43) Сущность техники постановки, учет и контроли ра. Метод флюоресцирующих антител принцип метода


Тема 24. Методы люминесцентной микроскопии

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать общее представление о люминесцентной микроскопии. Ознакомиться с техникой обработки препаратов для микроскопии различными флюорохромами. Освоить методы и приемы проведения реакции иммунофлюоресценции с использованием меченых антител.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Предметные стекла, исследуемый материал (бактериальная культура, патологический материал), соответствующая флюоресцирующая сыворотка, физиологический раствор или фосфатный буфер с рН 7,2-7,4 для промывания мазков, влажная камера (чашки Петри с увлажненной ватой), фильтровальная бумага, нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат, люминесцентный микроскоп или люминесцентный осветитель (любой марки), размещенные в затемненной комнате с активной вентиляцией.

Среди методов диагностики бактериальных и вирусных инфекций особое место занимает люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. Повышенная чувствительность, цветное изображение на темном нефлюоресцирующем фоне, возможность обнаружения микроорганизмов, простота и надежность флюорохромирования – ценные качества этого вида микроскопии.

Особое значение люминесцентная микроскопия имеет при экспресс-диагностике инфекционных болезней, при экспресс-индикации возбудителя во внешней среде. Результаты люминесцентной микроскопии являются довольно специфичными и высоко точными. По данным ряда авторов, этот метод не уступает по показателям данным биопробы и другим методам, однако для люминесцентной микроскопии нужно иметь высококачественные специфические флюоресцирующие сыворотки и специальные краски – флюорохромы. Люминесцентная микроскопия в последние годы находит все большее применение. Так, диагностика инфекционных болезней классическим методом биопробы осуществляется в пределах от 5-9 до 30 суток, а люминесцентным методом достигается в точение 30 минут до 5-6 часов, т.е. во много раз быстрее, чем классическим методом биопробы.

Первый люминесцентный микроскоп был предложен австрийскими учеными Келером и Зидентонфом в 1908 г. Большой вклад в дело создания люминесцентных микроскопов внес академик С.И. Вавилов и его школа.

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего на них света и переходят в возбужденное состояние, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются к исходному энергетическому уровню. Этот период сопровождается отдачей избытка энергии в виде света – люминесценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают ультрафиолетовыми лучами длиной волны 300-400 нм или сине-фиолетовыми лучами длиной волны 400-460 нм.

Ряд веществ биологического происхождения — хлорофилл, витамин В2, алкалоиды, некоторые антибиотики и другие соединения обладают собственной (первичной) люминесценцией. В зависимости от содержания таких веществ в клетке некоторым дрожжам и бактериям также свойственна первичная люминесценция. Однако клетки большинства микроорганизмов люминесцируют очень слабо, поэтому их обрабатывают специальными красителями - флюорохромами. Такая наведенная люминесценция называется вторичной.

Люминесцентные микроскопы и люминесцентные устройства, как правило, состоят из трех основных частей: 1) мощный источник света; 2) осветительное устройство и 3) микроскоп. Источником света служат ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления. Главной составной частью осветительного устройства является система светофильтров, позволяющая выделить из источника света нужные части спектра для возбуждения люминесценции (ультрафиолетовые, синие, фиолетовые лучи). Микроскоп состоит из тех же составных частей, что и обычный биологический микроскоп.

При люминесцентной микроскопии исследуемые объекты (микроорганизмы) видны потому, что они становятся светящимися, а при световой микроскопии мы видим объекты в результате отражения, преломления света.

В настоящее время выпускаются различные люминесцентные микроскопы – МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3, МЛ-4, ЛюМАМ, а также люминесцентные устройства, которые монтируются на обычный световой микроскоп, такие, как ОИ-17, ОИ-28 и др. Для иммерсионной микроскопии при люминесцентном исследовании используют специальное нефлюоресцирующее масло, заменяют его диметиловым эфиром фталиевой кислоты или дистиллированную воду.

Для получения эффекта вторичной люминесценции используют: 1) метод простого флюорохромирования (МФ) и 2) методы флюоресцирующих антител (МФА, иммунофлюоресценция).

