Иммунофлуоресцентный анализ. Метод флуоресцирующих антител


МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ

Метод флуоресценции (ИФ) или флуоресцирующих (люминесцирующих) антител имеет значительное развитие и применяется для ускоренного выявления, реже идентификации, чистых культур возбудителей многих инфекционных заболеваний. Однако следует подчеркнуть, что метод ИФ оказывается во много раз надежнее при выявлении бактерий с большей антигенной обособленностью.

Сущность метода заключается в том, что но известному антителу, меченному флуорохромом (изоцианат флуоресцеина, радомин и др.), определяют неизвестный антиген. В этом случае реакция антиген — антитело ограничена первой фазой (специфической), без второй — коагуляции комплексов, что имеет известные преимущества перед другими серореакциями.

Одним из условий успешного применения метода иммунофлуоресценции является получение антител высокой специфичности (аффинности). Этому могут способствовать различные способы обработки иммунных сывороток до их метки флуорохромом. Широко используют специфическую микробную адсорбцию, аффинную хроматографию. Значительной специфичности сывороток достигают их фракционированием химическими веществами: сульфатом аммония, солями легких металлов; в последние годы риванолем. Однако более эффективным методом фракционирования признана ионообменная хроматография с использованием ДЭАЭ-целлюлоз, ионообменных сефадексов и ионообменников на основе отечественных гелей ЭД [Аксенова М. П., 1975; Голшмид В. К., 1975; Cherry W., 1974]. Возможны успешные сочетания методов, например микробной адсорбции с ионообменной хроматографией [Голдшмид В. К., Ландсман Н. М., 1979].

Серологическая специфичность сыворотки в основном связана с фракцией IgG. Дальнейшая обработка этой фракции протеолитическими ферментами дает возможность получать еще более высоко специфические фракции, такие, как Fab-фрагмен-ы. Меченные флуорохромом Fab-фрагменты иммуноглобулина не вызывают, кроме того, неспецифической флуоресценции гетероструктурных биологических объектов. Это свойство имеет практическое значение, делая излишним применение контрастирования [Барбан П. С., 1980; Барбан П. С., Пантюхина А. Н., 1984; Storch W., 1979]. Предложен и иной подход к получению антител высокой специфичности, а именно: иммунизация животных синтезированными антигенами. Последние представляют собой антигенные детерминанты S-специфических цепей липо-полисахарида О-антигенов, связываемых далее с бычьим альбумином. Такие сыворотки были приготовлены для идентификации сальмонелл серогрупп В и D. При использовании этих сывороток специфичность их была подтверждена в 99% случаев [Strange R., 1977].

Методом иммунофлуоресценции можно обнаружить энтеробактерии в крови, фекалиях, рвотных массах и другом материале от больных или из объектов окружающей среды. Преимуще­ствами метода являются относительная быстрота выполнения, высокая чувствительность и достаточная специфичность. ИФ позволяет выявлять бактерии возбудителя в материалах, содержащих любое число сопутствующих микробов, если они не имеют выраженного антигенного родства с искомым этиологическим агентом.

Препараты для исследования готовят либо прямым нанесением материала на предметное стекло (если предполагается массивное обсеменение), либо с его предварительным подращиванием на соответствующих питательных средах (в жидких средах накопления или на плотных селективно-дифференциальных). При прямом исследовании делают тонкий мазок из жидкого материала или из осадка суспензии, сделанной из более плотных образцов (оформленного стула, пищевых продуктов и др.). При подращивании посевы в жидких средах выдерживают при 37 °С в течение 16—18 ч, а на плотных—4 ч. После .этого готовят мазки и отпечатки. Лучшие результаты получают при сочетании исследования прямых мазков и препаратов после подращивания.

Для просмотра мазков используют люминесцентные микроскопы, в том числе МЛД-1, предназначенный для работы в полевых условиях. Для создания флуоресценции применяют специальные осветители и светофильтры.

