Справочник химика 21. Конъюгаты антител


Конъюгаты антител (ат) с пероксидазой хрена в Москве – Bialexa

Пероксидаза хрена или HRP (Horseradish peroxidase) выделяется из корневищ хрена Armoracia rusticana и является гликопротеином с молекулярной массой около 40 кДа. Содержит в качестве кофакторов гем и два иона кальция. Фермент пероксидаза катализирует реакцию, протекающую по схеме:

субстрат + h3O2 = окисленный субстрат + 2 h3O

Метод конъюгирования основан на использовании полисахаридных цепей фермента для конъюгирования с антителами. Мягкое окисление остатков сахаров периодатом натрия создает активные альдегидные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами иммуноглобулинов с образованием онований Шиффа. Восстановление полученных оснований Шиффа приводит к формированию стабильных высокомолекулярных конъюгатов (см. схему ниже).

Схема реакции конъюгирования антител с пероксидазой хрена.

Конъюгаты антител с пероксидазой стабильны и могут храниться при +4oС. Обязательным условием при этом является наличие в растворе бактериостатических компонентов, препятствующих развитию микроорганизмов и протеолитической деградации белкового конъюгата. Для длительного хранения конъюгатов при температуре −20oС в качестве криопротектора может использоваться глицерин (содержание в растворе — 50%).

Наиболее широко используемый в биохимии бактериостатик азид натрия является ингибитором пероксидазы и не может быть использован при хранении растворов этого белка. В случае, если планируется хранить растворы конъюгата при +4 oС долгое время, используют 0,05% раствор органического бактериостатика ProСlin 300 (Sigma-Aldrich).

Применение: Фермент используется для конъюгирования (соединения с другими веществами) в целях усиления слабого сигнала нужных белков и молекул и их более точной идентификации. Готовые конъюгаты применяются в анализах различного типа: вестерн-блоттинге, иммуноферментных, иммуногистохимических, к примеру, для иммуноферментного определения антител к тиреоидной пероксидазе.

Протокол:

I. Подготовка антител.

Для успешной конъюгации пероксидазы с антителами, последние необходимо перевести в 0,1 М Na-карбонатный буфер, рН 9,5. Для этой цели можно использовать колонки на основе Сефадекса-25 для смены буфера фирмы GE Healthcare (NAP-5, NAP-10, PD-10) или диализ.

II. Активация пероксидазы.

1. Навеску 2 мг пероксидазы растворить в 0,4 мл бидистиллированной воды. 2. Приготовить раствор 0,1 М периодата натрия в бидистиллированной воде и сразу же добавить 0,1 мл этого раствора к раствору пероксидазы. Быстро перемешать, обернуть пробирку с реакционной смесью фольгой (реакция должна проводиться в темноте) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Признаком образования активной формы пероксидазы служит изменение окраски раствора фермента с желто-коричневой на зеленоватую. При длительном хранении на свету активированная форма быстро переходит в неактивную, при этом зеленая окраска снова переходит в коричневую. Поэтому все последующие стадии должны осуществляться по возможности быстро. 3. Активированную пероксидазу перевести в буфер пришивки (1 мМ ацетат натрия рН 4,4 на колонке), используя колонку для смены буфера.

III. Конъюгирование антител с пероксидазой.

Оптимальное массовое соотношение количества антител к количеству пероксидазы 2:1, т.е. на 2 мг активированной пероксидазы необходимо взять 1 мг антител. Раствор антител к пероксидазе (активированной) добавляется в 0,1 М Na-карбонатном буфере, рН 9,5. Инкубацию реакционной смеси проводить при перемешивании на шейкере в течение 40 минут при +37oС в пробирке, обернутой фольгой.

IV. Восстановление не прореагировавших альдегидных групп пероксидазы боргидридом натрия.

Приготовить свежий раствор борогидрида натрия, растворив 2 мг в 0,5 мл бидистиллированной воды. Добавить 0,1 мл полученного раствора к реакционной смеси и инкубировать 20 мин при +37oС.

V. Перевод конъюгата в буфер хранения.

Конъюгат антител с пероксидазой перевести в буфер хранения (PBS) на соответствующей колонке для смены буфера или методом диализа, добавить ProClean до конечной концентрации 0,05% и тщательно перемешать. Конъюгат хранить при +4oС. Обратите внимание: возможно хранение конъюгатов при −20°С в присутствии 50% глицерина.

VI. Тестирование полученного конъюгата.

Тестирование проводится с использованием метода прямого иммуноферментного анализа путем раститровки полученного конъюгата по антигену.