Метод флюорохромирования. По технике выполнения этот метод не отличается от методов обычной окраски мазков, применяемых при световой бактериоскопии. Для этих целей используют краски, которые светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски называются флюорохромами, а окраска ими – метод флюорохромирования. К флюорохромам относятся такие красители, как акридин оранжевый, акридин желтый, аурамин, флюоресцеин, нейтральный красный, риванол и др. Продается специальный «Набор красителей для флюоресцентной микроскопии», содержащий 20 красителей. Флюорохромы растворяют в дистиллированной воде (1:500-1:100000). Такие растворы малотоксичны, что дает возможность изучать живую клетку (микроорганизмы).

Препарат для метода простого флюорохромирования можно готовить двумя способами:

а) на свежий мазок-отпечаток (из органов, соскобов со слизистых оболочек) или суспензии инфицированных клеток наносят 1-2 капли рабочего раствора (1:10000) акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом. Приготовленный таким образом свежий (в течение 10-20 мин после его приготовления) препарат рассматривают в люминесцентном микроскопе;

б) мазки-отпечатки, полученные из патологического материала, или инфицированные культуры клеток (на предметных стеклах), фиксируют 96°-ным этиловым спиртом в течение 15-30 мин, промывают дистиллированной водой, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридинового оранжевого (1:10000), через 5-10 мин покрывают покровным стеклом и исследуют.

В препаратах ДНК-содержащих вирусов, например аденовируса, вирусный материал светится зеленоватым цветом в ядре в виде гранул различной величины. При наличии в препарате РНК-содержащего вируса, например вируса гриппа, вирусный материал обнаруживается в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.

Методы флюоресцирующих антител (МФА). Эти методы основаны на принципе специфического взаимодействия антигена со специфическими антителами, но антитела здесь применяются меченые, т.е. предварительно окрашенные флюорохромом. Эти методы являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставятся они на предметном стекле (в мазке).

В настоящее время налажено производство флюоресцирующих сывороток и гаммаглобулинов централизованным путем. Выпускаются они в сухом виде в ампулах с приложением на каждую упаковку инструкции по применению и с указанием титра сывороток.

МФА можно разделить на две разновидности: 1) прямой метод; 2) непрямые методы - а) с использованием антивидовой флюоресцирующей сыворотки и б) с использованием антикомплементарной флюоресцирующей сыворотки.

Прямой метод флюоресцирующих антител. Этот метод технически наиболее прост и более специфичен по результативности. Сущность метода заключается в том, что на предметное стекло фиксированным физическим или химическим способом на нем мазком, содержащим антиген, наносят небольшое количество (2-3 капли) меченой сыворотки или глобулинов в рабочем титре и выдерживают во влажной камере в термостате 30-40 мин, а затем мазок промывают каким-либо буферным раствором и дистиллированной водой (можно только дистиллированной водой). Высушивают мазки на воздухе или в термостате и просматривают под иммерсионной системой (рис. 69). Если антиген и антитела специфичны, то на темном фоне будет отчетливо видно салатово-зеленое свечение антител, адсорбировавшихся на антигенах. Если же антитела были неспецифичны антигену (или антигена в мазке не было), то свечение отсутствует, так как антитела удаляются с препарата при промывании водой. К недостаткам прямого метода следует отнести то, что при этом в лаборатории нужно иметь на каждый возбудитель специфическую флюоресцирующую сыворотку (или глобулин), а они сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.

Рис. 69. Схема прямого и непрямого методов флюоресцирующих антител (реакция иммунофлюоресценции)

А. Прямой метод

1. Исследуемый антиген (мазок)

2. Меченые специфическая сыворотка или -глобулин

Б. Непрямые методы

1. Исследуемый антиген (мазок)

2. Немеченые специфическая сыворотка или -глобулин

3. Меченая антивидовая сыворотка.

1. Исследуемый антиген (мазок)

2. Немеченые специфическая сыворотка или -глобулин

3. Комплемент

4. Меченая антикомплементарная сыворотка

Непрямые методы флюоресцирующих антител. Называются они так потому, что флюоресцирующая сыворотка (антитело) при этих методах адсорбируется не на антигене, а на посредника (на специфическое неокрашенное антитело или на комплемент, которые являются для флюоресцирующих антител антигеном).

