Диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения. Донор специфические антитела


диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения - патент РФ 2491552

Группа изобретений относится к медицине и касается диагностикума, содержащего лимфоциты человека для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационном периоде, характеризующегося тем, что диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора; способа получения диагностикума; способа прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включающего реакцию на определение донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, характеризующегося тем, что используют указанный диагностикум. Изобретение обеспечивает получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, трансплантологии и хирургии, и может быть использовано для проведения мониторинга донор-специфических антител к системе HLA после аллотрансплантации органа в течение пяти лет и более.

Трансплантация органов, тканей и клеток - это замена больному путем хирургической операции пораженного, изношенного органа, части его или ткани, полностью утративших способность выполнять свои функции. Согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (в редакции от 20.06.2000 № 91-ФЗ, от 16.10.2006 № 160-ФЗ) является средством спасения жизни и восстановления здоровья граждан. Одной из главных причин потери трансплантата является реакция отторжения донорского органа. Различают сверхострую, острую и хроническую реакции отторжения. Сверхострая реакция отторжения протекает бурно с первых минут или часов после пересадки органа. Острая реакция отторжения развивается в период с 4 до 90 дня после операции. Хроническая реакция отторжения диагностируется через несколько недель, месяцев и лет после операции, может несколько раз рецидивировать после подавления ее иммуносупрессивной терапией. Реакция отторжения трансплантата обусловлена клеточными и/или гуморальными иммунными механизмами. В ответ на чужеродные человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) в организме реципиента вырабатываются донор-специфические антитела (ДСА).

Для диагностики реакции отторжения производят биопсию трансплантата [Cornell LD, Smith RN, Colvin RB. Kidney transplantation: mechanisms of rejection and acceptance. Annu Rev Pathol 2008; 3:189-220; Tomasoni S, Remuzzi G, Benigni A. Allograft rejection: acute and chronic studies. Contrib Nephrol 2008; 159:122-34], по результатам которой может отмечаться смешанная гистологическая картина. Для интерпретации результатов биопсии используются универсальные, регулярно обновляемые критерии Банфф (Banff) [Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff '05 Meeting Report: differential diagnosis of chronic allograft injury and elimination of chronic allograft nephropathy ('CAN') Am J Transplant 2007; 7(3):518-26;. Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions. Am J Transplant 2008; 8(4):753-60], на основании которых делается заключение о прогнозе и назначается лечение [Mengel M, Sis В, Halloran PF. SWOT analysis of Banff: strengths, weaknesses, opportunities and threatsof the international Banff consensus process and classification system for renal allograft pathology. Am J Transplant 2007; 7(10):2221-6]. В настоящее время маркером хронической посттрансплантационной нефропатии, опосредованной антителами, считают обнаружение методом иммунофлуоресцентной микроскопии C4d-фрагмента на поверхности эндотелия перитубулярных капилляров. Выявлена корреляция между отложением C4d и наличием в сыворотке реципиента донор-специфических антител.

Для исследования специфических антител используется ДИАГНОСТИКУМ - стандартный препарат, используемый в качестве антигена при серологических исследованиях. В настоящее время определение донор-специфических антител (ДСА) в посттрансплантационном периоде является важным диагностическим критерием реакции отторжения трансплантата. ДСА de novo могут образовываться как в ранние сроки на 3-21 сутки после трансплантации, так и через несколько лет после пересадки органа. Мониторинг донор-специфических антител у реципиента можно осуществлять в течение длительного времени после трансплантации только в том случае, если донор живой, то есть при родственной трансплантации. Исследование образования de novo донор-специфических антител у реципиента в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа не представляется возможным ввиду отсутствия донорских лимфоцитов. Особая трудность отмечается при мультиорганном заборе, когда от одного донора трансплантируют органы нескольким реципиентам и требуется большое количество донорских клеток. Таким образом, для проведения определения донор-специфических антител требуется большое количество стандартизованного антигенного материала донора. С этой целью используют два вида клеток: лимфоциты периферической крови и лимфоциты селезенки донора.

В настоящее время существуют несколько методов определения донор-специфических антител в сыворотке реципиента.

Серологический метод. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови, реже селезенки клетки или лимфоузла. В основе метода лежит комплементзависимый микролимфоцитотоксический тест (cross-match реакция) [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Этот тест базируется на способности антител к главному комплексу гистосовместимости в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты.

