинной хроматографии, отличающийся тем, что для ее проведения используются однодоменные мини-антитела a-hLF-1 и a-hLF-4, аминокислотные последовательности которых представлены как SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, а нуклеотидные - как SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно.

www.findpatent.ru


Смотрите также