Непрямой метод с использованием антивидовой флюоресцирующей сыворотки. Сущность и техника этого метода заключается в том, что на фиксированный мазок сначала наносят специфическую для предполагаемого в мазке антигена не меченую иммунную сыворотку или глобулин и выдерживают во влажной камере при 37°С 30-40 мин. Затем мазок осторожно промывают фосфатным буфером или просто дистиллированной водой. Если в мазке имеется антиген, то образуется комплекс «антиген-антитело», который при промывании мазка не смывается. Однако полученный комплекс невидим, чтобы его обнаружить в люминесцентном микроскопе, мазок дополнительно обрабатывают флюоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулинами. Антивидовые сыворотки или глобулины получают путем гипериммунизации кролика (или другие виды животных) сывороткой или глобулинами того вида животных, от которых получают специфическую вирусному антигену гипериммунную неспецифическую сыворотку. Для этого на мазок наносят антивидовую флюоресцирующую сыворотку и снова контактируют во влажной камере при 36-37°С 30-40 мин. Затем мазок промывают и высушивают на воздухе. В результате антивидовая сыворотка адсорбируется на комплекс «антиген+антитело» и, поскольку антивидовая сыворотка или глобулины меченые, образовавшийся комплекс «антиген+антитело+антивидовое антитело» светится салатово-зеленоватым цветом.

Если же в первой стадии компоненты были неспецифичны или в мазке было мало антигена, комплекс «антиген+антитело» не образуется, и антивидовые антитела не свяжутся, при промывании мазка смоются с него и поэтому свечения не будет.

Непрямой метод с использованием антикомплементарной флюоресцирующей сыворотки по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставится на предметном стекле, и роль гемолитической системы выполняет флюоресцирующая антикомплементарная сыворотка.

Для подтверждения специфичности результатов РИФ необходимы следующие контроли. Для прямого варианта проводят окраску гомогенных и гетерогенных в антигенном отношении микроорганизмов люминесцирующей сывороткой. Свечение бактерий должно быть в первом случае и отсутствовать во втором.

Для непрямого метода мазки, содержащие гомологичные и гете-рологичные в антигенном отношении микроорганизмы, обрабатывают люминесцирующей сывороткой. Бактериальные клетки не должны светиться. Мазки с гомологичными и гетерологичными бактериями обрабатывают иммунной (антимикробной) сывороткой (1-й этап) с последующим нанесением флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки (2-й этап). Специфическое свечение бактерий должно быть в первом случае и отсутствовать во втором».

Интенсивность свечения оценивается по четырехбальной системе: ++++ - очень яркая флюоресценция по периферии микробной клетки; +++ - яркая флюоресценция периферии клетки; ++ - слабое свечение периферии клетки; + - нет контрастного свечения периферии и тела микробной клетки. Реакцию иммунофлюоресценции засчитывают, если специфическое свечение микробных клеток на четыре или на три плюса.

Задания для самостоятельной работы

1. Готовые и фиксированные мазки, приготовленные из бактериальной культуры или патологического материала, обработать ее специфической меченой сывороткой, согласно методическим указаниям.

2. Провести микроскопию препаратов под иммерсионной системой люминесцентного микроскопа или осветителя. Микрокартину зарисовать.

Вопросы для самоподготовки знаний

1. В чем заключается сущность люминесценции и принцип люминесцентной микроскопии?

2. Дать понятие методу флюорохромирования и его использование при диагностике инфекционных болезней.

3. Сущность метода флюоресцирующих антител и его вариантов.

4. Значение реакции иммунофлюоресценции (РИФ) при диагностике инфекционных болезней.

Таблица 18

Схема обработки мазка флюоресцирующими сыворотками

Прямой метод

1

2

3

Изготовление,

сушка,

фиксация

Нанесение флюоресцирующей сыворотки

на мазок (3-15 мин во влажной камере

при 37°С)

Отмывка сыворотки физ. раствором

(5-10 мин)

Таблица 19

Непрямой метод

1

2

3

4

5

Изготовление, сушка, фиксация

Нанесение специфической сыворотки на мазок (3-15 мин)

Отмывка сыворотки физ. раствором (5-10 мин)

Нанесение специфической меченой сыворотки на мазок (3-15 мин) во влажной камере

Отмывка сыворотки физ. раствором

studfiles.net

43) Сущность техники постановки, учет и контроли ра.