Также отметим, что в ассортименте продукции Биалекса есть моноклональные АТ к пероксидазе хрена, с помощью которых можно детектировать сам фермент HRP при иммуногистохимических и иммуноферментных анализах.

www.bialexa.ru

Конъюгаты антигенов и антител с пероксидазой хрена

Пероксидаза хрена или HRP (Horseradish peroxidase) выделяется из корневищ хрена Armoracia rusticana и является гликопротеином с молекулярной массой около 40 кДа. Содержит в качестве кофакторов гем и два иона кальция. Фермент пероксидаза катализирует реакцию, протекающую по схеме:

субстрат + h3O2 = окисленный субстрат + 2 h3O

Метод конъюгирования основан на использовании полисахаридных цепей фермента для конъюгирования с антителами. Мягкое окисление остатков сахаров периодатом натрия создает активные альдегидные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами иммуноглобулинов с образованием онований Шиффа. Восстановление полученных оснований Шиффа приводит к формированию стабильных высокомолекулярных конъюгатов (см. схему ниже).Схема реакции конъюгирования антител с пероксидазой хрена

Конъюгаты антител с пероксидазой стабильны и могут храниться при +4oС. Обязательным условием при этом является наличие в растворе бактериостатических компонентов, препятствующих развитию микроорганизмов и протеолитической деградации белкового конъюгата. Для длительного хранения конъюгатов при температуре −20oС в качестве криопротектора может использоваться глицерин (содержание в растворе — 50%).

Наиболее широко используемый в биохимии бактериостатик азид натрия является ингибитором пероксидазы и не может быть использован при хранении растворов этого белка. В случае, если планируется хранить растворы конъюгата при +4 oС долгое время, используют 0,05% раствор органического бактериостатика ProСlin 300 (Sigma-Aldrich).Применение: Фермент используется для конъюгирования (соединения с другими веществами) в целях усиления слабого сигнала нужных белков и молекул и их более точной идентификации. Готовые конъюгаты применяются в анализах различного типа: вестерн-блоттинге, иммуноферментных, иммуногистохимических, к примеру, для иммуноферментного определения антител к тиреоидной пероксидазе.

Протокол:

I. Подготовка антител.Для успешной конъюгации пероксидазы с антителами, последние необходимо перевести в 0,1 М Na-карбонатный буфер, рН 9,5. Для этой цели можно использовать колонки на основе Сефадекса-25 для смены буфера фирмы GE Healthcare (NAP-5, NAP-10, PD-10) или диализ.

II. Активация пероксидазы.1. Навеску 2 мг пероксидазы растворить в 0,4 мл бидистиллированной воды.2. Приготовить раствор 0,1 М периодата натрия в бидистиллированной воде и сразу же добавить 0,1 мл этого раствора к раствору пероксидазы. Быстро перемешать, обернуть пробирку с реакционной смесью фольгой (реакция должна проводиться в темноте) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Признаком образования активной формы пероксидазы служит изменение окраски раствора фермента с желто-коричневой на зеленоватую. При длительном хранении на свету активированная форма быстро переходит в неактивную, при этом зеленая окраска снова переходит в коричневую. Поэтому все последующие стадии должны осуществляться по возможности быстро.3. Активированную пероксидазу перевести в буфер пришивки (1 мМ ацетат натрия рН 4,4 на колонке), используя колонку для смены буфера.

III. Конъюгирование антител с пероксидазой.Оптимальное массовое соотношение количества антител к количеству пероксидазы 2:1, т.е. на 2 мг активированной пероксидазы необходимо взять 1 мг антител. Раствор антител к пероксидазе (активированной) добавляется в 0,1 М Na-карбонатном буфере, рН 9,5. Инкубацию реакционной смеси проводить при перемешивании на шейкере в течение 40 минут при +37oС в пробирке, обернутой фольгой.

IV. Восстановление не прореагировавших альдегидных групп пероксидазы боргидридом натрия.Приготовить свежий раствор борогидрида натрия, растворив 2 мг в 0,5 мл бидистиллированной воды. Добавить 0,1 мл полученного раствора к реакционной смеси и инкубировать 20 мин при +37oС.

V. Перевод конъюгата в буфер хранения.Конъюгат антител с пероксидазой перевести в буфер хранения (PBS) на соответствующей колонке для смены буфера или методом диализа, добавить ProClean до конечной концентрации 0,05% и тщательно перемешать. Конъюгат хранить при +4oС. Обратите внимание: возможно хранение конъюгатов при −20°С в присутствии 50% глицерина.

VI. Тестирование полученного конъюгата.Тестирование проводится с использованием метода прямого иммуноферментного анализа путем раститровки полученного конъюгата по антигену.

Также отметим, что в ассортименте продукции Биалекса есть моноклональные АТ к пероксидазе хрена, с помощью которых можно детектировать сам фермент HRP при иммуногистохимических и иммуноферментных анализах.

xn----itbacjeaqqec1b4d.xn--p1ai

Биотин конъюгаты с антителами - Справочник химика 21

    Предложено несколько способов дальнейшего повышения чувствительности ферментных меток. Например, в методе ELISA с усилением используют комплексы ферментов со специфическими антителами (Butler et al, 1985) в системе ЛВС применяют комплексы авидина с конъюгатом [биотин — фермент] и конъюгаты биотина с антителами (Hsu, 1985). [c.32]

