Метод флюоресцирующих антител. Метод флюоресцирующих антител


Реакции торможения гемагглютинации и гемадсорбции

Принцип методаприменим только в вирусологии и основан на предотвращении реакции адсорбции вирусов либо на свободных танизированных эритроцитов (РГА), либо в инфицированной ими культуре тканей (РГадс) с помощью предварительной обработки вируса или вируссодержащего материала специфической иммунной сывороткой. Последующий контакт таких нейтрализованных вирусов со свободной взвесью эритроцитов или культурой ткани обычным эффектом не сопровождается. Результаты становятся противоположными:

- Вирус не адсорбируется на эритроцитах и прямого их склеивания (РГА) за счёт разницы электрического потенциала не происходит, наблюдается его торможение — РТГА.

- Вирус не адсорбируется на клетках культуры ткани, не проникает в них, не репродуцируется, а сливается из пробирки (лунки) вместе с культуральной средой. Внесение взвеси эритроцитов в культуру так называемых «инфицированных» клеток не фиксируется вирусом (его там нет). Наблюдается отсутствие РГадс или, точнее, её торможение — РТГадс.

Приложение 9

Реакция иммобилизации трепонем (ри)

(извлечение из справочника М.О. Биргера. М., 1982. С. 505-506)

Реакция основана на наблюдениях Д.К. Заболотного (1907) и П.П. Маслаковца в отношении потери подвижности белой спирохеты при добавлении к её культуре сыворотки крови больных сифилисом.

Ингредиенты реакции:

1. Антиген — взвесь тканевых спирохет (получают из размельчённого яичка кролика, заражённого сифилисом).

2. Антитело — сыворотка обследуемого больного.

Реакцию выполняют в меланжерах. Основной опыт — соединение в смесителе сыворотки больного, взвеси тканевых спирохет и активного комплемента.

После 19-20 — часовой инкубации при + 35Сº на предметное стекло наносят каплю содержимого из меланжера, кладут на неё покровное стекло и в микроскопе с темнопольным конденсором определяют количество подвижных и неподвижных спирохет. Опыт составляют с контролями и по формуле вычисляют процент специфически иммобилизированных антителами спирохет.

Результаты реакции считают положительными, если процент иммобилизации спирохет выше 50 %, слабоположительными - от 31 % до 50 %, сомнительными - от 21 % до 30 %, отрицательными — ниже 20 %.

Приложение 10

Метод флюоресцирующих антител (риф)

Принцип метода: визуальный учёт специфического взаимодействия флюоресцирующих антител с гомологичным антигеном осуществляется в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа. МФА позволяет контролировать первую фазу серологических реакций.

Варианты риф

1. Прямой РИФ: препарат, приготовленный из инфицированного материала, фиксируют жидким фиксатором (в ацетоне), обрабатывают антителами, мечеными флюорохромом — изотиоционатом флюоресцеина (ФИТЦ), отмывают от избытка сыворотки и после высушивания рассматривают в люминесцентном микроскопе.

Достоинства метода: простота, специфичность.

Недостатки: необходим большой набор люминесцентных сывороток.

2. Непрямой РИФ (РНИФ):Используется для обнаружения антител.

Последовательность обработки препарата непрямого РИФ: препарат из инфицированного материала высушить, фиксировать химическим фиксатором, нанести испытуемую сыворотку и инкубировать во влажной камере при + 37Сº 30 минут. Тщательно промыть водой, высушить. Обработать препарат антиглобулиновой сывороткой (против глобулинов человека). Инкубировать при + 37Сº во влажной камере 15 минут. После этого промыть водой, высушить, микроскопировать в люминесцентном микроскопе.

Приложение 11

studfiles.net

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ — Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), или метод флуоресцирующих антител (МФА)

Приготовление люминесцирующих антител из иммунной сыворотки. Обнаружение антител к выделенным вирусам во второй сыворотке в титре в 4 и более раз больше, чем в первой, указывает на этиологическую связь вирусов с данным заболеванием. Для обнаружения вирусных антител в крови больных и для изучения антигенной структуры вирусов применяют различные серологические реакции. Реакция преципитации в агаре основана на образовании полосы преципитации на месте контакта антигена с антителами в слое агара между лунками, заполненными вирусным антигеном и иммунной сывороткой.

К недостаткам МФА следует отнести необходимость специального оборудования — люминесцентного микроскопа, который не всегда имеется в районных ветеринарных лабораториях. Чаще всего для метки антител используют флюоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ).

Вирусологические исследования

1.Выделение глобулиновой фракции из иммунной сыворотки. Осадок глобулинов, полученный после центрифугирования, либо растворяют и переосаждают вновь, либо промывают полунасыщенным раствором сульфата аммония при центрифугировании.

Поэтому при приготовлении препаратов для непрямого метода чаще всего используют сульфатно-риваноловый метод. При этом методе фракционирование белков проводят в две стадии. Для получения конъюгата с минимальным неспецифическим свечением белок метят флюорохромом в условиях, позволяющих получить белковые молекулы с оптимальным молярным отношением МФИТЦ: Мбелок.

Определяют красящий титр и рабочее разведение на той модели, на которой работает исследователь. Для определения концентрации белка и молярного отношения обычно используют спектрофотометрический метод. Полноту очистки конъюгата от несвязанного с белком флюорохрома можно определять методом восходящей хроматографии на бумаге.

Модификации МФА. МФА имеет два варианта: прямой и непрямой. Фиксированный мазок красят люминесцирующей иммунной сывороткой, содержащей антитела против искомого антигена. Недостаток — необходимость иметь в наличии сыворотки для каждого вида идентифицируемого микроорганизма.