Цитометрический метод. Использование этого метода позволяет выявить очень низкие концентрации антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови. Сывороточные антитела реципиента связываются с антигенами HLA на поверхности лимфоцитов донора. После этого добавляются антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуоресцентной меткой. Дополнительное добавление моноклональных антител к CD3 и CD19 позволяют дифференцировать антитела к I классу (на CD3 + лимфоцитах, Т-клетки) и ко II классу (на CD19 + лимфоцитах, В-клетки) HLA [Robson A., Martin S.Т and В cell. crossmatching using three-colour flow cytometry // Transplant Immunology. - 1996. - V. 4. - 3. - P. 203-208]. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако, помимо антител к антигенам HLA, выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантитела. Обусловленная этими факторами низкая специфичность метода приводит к получению ложноположительных результатов.

Метод на основе хМАР-технологии. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови крови. Определение донор-специфических антител проводят по технологии хМАР на платформе Luminex с помощью наборов LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) фирмы Invitrogen (США) [Detection of donor-specific antibodies using HLA-coated microspheres: another tool for kidney transplant risk stratification / E.M.Gibney, L.R.Cagle, B.Freed, S.E.Wamell, L.Chan, A.C.Wiseman // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2006. - V. 21. - Is. 9. - P.2625-2629]. Набор содержит смесь Luminex частиц. Одни частицы в смеси коньюгированы с моноклональными AT к I классу HLA, другие - к II классу HLA. Донорские лимфоциты лизируют, затем лизат смешивают с этими двумя категориями частиц. При инкубировании частицы связываются с растворенными донорскими молекулами HLA, образуя человеческие лейкоцитарные антигены, специфические для донора. Смесь частиц содержит также контрольные частицы, определяющие уровень фонового сигнала, для подтверждения нормальной работы тест-системы. Таким образом, способ определения донор-специфических антител с помощью хМАР-технологии обладает высокой чувствительностью, что позволяет выявить низкие уровни антител, и высокой специфичностью, что минимизирует количество ложноположительных результатов.

Прототип. Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является постановка cross-match реакции (перекрестная проба) перед трансплантацией органа, для определения предсуществующих донор-специфических антител у реципиента [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Основным биологическим материалом для проведения реакции является периферическая венозная кровь реципиента и донора. Кровь донора используется для получения лимфоцитов, поэтому она должна быть жидкой. Для предотвращения свертывания, как правило, используют динатриевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТАNa2). Следует учитывать, что ЭДТА связывает ионы Са2+, что влияет на активность комплемента и тем самым может затруднить серологическое исследование. Выделяют лимфоциты из крови с помощью центрифугирования на градиенте плотности. При трансплантации трупного органа альтернативным источником лимфоцитов служит селезенка донора. В этом случае в чашку Петри помещают фрагмент селезенки донора (1-2 см3). Добавляют в чашку изотонический раствор и тщательно, до состояния кашицы измельчают фрагмент селезенки ножницами. Добавляют еще 5-7 мл изотонического раствора и хорошо размешивают измельченную ткань селезенки. Отбирают пипеткой жидкую часть клеточной взвеси и далее выделяют лимфоциты на градиенте плотности. После выделения клеток проводят оценку их жизнеспособности. Для оценки жизнеспособности лимфоцитов используют метод прижизненной окраски трипановым синим. Минимальный допустимый уровень жизнеспособности лимфоцитов при серологических исследованиях составляет 80%. Далее проводят комплемент-зависимую цитотоксическую реакцию (лимфоцитотоксический тест). Для этого в сыворотку реципиента вносят лимфоциты донора и инкубируют в течение 30 минут при +37°С. Затем добавляют кроличий комплемент и инкубируют еще 60 минут при +37°С. Вносят краску (5% водный раствор эозина) и после инкубации в течение 5 минут добавляют 20% раствор формалина. Через 15-20 минут оценивают результат реакции под микроскопом (по количеству живых и мертвых лимфоцитов). Результат исследования выражали в баллах в зависимости от относительного содержания погибших клеток. Так, при 0-20% погибших клеток результат считают отрицательным, 20-30% - слабоположительным (сомнительным), 31-41% - положительным, 41-80 - выраженно положительным, 81-100% - сильно выраженным положительным.

Самым существенным недостатком метода является невозможность исследования образования de novo донор-специфических антител у реципиента органов в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа ввиду отсутствия лимфоцитов донора, необходимых для постановки реакции. Наиболее доступным для исследования видом ткани донора служит периферическая кровь. В то же время в периферической крови преобладают Т-лимфоциты (60-70%), несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса. Содержание В-лимфоцитов, главный источник человеческих лейкоцитарных антигенов II класса, малочисленно (10-15%). Так как при оценке результатов лимфоцитотоксического теста гибель 0-20% клеток рассматривается как отрицательный результат, низкое содержание В-лимфоцитов может стать причиной неправильной трактовки результатов. Также существенно затрудняет чтение реакции «фоновая» гибель клеток более 10%.

