Гибридома. Гибридома моноклональные антитела


  ГЛАВА 5 ГИБРИДОМНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА

  В конце 60-х — начале 70-х годов XX в. были разработаны лабораторные методы клонирования клеток in vitro. Для этого понадобилось создать питательные среды, материалы для лабораторной посуды и термостаты-инкубаторы, позволившие имитировать условия внутренней среды организма для сохранения жизнеспособности клеток млекопитающих. В течение 10—12 лет удавалось клонировать только опухолевые клетки, поскольку их собственным свойством является способность неограниченно (в благоприятных для них внешних условиях) делиться митозом. Г. Келлер и Ц. Милыптейн в 1974—1975 гг. применили метод получения гибридных соматических клеток, который использовали цитогенетики для изучения локализации генов, контролирующих тот или иной признак в той или иной хромосоме (гибридные клетки выбрасывают большую часть хромосом, но не все), к лимфоцитам, но с иными целями. Г. Келлер и Ц. Милыптейн получили гибридные клетки из лимфоидной опухоли (миелома) и нормального лимфоцита. Гибридные клетки имели часть хромосом (а следовательно, и свойств) нормального лимфоцита (другая часть хромосом выбрасывалась из клеток в течение первых делений, пока геном не стабилизировался) и часть — от опухоли. Размножались только клетки, унаследовавшие от миеломы способность к неограниченному делению. Параллельно в них шел биосинтез тех или иных продуктов нормального лимфоцита, например антител; последние и требовались Г. Келлеру и Ц. Милыптейну. Неограниченно делящиеся клетки «позволяют» себя клонировать, т.е. физически «рассадить» по одной (каждую в отдельную посуду) и получить клоны клеток — потомков одной клетки. Такие клетки назвали гибридомами. Лимфоциты для гибридизации получают из селезенки или лимфоузлов, предварительно иммунизированных целевым антигеном мышей (чаще всего — линии Balb/c). В качестве опухолевых клеток- партнеров используют специально выведенные для получения гибридом мутантные клетки мышиной миеломы (иногда ее же называют плазмоцитомой, что в данном случае одно и то же), полученные из перевивной линии миеломных клеток МОРС-21 от мышей Balb/c,

поддерживаемой в культуре in vitro с 1921 г. Келлер и Милыптейн использовали мутантные миеломные клетки, выведенные цитогенетиками ранее также для получения гибридных клеток млекопитающих, но в иных целях: поскольку гибридные клетки выкидывают большую часть хромосом, по оставшимся цитогенетики устанавливали локализацию тех или иных признаккодирующих генов в конкретных хромосомах. «Мутантность» миеломных клеток необходима для метаболической селекции клеток гибридом от неслившихся с лимфоцитами клеток миеломы. Эта «мутантность» состоит в отсутствии в миеломных клетках действующего гена, кодирующего фермент ГГФРТ. Данный фермент катализирует синтез гуанина (одного из 4 азотистых оснований, входящих в состав ДНК) из гипоксантина. Вскоре после первой публикации Келлера и Милыптейна в распоряжении «гибридомщи- ков» во всем мире оказались две удобные линии мутантных миелом — P3/X63-Ag8-653 и SP2/0-Agl4, которые быстро пролиферируют и сами не продуцируют никаких частей иммуноглобулинов. Суспензию лимфоидных клеток от иммунных мышей смешивают в одной пробирке в минимальном объеме среды с суспензией миеломных клеток и на 1—2 мин добавляют сливающий агент. У Келлера и Милыптейна сначала этим агентом был, как и у цитогенетиков, вирус Сендай, но через несколько месяцев уже все «гибридомщики» в качестве сливающего агента использовали синтетические полимеры — полиэтиленгликоли с молекулярными массами от 1540 до 6000 D. По прошествии 1—2 мин суспензию клеток, содержащую смесь неслившихся лимфоидных клеток, неслившихся клеток миеломы и гибридных клеток 3 вариантов («лимфоцит—лимфоцит», «миелома—миелома», «лимфоцит—миелома»; из них искомыми клетками являются только гибриды «лимфоцит—миелома»), отмывают и разводят в рассчитанном объеме селективной среды HAT. HAT означает «Hypoxanthine-Aminopterin Thymidine». Указанные 3 компонента в известных концентрациях вводят в полную культуральную среду. В течение первых 7—10 дней культивирования названной смеси клеток в культуре происходит следующее:

  1. неслившиеся лимфоциты и гибриды «лимфоцит—лимфоцит» погибают в силу своей природной недолговечности;
  2. неслившиеся клетки миеломы и гибриды «миелома—миелома» погибают от невозможности осуществлять биосинтез своей ДНК в присутствии аминоптерина — метаболического яда,
избирательно блокирующего ферменты биосинтеза пиримидиновых оснований de novo из М5М10-метилен-тетрагидрофолата; биосинтез пуриновых оснований из гипоксантина в этих клетках также невозможен в связи с отсутствием ГГФРТ;
  1. единственные клетки, имеющие возможность выжить в среде HAT, это искомые гибридные клетки «лимфоцит—миелома»: биосинтез пуриновых оснований у них обеспечен ГГФРТ, ген которой получен из нормального лимфоцита, и средовым гипоксантином, а биосинтез пиримидиновых оснований осуществляется из средового тимидина с участием тимидинкиназы.
Основные этапы гибридомной технологии показаны на рис. 5.1. От клеток миеломы данные гибридные клетки наследуют свойство неограниченной пролиферации. От нормальных иммунных В-лимфоцитов — биосинтез иммуноглобулинов. Пролиферация «non-stop» позволяет клонировать гибридные клетки, т.е. рассеять по 1 в лунку и подождать, когда из этой одной клетки при благоприятных условиях культивирования вырастет клон, т.е. много одинаковых клеток (с точностью до спонтанных мутаций). Какие из получившихся «лимфоцит—миеломных» гибридных клеток продуцируют заданные антитела, выясняют, отбирая из лунок пробы супернатанта на соответствующий иммуноанализ. В дальнейшем избранные гибридомы неоднократно реклонируют и выводят в массовые культуры — реакторы in vitro или асцитные опухоли у сингенных мышей. Из культуральных супернатантов или асцитных жидкостей выделяют гибридомные моноклональные антитела в очищенном виде. Если клон клеток гибридомы синтезирует антитела, то эти антитела называют моноклональными. Как показал опыт, все клетки клонированной гибридомы синтезируют одинаковые антитела — и по специфичности активного центра, и по изотипу тяжелой цепи, т.е. моноклональные антитела — не только продукт моноклона, но и препарат одинаковых иммуноглобулинов. В конце 1970-х годов научились выращивать in vitro и клонировать Т-лимфоциты, не скрещенные с опухолевой линией клеток. Это стало возможным только после открытия фактора роста Т-лимфоцитов, позже названного ИЛ-2. Именно клонирование Т-лимфоцитов позволило открыть субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов и сделать множество других открытий, в том числе идентифицировать ВИЧ (достаточные для исследования количества генов и белков вируса смогли наработать

только на Т-лимфоцитах, культивируемых in vitro в присутствии факторов роста). В-лимфоциты без превращения их в гибридомы можно заставить делиться (что позволяет их клонировать), если инфицировать их вирусом Эпштейна—Барр (он трансформирует нормальные В-лимфоциты в опухоль из В-лимфоцитов). Таким образом, моноклональные антитела, продуцируемые одним клоном, являются:

  • высокоспецифичными, направленными к заданной антигенной детерминанте;
  • идентичными по изотипу, аллотипу и идиотипу, а также по аффинитету и физико-химическим характеристикам.
Стабильные культуры гибридом способны продуцировать в неограниченном количестве моноклональные антитела. Моноклональные антитела в настоящее время широко применяют в различных областях медицины. В основе применения монАТ в различных областях лежит возможность получения больших количеств высокоаффинных антител, специфичных по отношению:
  1. к иммуногенным антигенам, определяющим гистосовместимость и дифференцировку;
  2. дифференцировочным, опухолевым и другим антигенам клеточной поверхности, которые лишены полиморфизма и неиммуногенны в аллогенных системах, но распознаются при ксеногенной иммунизации;
  3. вирусным и бактериальным антигенам;
  4. единичным антигенным детерминантам разнообразных белков, нуклеиновых кислот и сахаров.
Применение монАТ позволяет определять и разделять субпопуляции клеток, различать отдельные стадии развития клеток, более точно типировать ткани, более точно идентифицировать микроорганизмы, а также более надежно определять иммунологическими методами биологически важные макромолекулы. В медицине на основе монАТ разработано большое количество систем диагностирования различных заболеваний (инфекционных, онкологических и др.). Активно разрабатываются и лекарственные препараты на основе монАТ, например противоопухолевые препараты, антицитокиновые антитела (препарат ремикейт и др.) Однако было показано, что применение мышиных монАТ для иммунотерапии опухолевых заболеваний приводит к появлению различных побочных эффектов и отличается слабой эффективностью действия. Модификация мышиных монАТ (гуманизированные антитела и различные конъюгаты монАТ — с радионуклидами, лекарствами, токсинами и пр.) открывает новые возможности в диагностике и лечении опухолевых и других заболеваний.

www.med24info.com

Гибридома — это, что такое, какие, определение, значение, доклад, реферат, конспект, сообщение, вики — WikiWhat

Содержание (план)

Гибридома — это набор быстро делящихся гибридных клеток, образо­ванных в результате соединения лимфоцитарной и любой другой клетки с раковой клеткой.