Агглютинация – склеивание микробных тел в результате специфического взаимодействия АГ и АТ, которые оседают на дно пробирки, обр. осадок «зонтика».Для диагностики бруцеллеза, сальмонеллеза, лептоспироза, листериоза, колибактериоза.

2 компонента: агглютиноген и агглютинин = осадок агглютинат

РА на стекле а) на обезжир. стекло +исслед-ую сыворотку и смеш. с каплей АГ б) на обезж. пред. стекло + каплю физ. р-ра, туда бак. петлей +культуру с плотной пит.среды + капля полож-ой сыв-ки. Положит: когда когда АГ исслед. культ. спец-ны АТ имм-х сыв-к – появл-ся хлопья агглютината Отриц-я: при несоотв-вии равном-ое помутнение взвеси. Контроли:1) физ. р-р +полож. сывор-ка 2)физ. р-р+АГ-диагн-ум 3) АГ-диаг +полож. сывор-ка.

Кольцевая с молоком: на благоп. стад по бруцеллезу, оценка молока. Цветной бруц-ый АГ, молоко, полож-ая бруцел-я сыворотка. В пробирки с молоком 2 см2, вносят АГ 0,1см2, перемешивают, в термостат 37-38С на 1 час. Контроли: 1)молоко здоровой коровы+цветной бруц. АГ 2) молоко здоровой коровы в смеси с полож. сыв-кой +цвет. бруц. АГ.

Учет: +++синее кольцо, остальное белое; ++достат. выраж. синее кольцо; +синее кольцо слабо, столбик синий; -весь столбик раномерно синий, сливки белые

44) Сущность техники постановки, учет и контроли рп.

Осадочная р-я. Участвуют преципитиноген и преципитин = осадок преципитат.

Кольцепреципитация для диагности сиб. язвы. АГ от павших жив, биофабричный АГ, станд сибиреязвенная сыв-ка. Метод наслаивания-в проб. добавляют сибиреязв. сыв-ку и осторож. наслаив-т исслед. АГ (или метод подслаивания)

Контроли: 1)с полож. сыв+станд. АГ 2) с полож. сыв+физ.р-р 3) с полож. сыв+экстракт тканей здоров. жив.

Полож: серо-белый диск на границе. Отриц: прозрачная граница.

45)Метод флуорохромирования и метод флуоресцирующих антител (мфа) при диагностике бактериальных инфекционных болезней. Сущность и техника.

Основан на способности объекта светиться при пропускании через него пучка УФЛ. Для окрашивания используют флюорохромные красители (ауромин, родамин G, ФИТЦ). Повышается контрастность и облегчаетя обнаружение возбудителей. Метод окраски по Бойю для обнар. туберк. палочки. Добавляют смесь аурамина с родамином, нагрев 3-4 мин, слив, обесцвеч. 10-15 мин 3% р-ом хлористоводородного спирта, промыв, КMnO4 20-30сек, слив, докраш. 1% р-ом метилен. синего, промыв, суш. На темном фоне оранж. свеч. туберк.

МФА– микроскопическое исследование иммун. комплекса, с использ-ем АТ к которому присоединяют флюорохром = светятся в УФЛ. Микробный АГ фиксир. на пред. стекле, обрабатывают люминисцентными АТ, промывают, микроскопируют в люмин. микроскоп. Если АТ соответствуют, то прочно прикрепляется к АГ.

46) Роль возбудителей, макроорганизма и условий внешней среды в возникновении и развитии болезни.

Возникновение и развитие болезни зависит от:

*возбудителя (вирулентности возбудителя, дозы микроба-возубудителя

*макроорганизма (реактивности макроорганизма (способности проявлять защитно-приспособительные функции), конституции и кондиции макроорганизма, состояния ЦНС макроорганизма, возраст и порода животного (телята до 3-месячного возраста почти никогда не болеют бруцеллезом, поросята до 2-3 месяцев реже болеют рожей свиней, колибактериозом заболевает только молодняк, ЭМКАР поражает телят от 3 месяцев до 4 лет.

*условий внешней среды

Вызванное любой причиной ослабление организма способствует развитию инфекции.