Более универсальный, так как при помощи одной люминесцирующей антивидовой сыворотки можно выявлять различные виды микроорганизмов. На первом этапе фиксированный мазок обрабатывают немеченной к искомому возбудителю иммунной сывороткой.

В результате к образовавшемуся на первом этапе комплексу антиген — антитело присоединяются антитела второй ступени, образуется двойной комплекс, который можно обнаружить в люминесцентном микроскопе. Мазки подсушивают на воздухе, а затем погружают на 15 мин в фиксирующую жидкость (этанол, метанол, жидкость Никифорова).

То максимальное разведение, которое обеспечивает яркое (на ++++ и +++) иммунофлюоресцентное окрашивание микробных клеток, называют красящим титром. Окраску производят в течение времени, указанного на этикетке, при комнатной температуре.

Смесь этих сывороток готовят в удвоенном рабочем разведении. Микроорганизмы, окрашенные люминесцирующей сывороткой, меченной ФИТЦ, имеют ярко-зеленое свечение, локализующееся по периферии клетки с характерной для исследуемого вида морфологией. Такое свечение называется специфическим в отличие от неспецифического, при котором происходит равномерное свечение всего тела клетки. Следует иметь в виду, что в препаратах из органов животных и культуры тканей обычная морфология клеток может быть изменена.

В последние годы в МФА стали применять и моноклональные люминесцирующие антитела (МКА), которые имеют преимущества перед поликлональными по специфичности

Для контроля наряду с основными мазками обрабатывают люминесцирующими сыворотками мазки из гетерологичных видов микробов. Затем мазки 2 раза промывают 0,15 М раствором NaCl (pH 7,2…7,4) по 10 мин для удаления избытка иммунной сыворотки. Люминесцентный метод применяют для обнаружения возбудителя туберкулеза в исследуемом материале.

В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции — это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.

Количество красителя, которое следует взять в метку, зависит от его чистоты и титра сыворотки. Она основана на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать инфекционные свойства вирусов при введении смеси в организм восприимчивых животных или в культуру тканей.

lowekader.ru

Метод флуоресцирующих антител Вики

Иммунофлуоресцентный анализ (МФА — метод флуоресцирующих антител, иммунофлуоресценция) (англ. Immunofluorescence) — набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий (культур клеток, бактерий, микоплазм, риккетсий, вирусов), образцов крови, костного мозга, альвеолярных смывов, тонких тканевых срезов. Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных так и внутриклеточных белков и рецепторов. Исследование и оценка может выполняться вручную при помощи флюоресцентного микроскопа или автоматизировано с использованием проточного цитометра (flow cytometer) или микрочипового цитометра (сhip cytometer). Возможно применение конфокального микроскопа и роботизированного флюоресцентного микроскопа (в том числе совмещенных с проточным цитометром) в сочетании с программной системой обработки изображений. Имеющиеся в настоящее время автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце примерно 50 различных антигенов с использованием набора различных флюоресцентных маркеров в формате высокоинформативной микроскопии и цитометрии (методы носят названия high-content imaging, high-content cytometry, high-content screening) и примерно вдвое меньшем максимальным набором антигенов с использованием современной проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Основными практическими приложениями являются онкология, микробиология, клеточная биология, генетика, фармакология и др.

Сущность и классификация метода[ | код]

Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом (англ.)русск..[1] В настоящее время метод использует как антитела к различным антигенам, так и специфические красители к ДНК (к примеру DAPI), РНК (к примеру Sybr Green II), липидам и белкам.

В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом,[2] и непрямой, разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом.

При прямом методе (пМФА) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.

При непрямом методе (нМФА) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. «первые» антитела), а затем видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве «первых» антител используются мышиные антитела — mouse IgG, то в качестве «вторых» используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем. Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со «вторым» антителом.

Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, хотя в более ранних версиях метода требовалось множество моноспецифических сывороток. Долгое время недостатками прямых видов МФА являлись ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие иммуноглобулины к исследуемым антигенам. Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая степень очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода.

Поскольку прямой метод в настоящее время позволяет избежать неспецифических реакций, автоматизированные методики преимущественно используют прямой метод иммунофлуоресценции.

Результаты ручной микроскопической оценки описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырёх ++++) — субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя. В автоматизированных методах в качестве детектора используются фотоумножители или высокочувствительные флуоресцентные фотокамеры, что позволяет регистрировать сигнал с большой точностью и дает значение относительного уровня флюоресценции (relative fluorescence ratio) в широком диапазоне шкалы. Абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце. При использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных.

Значение и перспективы метода[ | код]

Метод имеет решающее значение в ранней диагностике и лечении онкологических заболеваний (иммуногистохимия, онкогематология), диагностике инфекционных заболеваний (например определение CD4+ клеток при ВИЧ) и наследственных синдромов. Интенсивно развиваются автоматизированные методы, среди которых направления высокоинформативной микроскопии (high content imaging) и высокоинформативной цитометрии(high content cytometry),параллельно развивающиеся с 90х годов комбинированные методики цитометрии-микроскопии (цитометр-микроскоп), а также методы микрочиповой цитометрии с плазмонной голографией [3] в которых отдельные антитела метятся наночастицами.

Примечания[ | код]

  1. ↑ A. H. Coons, H. J. Creech, R. N. Jones, E. Berliner (нем.)русск., The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody, J. Immunol. 45, 1942, pp. 159—170
  2. ↑ A. H. Coons, M. H. Kaplan, Localization of antigen in tissue cells. II. improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody, J. Exp. Med., 91(1), pp. 1-13
  3. ↑ On-Chip Cytometry using Plasmonic Nanoparticle Enhanced Lensfree Holography : Scientific Reports : Nature Publishing Group

ru.wikibedia.ru


Смотрите также