Таким образом, существует необходимость разработки высококачественного диагностикума для определения у реципиента образования de novo донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. Обоснованным является использование лимфоцитов селезенки длительных сроков хранения. С этой целью предложено вместе с трансплантируемыми органами у донора осуществить забор селезенки или ее фрагмента, получить суспензию Т- и В-лимфоцитов селезенки, оценить популяционный состав и жизнеспособность лимфоцитов, затем после добавления криопротекторов сохранить жизнеспособные клетки в условиях сверхнизких температур. Диагностикум позволит в течение длительного времени (год и более) контролировать наличие донор-специфических антител у реципиента после аллотрансплантации.

Достигаемым техническим результатом является получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии.

I. Получение лимфоцитов селезенки

1. Заготовка ткани селезенки осуществляется на основании приказа Минздравсоцразвития России и РАМН от 25.05.2007 № 357/40 «Об утверждении Перечня органов и (или) тканей человека - объектов трансплантации, Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих трансплантацию органов и (или) тканей человека, и Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих забор и заготовку органов и (или) тканей человека». Хирург, после заготовки трансплантируемых органов, через выполненный ранее доступ в брюшную полость, с сохранением стерильности операционного поля, мануально выделяет селезенку. С целью предотвращения кровотечения на сосудистую ножку органа накладывается лигатура. Режущим хирургическим инструментарием отсекается один из полюсов селезенки. Отсеченный фрагмент помещается в стерильный транспортный контейнер, содержащий 200 мл охлажденного до +4°С раствора 0,9% раствором NaCl. Контейнер герметично закрывают. Транспортировка биоматериала осуществляется в условиях, поддерживающих температуру ткани +4°С. В случае невозможности заготовки ткани селезенки, без повреждения донорского органа при операции забора, биоматериал заготавливается при последующей обработке органа. Хирургом, подготавливающим орган к имплантации, в соответствии с интраоперационной ситуацией, острым методом выделяется фрагмент селезенки объемом не менее ¼ органа. Упаковка и транспортировка ткани селезенки выполняются по описанной ранее методике. Передача биоматериала в медицинское учреждение оформляется стандартным актом, в котором указывается: дата, ФИО донора, № истории болезни, тип тканей, учреждения передавшее и принявшее биоматериал, лица передавшее и принявшие биоматериал. Операция заготовки ткани селезенки занимает 15-20 минут, однако в зависимости от объема операции органного донорства длительность нахождения лимфоцитов в условиях гипоксии на этапах заготовки ткани селезенки и ее транспортировки в лабораторию может составлять от 6 до 12 часов.

2. Выделение популяций лимфоцитов. При поступлении в лабораторию в асептических условиях в стерильном лотке хирургическими ножницами селезенку нарезают фрагментами объемом до 0,5 см3. 3-4 фрагмента селезенки помещают в стерильную пробирку и измельчают в гомогенизаторе вместе с раствором Хенкса, получают взвесь лимфоцитов. В пробирки, содержащие 1 мл раствора «Лимфолит» плотностью 1,077, наслаивают по 2 мл суспензии лимфоцитов и центрифугируют 20 минут при 1000-1500 rpm. Интерфазу, кольцо лимфоцитов на градиенте плотности, аккуратно отбирают пипеткой. Полученную клеточную суспензию дважды отмывают раствором Хенкса путем центрифугирования в течение 5 минут при 1000-1500 rpm. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 1 мл раствора Хенкса. 100 мкл клеточной суспензии отбирают для оценки количества, фенотипа и жизнеспособности лимфоцитов.

3. Оценка качества лимфоцитов. Оценку качества лимфоцитов селезенки проводят с помощью проточной цитометрии. В цитометрические пробирки к 100 мкл суспензии лимфоцитов добавляют 20 мкл моноклональных антител CD3-FITC/CD19-PE и 20 мкл витального красителя 7 амино-актиномицина D (7AAD) и инкубируют в течение 20 минут. После чего в пробирки вносят 1 мл фосфатного буфера (PBS) и анализируют на проточном цитометре. В норме в селезенке преобладают CD 19 позитивные клетки (В-лимфоциты), содержание которых составляет 40-50%, концентрация CD3 + клеток (Т-лимфоциты) варьирует от 25 до 35% [Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.].

Обследовано 15 взвесей лимфоцитов селезенки доноров органов, подготовленных к криохранению. Выявленное содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 27,2% до 33,5%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,2% до 53,3%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 91,2-97,8%.