Голодание– недостаток того или иного питательного вещества: витаминов, фосфора, кальция.

Водный режим– снижается сопротивляемость к инфекциям.

Температура– при переохлаждении простудные и диарейные заболевания, у вакцинированных с температурой снижается напряженность иммунитета.

Утомление– обостряются заболевания, такие как сап, инфекционная анемия, пастереллез.

Нарушение санитарно-зоогигиенических норм содержанияживотных – повышенная влажность, отсутствие вентиляции, недостаточная освещенность помещений и другие ведут к снижению общей сопротивляемости организма.

studfiles.net

Реакции торможения гемагглютинации и гемадсорбции

Принцип метода применим только в вирусологии и основан на предотвращении реакции адсорбции вирусов либо на свободных танизированных эритроцитов (РГА), либо в инфицированной ими культуре тканей (РГадс) с помощью предварительной обработки вируса или вируссодержащего материала специфической иммунной сывороткой. Последующий контакт таких нейтрализованных вирусов со свободной взвесью эритроцитов или культурой ткани обычным эффектом не сопровождается. Результаты становятся противоположными:

- Вирус не адсорбируется на эритроцитах и прямого их склеивания (РГА) за счёт разницы электрического потенциала не происходит, наблюдается его торможение — РТГА.

- Вирус не адсорбируется на клетках культуры ткани, не проникает в них, не репродуцируется, а сливается из пробирки (лунки) вместе с культуральной средой. Внесение взвеси эритроцитов в культуру так называемых «инфицированных» клеток не фиксируется вирусом (его там нет). Наблюдается отсутствие РГадс или, точнее, её торможение — РТГадс.

Приложение 9

Реакция иммобилизации трепонем (рит)

(извлечение из справочника М.О. Биргера. М., 1982. С. 505-506)

Реакция основана на наблюдениях Д.К. Заболотного (1907) и П.П. Маслаковца в отношении потери подвижности белой спирохеты при добавлении к её культуре сыворотки крови больных сифилисом.

Ингредиенты реакции:

1. Антиген — взвесь тканевых спирохет (получают из размельчённого яичка кролика, заражённого сифилисом).

2. Антитело — сыворотка обследуемого больного.

Реакцию выполняют в меланжерах. Основной опыт — соединение в смесителе сыворотки больного, взвеси тканевых спирохет и активного комплемента.

После 19-20 — часовой инкубации при + 35Сº на предметное стекло наносят каплю содержимого из меланжера, кладут на неё покровное стекло и в микроскопе с темнопольным конденсором определяют количество подвижных и неподвижных спирохет. Опыт составляют с контролями и по формуле вычисляют процент специфически иммобилизированных антителами спирохет.

Результаты реакции считают положительными, если процент иммобилизации спирохет выше 50 %, слабоположительными - от 31 % до 50 %, сомнительными - от 21 % до 30 %, отрицательными — ниже 20 %.

Приложение 10

Метод флюоресцирующих антител (риф)

Принцип метода: визуальный учёт специфического взаимодействия флюоресцирующих антител с гомологичным антигеном осуществляется в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа. МФА позволяет контролировать первую фазу серологических реакций.

Варианты риф

1. Прямой РИФ: препарат, приготовленный из инфицированного материала, фиксируют жидким фиксатором (в ацетоне), обрабатывают антителами, мечеными флюорохромом — изотиоционатом флюоресцеина (ФИТЦ), отмывают от избытка сыворотки и после высушивания рассматривают в люминесцентном микроскопе.

Достоинства метода: простота, специфичность.

Недостатки: необходим большой набор люминесцентных сывороток.

2. Непрямой РИФ (РНИФ): Используется для обнаружения антител.

Последовательность обработки препарата непрямого РИФ: препарат из инфицированного материала высушить, фиксировать химическим фиксатором, нанести испытуемую сыворотку и инкубировать во влажной камере при + 37Сº 30 минут. Тщательно промыть водой, высушить. Обработать препарат антиглобулиновой сывороткой (против глобулинов человека). Инкубировать при + 37Сº во влажной камере 15 минут. После этого промыть водой, высушить, микроскопировать в люминесцентном микроскопе.

Приложение 11

studfiles.net


Смотрите также