Существуют прямой и непрямой методы иммунофлуоресценции. При прямом методе происходит непосредственная реакция антигена с соответствующими флуоресцирующими антителами, результаты которой учитывают с помощью люминесцентной микроскопии. Для этого метода мазки исследуемого материала подсушивают на воздухе, а затем фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки или 96° спиртом, можно смесью Никифорова. Фиксированные препараты помешают во влажную камеру (чашки Петри, кюветы, эксикаторы с увлажненной ватой или фильтровальной бумагой), наносят на них по капле люминесцирующей сыворотки (в рабочем разведении), через. 15-20 мин промывают и просушивают на воздухе. При работе с малоизученным оборудованием может понадобиться уточнение рабочего разведения. Для этой цели окрашивают заведомо известный штамм люминесцентной сывороткой, взятой в нескольких разведениях. То максимальное разведение, которое обеспечивает яркое специфическое свечение бактерий, является красящим титром. В качестве рабочего разведения принимают удвоенный красящий титр. Мазки исследуют в темной комнате, применяя нефлуоресцирующее иммерсионное масло или химически чистый диметилфталат. Результаты считают достоверными после просмотра 25—30 полей зрения. Свечение окрашенных люминесцирующей сывороткой бактерий считают специфическим при наличии яркого свечения только периферии клетки (тело клетки не светится). Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестную систему.

Сущность непрямого метода заключается в том, что реакция проходит в два этапа: соединение антигена с соответствующей немеченной диагностической сывороткой и затем присоединение к этой смеси видоспецифического флуоресцирующего глобулина. Непрямой метод чаще применяют для определения неизвестных антигенов, имея возможность использовать более широкий набор диагностических препаратов, обычных немеченых агглютинирующих моноспецифических сывороток, соответ­ствующих видовой специфичности меченого глобулина.

Для непрямого метода на препараты, содержащие антиген, наносят каплю диагностической немеченой сыворотки и оставляют при комнатной температуре, во влажной камере на 20 мин, затем тщательно промывают 0,15 М раствором натрия хлорида (рН 7,2—7,4) для удаления несвязавшихся антител и подсушивают на воздухе. После этого на 10—20 мин каплями наносят на мазки люминесцирующую антивидовую сыворотку против глобулинов того вида животного, от которого была получена примененная агглютинирующая сыворотка (например, кролика). Мазки затем промывают, подсушивают и просматривают, как уже было указано. Для непрямого метода, помимо обычных контролей, обязателен контроль изучаемого антигена, обработанного антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой.

При ИФ прямая микроскопия мазка из нативного материа­ла от больных при высокой концентрации возбудителя (500 000 — 1 000 000 клеток в 1 г) позволяет дать положительный или ориентировочный ответ через 45—60 мин. При незначительной концентрации возбудителя (тысячи — десятки тысяч клеток) для получения должного эффекта необходимо применить метод накопления. Соответственно результаты могут быть получены через 5 и 20 ч.

На основе иммунофлуоресцентного метода В. М. Никитиным и Г. П. Постолаки (1976) предложен новый метод — реакция целлюлозофлуоресцирующих антитет (РЦФА). Меченные флуоpoxpoмом антитела насаждают на нитроцеллюлозу, окрашенную бриллиантовым зеленым. Полученные комплексы смешивают на стекло с испытуемым материалом. Результаты учитывают визуально через 2—3 мин или, при отрицательной реакции, через 20—30 мин, иногда больше после выдерживания в термостате (во влажной камере). При положительной реакции на фоне тусклой оранжево-кирпичной флуоресценции частиц целлюлозы наблюдают очень ярко светящиеся края микробных клеток (специфическая реакция + + + +). При этом методе наблюдается феномен гашения фоновой неспецифической флуоресценции. Метод РЦФА испытан с положительными результа­тами на материале, содержащем шигеллы, эшерихии и сальмонеллы.

В нашей стране выпускают коммерческие сухие люминесцирующие сыворотки к антигенам некоторых шигелл, сальмонелл и эшерихии для прямого метода ИФ, а также сухие люминесцирующие антивидовые сыворотки против иммуноглобулинов ряда животных. Подробные указания для их использования имеются в наставлениях по применению.

Иммунофлуоресцентный метод, как и другие ускоренные методы выявления и идентификации возбудителей из числа энтеробактерий, может в основном рассматриваться, как ориентировочный метод, особенно при исследовании фекалий, где безусловно могут присутствовать антигенно-родственные бактерии.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА)

Одним из современных методов серологической идентификации и выявления микроорганизмов и их антигенов может служить реакция коагглютинации [Kronvall G. ct. al., 1970; Kronvall G., 1973]. В эту реакцию, помимо обычных агглютинирующих реагентов (антитела и антигены), введен еще один — белок A. Staphylococcus aureus (штамм Cowan I). Этот белок расположен на поверхности клеточной стенки и обладает спо­собностью выборочно реагировать с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека, кролика и ряда других млекопитающих. Связывая лишь Fc-фрагмент, протеин А оставляет свободными Fab-фрагменты антител IgG, которые могут реагировать с гомогенными антигенами. Кроме того, одновременно с Fc-фрагмен­том из сыворотки удаляются и IgM-антитела, обычно реагирующие с гетерологичными антигенами и обусловливающие перекрестные реакции.