Известно, что нормальные клетки делятся и размножаются очень медленно, и их деление ограниченно. Раковые же клетки обладают свойством неограниченного и быстрого роста. Биомассу нормальной клетки, синтезирующей любой полезный белок, можно размножать в искусственных условиях и получать эти белковые вещества в больших количествах. Однако в силу ограниченности биомассы нормальных клеток эти проблемы не находили своего решения.

В 1975 г. английские учёные Келер и Мильштейн путём слияния лимфоцитной клетки, синтезирующей в искусственных условиях антитела, с раковой клеткой, обладающей свойством неограничен­ного роста, создали гибридную клетку, не имеющую аналогов в природе. Эта клетка была названа гибридомой.

Получение гибридом

В результате была достигнута возможность неограниченного размножения клеток, синтезирующих антитела в искусственных условиях (рис. 15). Гибридомная клетка может быть получена в результате целесо­образного соединения любой клетки с раковыми клетками.

Получение поликлональных антител

На рисунке 15, А приведена схема получения поликлонального антитела. Мышь иммунизи­руется каким-нибудь антигенным веществом. В клетках селезёнки образуются специальные спленоциты, синтезирующие антитела отдельно для каждой антигенной группы вещества. Они могут распознавать только свою соответствующую антигенную группу. Образовавшаяся смесь различных антител называется поликлональными антителами.

Получение моноклональных антител

На рисунке 15, Б изображена схема получения гибридом и синтез моноклонального антитела. Спленоциты, образовавшиеся в ответ на антиген, сливаются с миеломной (раковой) клеткой, и получается гибридома. В результате раздельного размножения гибриде) м получаются их клоны. Каждый клон-гибридома синтезирует моноклональное антитело, распознающее и связывающее только один антигенный признак. Моноклональные антитела используются для высокоточной диагностики заболеваний. Материал с сайта http://wikiwhat.ru

Использование гибридом

В настоящее время технология получения гибридом может быть использована наравне с генной инженерией при синтезе белковых регуляторов, антител и гормонов. Поэтому возможности биотехнологии, основанной на клеточной инженерии, неограниченны.

Таким образом, развитие клеточной инженерии привело к возникновению биотехнологии получения гибридом и создало возможности для синтеза и производства моноклональных антител. В результате объединения этой биотехнологии, основанной на клеточной инженерии, с генной инженерией появилась возможность разработки методов точной диагностики инфекционных и наслед­ственных заболеваний, а также создания биотехнологий производ­ства сывороточных антигенов — вакцин, предупреждающих инфек­ционные болезни.

Картинки (фото, рисунки)

  • Рис. 15. Схема получения поликлональных и моноклональных антител
На этой странице материал по темам:
  • Гибоидома

  • 49. гибридомы и их значение

  • Биотехнология получения поликлональных и моноклпнальных антител

  • Клеточная инженерия гибридом

  • Гибриды клеток желудка человека что это

Вопросы к этой статье:
  • Как называется клетка, полученная в результате соединения лимфоцитарной клетки, синтезирующей антитела, с раковой клеткой?

  • Каковы преимущества гибридомной клетки?

  • Как размножить гибридомные клетки для получения раздельных клонов гибридомных клеток, синтезирующих моноклональные антитела?

  • Каково значение моноклональных антител?

  • В каких целях используются моноклональные антитела?

wikiwhat.ru

Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии

Факультет медицины Кафедра СРС Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии. Выполнил: Баимбетов А.А СТР – 247 Принял: Туркестан 2017 г.

2. СОдержание

СОДЕРЖАНИЕ I. Введение II. Основная часть Структура антител Понятие о МКАТ Получение МКАТ Гибридомная технология Применение МКАТ в иммунологии III.Заключение Список литетратуры

3. Введение

ВВЕДЕНИЕ Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Такие сыворотки называются иммунные. Антитела выделяют из сыворотки в виде γ-глобулиновой фракции, осаждая их из сыворотки крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Самое главное, полученные антитела содержат много антител с различной специфичностью, ко многим антигенным детерминантам, как антигена, которым проводилась иммунизация, так и другим антигенам, с которыми встречалось животное-донор.