    Для этого метода предварительно синтезируют каким-либо химическим методом конъюгаты антител с биотином и фермента с авидином, а затем при простом смешивании реагентов — конъюгат. [c.191]

    Достоинствами данного подхода являются универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов, и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимического комплекса. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что при синтезе конъюгата антитело—биотин с одной молекулой антитела может быть ковалентно связано до 90 молекул биотина. Молекула авидина имеет четыре центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс с участием определяемых антител на конечной стадии анализа будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков, что приводит к существенному выигрышу в чувствительности определения метки, а следовательно, и всего анализа. [c.105]

    В АБМ-методе авидин используется в роли мостика между двумя или более молекулами биотинсодержащего конъюгата типа [биотин — антитела] или [биотин — пероксидаза]. Этот метод основан на том, что авидин содержит четыре центра связывания биотина. Теоретически он должен характеризоваться более высокой чувствительностью, чем МАБ-метод, благодаря возможному усилению в системе взаимодействий биотин — авидин — биотин. Молекулы авидина, связывающиеся с конъюгатом-антитела — биотин], вообще говоря, могли бы связать еще [c.415]

    Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5 -конец зонда X метят биотином, а З -конец зонда V — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. [c.198]

    Наличие разных моноклональных антител к одному и тому же продукту лежит в основе количественного иммунологического анализа белка методом сэндвича , когда одно антитело используется в качестве твердой фазы для связывания присутствующего в растворе антигена, а другое антитело используется в качестве меченого зонда для обнаружения иммобилизованного материала. Хотя мы работали как с зондами, меченными так и с зондами, меченными ферментативно активными конъюгатами (в последнем случае обычно к антителам присоединяли биотин и использовали конъюгат фермента с авиди-ном), здесь мы приводим описание только первой методики, поскольку в нашей практике она оказалась более удобной. Этот метод пригоден также и для выяснения следующего вопроса о том, конкурируют ли между собой антитела за взаимодействие со стерически тесно ассоциированными участками, а также для изучения белок-белковых взаимодействий. [c.197]

    Биотин и авидин являются нефлуоресцирующими молекулами, которые обладают высоким сродством друг к другу. Они легко присоединяются к антителам и многим флуорохромам. Чаще всего биотин конъюгируют с антителами, а авидин — с флуорохромами. Обычно клетки сначала инкубируют с био-тинилированными антителами, а затем с конъюгатом флуоро-хром-авидин (как это делают при непрямом способе детектирования). С помощью этого метода можно выявлять антитела по флуоресценции разного цвета в зависимости от используемого для конъюгации с авидином флуорохрома. Более важным, однако, является то, что система авидин — биотин часто позволяет решить проблему мечения антител определенными флуорохромами. Поскольку биотин относительно легко конъюгирует с антителами, а авидин — с большинством флуорохромов, даже в тех случаях, когда не удается непосредственно присоединить флуорохром к антителам, их можно выявлять непрямым способом. [c.334]

Рис. 18-4. Антитела против ДНФ-лизина препятствуют связыванию конъюгата [ДНФ-лизин — -галак-тозидаза — биотин] с авидин-сефа-розой. К 200 мкл раствора конъюгата (1,36 нмоль) добавляли различные количества препарата ЦНФ-специфической антисыворотки. Объем смеси доводили до 600 мкл и добавляли фиксированные количества 10 /о-ной суспензии авидин-сефарозы (400 мкл). Инкубировали 30 мин при 25 °С и центрифугировали в течение 5 мин. В супернатантах (800 мкл) определяли ферментативную активность (светлые кружки). Осадки трижды промывали и определяли в них активность фермента (темные кружки), как описано для рис, 18-3, Рис. 18-4. <a href="/info/1390828">Антитела против</a> ДНФ-лизина препятствуют связыванию конъюгата [ДНФ-лизин — -галак-тозидаза — биотин] с авидин-сефа-розой. К 200 мкл раствора конъюгата (1,36 нмоль) добавляли различные количества препарата ЦНФ-специфической антисыворотки. Объем смеси доводили до 600 мкл и добавляли фиксированные количества 10 /о-ной суспензии <a href="/info/1402221">авидин-сефарозы</a> (400 мкл). Инкубировали 30 мин при 25 °С и центрифугировали в течение 5 мин. В супернатантах (800 мкл) определяли <a href="/info/6448">ферментативную активность</a> (светлые кружки). Осадки трижды промывали и определяли в них <a href="/info/5968">активность фермента</a> (темные кружки), как описано для рис, 18-3,
    Вещества, меченные биотином, могут быть обнаружены с помощью любого из используемых конъюгатов или комплексов авидина с тем или иным индикаторным реагентом типа авидин — флуоресцеин, авидин — ферритин или АБК- Таким образом, после того как вещество помечено биотином, для его обнаружения можно приспособить любую систему анализа. В то же время при использовании антител, меченных флуоресцеином или пероксидазой, круг их применения ограничен, т. е. авидин-биотиновая система характеризуется гораздо большей гибкостью, чем дру- [c.419]

chem21.info


Смотрите также