Таким образом, диагностическая сыворотка, обработанная •специально подготовленной взвесью S. aureus штамма Cowan I, становится высокоспецифичной и в ряде случаев не нуждается во фракционировании или микробной адсорбции [Хазен-сон С. Л., 1983].

КОА была предложена для серологического типирования пневмококков. В дальнейшем установлено, что с ее помощью могут быть обнаружены различные вирусы, растворимые антигены, токсины. В этих случаях специфический иммуноглобулин, посаженный на стафилококковые клетки, следует рассматривать как антительный диагностикум высокой специфичности.

Е. Edwards и R. Hilderbrand (1976) показали возможность выявления шигелл и сальмонелл ускоренным методом, непосредственно коагглютинируя материал колоний в чашках со средой Мак Конки.

В нашей стране испытание КОА для серологической идентификации и обнаружения шигелл, а также разработка соответствующих препаратов были предприняты в Ленинградском НИИЭ им. Пастера. К настоящему времени разработан и выпускается производством лиофилизированный стафилококковый реагент, содержащий белок А. Помимо этого, разработана тех­нология получения коагглютинирующих реагентов к S. dysenteriae, S. boydii и S. sonnei (без предварительной адсорбции) и к S. flexneri, где предварительная адсорбция сывороток все же необходима [Хазексон С. Л. и др., 1982; Хазенсон С. Л., 1983].

С целью серологической идентификации шигелл коагглютинация ставится как обычная реакция агглютинации на стекле. При этом реакция наступает значительно быстрее вследствие более высокого содержания антител в реагенте по сравнению с обычной адсорбированной сывороткой и большей его авидностью, зависящей от благоприятной для соединения антиген — антитело ориентации Fab-фрагментов иммуноглобулина на стафилококковой клетке [Хазенсон С. Л. и др., 1982, 1983].

Показана и принципиальная возможность обнаружения растворимых антигенов шигелл с помощью КОА. Приготовлены в лиофилизированном виде КОА-реагенты и разработана рапид-система для обнаружения антигенов некоторых шигелл и сальмонелл в материале от больных [Белая Ю. А., Белая О. Ф., 1982].

В связи с достаточной специфичностью и несомненной рентабельностью производства реагентов для реакции коагглютинации можно считать этот новый способ перспективным как для серологической идентификации шигелл, так и для выявления их растворимых антигенов.

В дальнейшем не исключено привлечение метода КОА и для работы с другими энтеробактсриями.

Приведенными выше методами не исчерпываются возможности ускорения идентификация выделенных культур или выявления антигенов искомых бактерий в исследуемых материалах.

Так, известны, рекомендации по выявлению антигенов энтеробактерий в испражнениях людей и объектах окружающей среды с применением реакции нейтрализации антител (РНАт). Успехи в развитии различных иммунологических методов в перспективе позволят использовать в лабораториях иммуноферментный, радиоиммунологический методы, иммуноэлектрофорез и другие новейшие методики.

 

Глава 5



infopedia.su

Иммунофлуоресцентный анализ — WiKi

Иммунофлуоресцентный анализ (МФА — метод флуоресцирующих антител, иммунофлуоресценция) (англ. Immunofluorescence) — набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий (культур клеток, бактерий, микоплазм, риккетсий, вирусов), образцов крови, костного мозга, альвеолярных смывов, тонких тканевых срезов. Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных так и внутриклеточных белков и рецепторов. Исследование и оценка может выполняться вручную при помощи флюоресцентного микроскопа или автоматизировано с использованием проточного цитометра (flow cytometer) или микрочипового цитометра (сhip cytometer). Возможно применение конфокального микроскопа и роботизированного флюоресцентного микроскопа (в том числе совмещенных с проточным цитометром) в сочетании с программной системой обработки изображений. Имеющиеся в настоящее время автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце примерно 50 различных антигенов с использованием набора различных флюоресцентных маркеров в формате высокоинформативной микроскопии и цитометрии (методы носят названия high-content imaging, high-content cytometry, high-content screening) и примерно вдвое меньшем максимальным набором антигенов с использованием современной проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Основными практическими приложениями являются онкология, микробиология, клеточная биология, генетика, фармакология и др.

Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом (англ.)русск..[1] В настоящее время метод использует как антитела к различным антигенам, так и специфические красители к ДНК (к примеру DAPI), РНК (к примеру Sybr Green II), липидам и белкам.

В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом,[2] и непрямой, разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом.

При прямом методе (пМФА) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.

При непрямом методе (нМФА) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. «первые» антитела), а затем видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве «первых» антител используются мышиные антитела — mouse IgG, то в качестве «вторых» используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем. Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со «вторым» антителом.

Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, хотя в более ранних версиях метода требовалось множество моноспецифических сывороток. Долгое время недостатками прямых видов МФА являлись ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие иммуноглобулины к исследуемым антигенам. Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая степень очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода.

Поскольку прямой метод в настоящее время позволяет избежать неспецифических реакций, автоматизированные методики преимущественно используют прямой метод иммунофлуоресценции.

Результаты ручной микроскопической оценки описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырёх ++++) — субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя. В автоматизированных методах в качестве детектора используются фотоумножители или высокочувствительные флуоресцентные фотокамеры, что позволяет регистрировать сигнал с большой точностью и дает значение относительного уровня флюоресценции (relative fluorescence ratio) в широком диапазоне шкалы. Абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце. При использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных.

Метод имеет решающее значение в ранней диагностике и лечении онкологических заболеваний (иммуногистохимия, онкогематология), диагностике инфекционных заболеваний (например определение CD4+ клеток при ВИЧ) и наследственных синдромов. Интенсивно развиваются автоматизированные методы, среди которых направления высокоинформативной микроскопии (high content imaging) и высокоинформативной цитометрии(high content cytometry),параллельно развивающиеся с 90х годов комбинированные методики цитометрии-микроскопии (цитометр-микроскоп), а также методы микрочиповой цитометрии с плазмонной голографией [3] в которых отдельные антитела метятся наночастицами.

ru-wiki.org

Реакция иммунофлюоресценции

Иммунофлюоресценция — это метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции и чувствительности флюоресцентной микроскопии. В отличие от других методов маркировки постановка пробы и точная локализация иммунной реакции на поверхности клетки или ткани происходят довольно быстро. Один из компонентов иммунной реакции, как правило антитело, метится флюоресцирующим красителем (маркировка, конъюгирование). После возбуждения флюоресцирующего агента положение антигена становится доступным непосредственному наблюдению вследствие развития флюоресценции.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Предложенный в 1941 г. Кунсом, этот метод после многочисленных усовершенствований прочно вошел в лабораторную практику. Метод включает следующие важные этапы: — получение, характеристика и маркировка антисывороток; — получение антигенного субстрата; — проведение анализа, т. е. обработка флюоресцирующими антителами; — микроскопический анализ флюоресценции препаратов.

В настоящее время используют преимущественно коммерческие препараты флюоресцирующих АС. Если необходимых флюоресцирующих сывороток нет, можно воспользоваться непрямым методом флюоресцентного маркирования, присоединив к исследуемому объекту антигена, к которому имеются меченые антитела. Очень редко приходится разрабатывать собственный препарат меченых флюоресцентным красителем антител. Работа с флюоресцирующими антителами, особенно оценка получаемых с их помощью результатов, требует определенных навыков. Всегда следует проводить анализ с учетом неспецифической или нежелательной специфической флюоресценции. Необходимо учитывать факторы, которые могут оказывать влияние на флюоресцентный анализ. К ним относятся:

 ► желательная специфическая флюоресценция: специфическое связывание меченых антител с соответствующим антигеном; ► неспецифическая флюоресценция: неспецифическое отложение флюоресцирующих конъюгатов на различных тканевых структурах, например, вследствие избытка красителя или взаимодействия меченых антител с Fc-рецепторами; включение метки в другие сывороточные белки, кроме Ig, и неспецифическое связывание этих белков, например альбумина, фибронектина, аутофлюоресценция; ► нежелательная специфическая флюоресценция: наличие перекрестных реакций или недостаточная специфичность самого конъюгата. В случае прямого иммунофлюоресцентного анализа возможно неспецифическое отложение меченых антител.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.



biofile.ru


Смотрите также