4. Список сокращений

Ig – иммуноглобулин IgG, IgA, IgM, IgE, IgE - классы сывороточных иммуноглобулинов АГ – антиген АОК – антитело образующие клетки АТ – антитело ГАТ - культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин МкАТ (мАТ) (англ. mab) – моноклональные антитела ПЭГ - полиэтиленгликоль

5. Структура антител

При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются защитные белки - антитела, для которых характерна уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, - точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6—8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка.

6. Моноклональные  антитела

Моноклональные антитела Моноклональные антитела - это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток. Антитела синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена

7. ИССЛЕДОВАНИЕ

Решение проблемы было предложено в 1975 году учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы (гибридные опухолевые клетки) образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro. Георг Кёлер (George Kohler) Цезарь Мильштейн (Cesar Milstein)

8. Схема получения гибридом

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОМ Если к суспензии В-лимфоцитов добавить клетки плазмоцитомы и полиэтиленгликоль, то после инкубации, требующейся для слияния клеток, в системе находились следующие клетки: - гибриды АОК и АОК (В-лимфоцитов и Влимфоцитов), - гибриды АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными - АОК и клетки плазмоцитомы (не слившиеся). Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных не слившихся клеток и от гибридов иной специфичности. Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селективной питательной среде.

11. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител. В основе ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему моноклональным антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием так называемого конъюгата, который представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена).

12. отличие

ОТЛИЧИЕ В отличие от поликлональных гетерогенных сывороток, содержащих большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью, аффинитетом и физико-химическими свойствами, препараты моноклональных антител содержат продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте и обладающий всегда одинаковыми физико- химическими характеристиками и сродством к антигену. Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии.

13. Области применения моноклональных антител:

идентификация субпопуляций лимфоцитов человека истощение клеточных популяций выделение клеток установление функций молекул клеточной поверхности определение группы крови диагностика опухолей и локализация опухолей иммунорадиометрический анализ анализ сложных смесей антигенов анализ эмбрионального развития квадромы анализ иммунного ответа искусственные ферменты

14. Цели использования мкат

ЦЕЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МКАТ •для идентификации клеток - выявления Т- и В-лимфоцитов и других клеток, определения их свойств; •для осуществления современных радиоиммунных, иммуноферментных и иммунолюминесцентных методов выявления антигенов и антител; •для определения локализации антигенов в организме и доставки к ним (например, в опухоль) лекарственных веществ, присоединенных к антителам; •для приготовления иммуносорбентов, позволяющих выделить ели удалить из организма антигены или клетки данной специфичности.

15. Терапевтическое применение

Терапевтическое применение моноклональных антител, которые являлись мышиными антителами, было ограничено. Их введение человеку сопровождалось иммунным ответом на чужой (гетерогенный) мышиный белок. Это приводило к быстрому устранению желаемого терапевтического эффекта, а так же поражению почек и гиперчувствительности к чужеродному мышиному белку.

16. Ритуксимаб

Ритуксимаб (Ритуксан, Мабтера) представляет собой химерные моноклональные антитела мыши/человека специфически связывающиеся с CD20+ антигеном. Этот антиген локализуется на поверхности пре-В-лимфоцитов и зрелых Bлимфоцитов, но отсутствует на стволовых гемопоэтических клетках, нормальных плазматических клетках и здоровых клетках других тканей.

17. Алемтузумаб

Алемтузумаб (Кампат, Кэмпас, Campath) – гуманизированное МКА, связывающееся с CD52. Антиген CD52 экспрессируется на мембране большинства зрелых нормальных и опухолевых Т- и Влимфоцитов с очень высокой плотностью — примерно 500 000 молекул на клетку (по сравнению с антигеном CD20, плотность экспрессии которого составляет около 8000 молекул на клетку).

18. Заключение

Новое поколение МкАТ-технологий, объединяют в себе преимущества МкАТ и низкомолекулярных препаратов, обладающих высокой специфичностью и низкой токсичностью, возможностью воздействовать на объекты, нераспознаваемые современными МкАТ, в том числе на активные центры ферментов и рецепторов. Такие МкАТ обладают более высокой стабильностью, что допускает возможность их перорального, ингаляционного или местного применения

19. ЛИТЕРАТУРА

1. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б. Моноклональиые антитела: Гибридомы: новый уровень логического анализа. М.: Медицина, 1983. 2. Роит А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991. 3. А.Ю. Барышников, Е.Р. Полосухина. Моноклональные тела в онкологии. 4. Г.И. Абелев. Моноклональные антитела.

ppt-online.org


Смотрите также