Значительное влияние на качество лимфоцитов оказывает длительность нахождения клеток в условиях гипоксии. Обследованы образцы лимфоцитов селезенки от 5 доноров, хранившиеся в условиях гипоксии при +4°С до 72 часов. Методом проточной цитометрии определяли общее количество лимфоцитов и долю клеток включавших витальный краситель 7AAD. Каждый образец обследовали через 12, 24, 36, 48 и 72 часа хранения. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью витального ДНК-специфичного красителя 7AAD на проточном цитометре. Выявлено, что содержание жизнеспособных клеток через 12 и 24 часа хранения составляет от 93 до 97%, через 36 часов варьирует от 89 до 94%, через 48 часов - от 85 до 92% и через 72 часа - от 76 до 82%. Таким образом, для получения качественного диагностикума на основе лимфоцитов селезенки человека продолжительность этапов должна быть максимально короткой. Время от момента прекращения перфузии тканей донора до криоконсервирования клеток не должно превышать 48 часов.

II. Криоконсервирование клеток

1. Приготовление раствора криопротектора. В каждую пробирку для криоконсервирования вносят 180 мкл 99% DMSO, 250 мкл раствора Хенкса, 920 мкл фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Пробирки помещают в холодильник на +4°С.

2. Расчет необходимого числа пробирок для хранения. Рассчитывают количество образцов для криоконсервирования по формуле:

Х=n·4+2, где

Х - количество образцов для криоконсервирования, n - количество реципиентов, кому были выполнена операция трансплантации органа/ов от данного донора. Например: у донора С. изъяты печень, легкие, почка и поджелудочная железа. Органы трансплантированы следующим образом: реципиенту № 1 поджелудочная железа + почка, реципиенту № 2 - печень, реципиенту № 3 - легкие. Количество образцов необходимое для криоконсервирования составляет: Х=3·4+2=14. Таким образом, должно быть подготовлено к криохранению 14 пробирок с лимфоцитами селезенки донора.

3. Внесение лимфоцитов в среду для хранения. В охлажденные пробирки для криоконсервирования с подготовленным и охлажденным раствором криопротектора пипеткой вносят по 1,5 млн лимфоцитов в 450 мкл раствора Хенкса. Пробирки для криоконсервирования плотно закрывают крышками и перемешивают содержимое с помощью вихревого смешивателя типа Vortex. Затем пробирки помещают в холодовой штатив и в течение 5-7 минут переносят в программный замораживатель.

4. Помещение на хранение. Пробирки с клеточным материалом, подготовленные для криоконсервирования, помещают в камеру программного замораживателя, предварительно охлажденную до +4°С. Криоконсервирование проходит по следующей программе:

Стартовая температура: +4°С

Этап № 1: охлаждение 1°С/мин до -70°С

Этап № 2: охлаждение 70°С/мин до -196°С

Затем образцы лимфоцитов донора переносят в отдельно выделенное хранилище криобанка и хранят при температуре -196°С в течение 5 лет и более.

III. Размораживание лимфоцитов донора

При необходимости из хранилища достают одну пробирку с лимфоцитами селезенки донора и помещают в водяную баню при температуре 37°С до полного исчезновения кристалликов льда. Затем пробирки с взвесью лимфоцитов центрифугируют 1000-1500 rpm в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 0,5 мл раствора Хенкса. После чего возможно тестирование сыворотки реципинта на наличие донор-специфических антител, которое может проводится двумя способами: серологическим (лимфоцитотоксический тест) или с применением набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. По истечению общего срока хранения, при отсутствии необходимости дальнейшего хранения биоматериала, невостребованные образцы изымаются из криохранилища и утилизируются.

IV. Контроль качества диагностикума

Обследовано 12 образцов лимфоцитов селезенки доноров органов, после криохранения. Выявлено, содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 25,7% до 31,4%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,7% до 52,8%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 87,9-91,7%. Таким образом, предложенная методика получения и хранения лимфоцитов доноров органов позволяет получить высококачественный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. В дальнейшем определение антител проводят по любой из существующих методик.

Для оценки эффективности полученных по предлагаемой методике клеток селезенки доноров органов для определения донор-специфических антител у реципиентов проведено исследование 18 образцов дигностикумов, хранившихся от 3 суток до 1 года. Определение антител проводили серологическим методом и с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. В таблице 1 представлены результаты определения антител у реципиентов органов, с использованием диагностикумов. При этом методом на платформе Luminex донор-специфические антитела выявлены у 5 реципиентов, течение посттрансплантационного периода которых осложнилось развитием реакции отторжения. Серологическим методом антитела выявлены только у одного реципиента. Таким образом, для определения DSA в посттрансплантационном периоде мы рекомендуем использовать методы, основанные на использовании х-МАР технологии на платформе Luminex.

Таблица 1
Определение донор-специфических антител у реципиентов органов с использованием диагностикумов
Метод исследованияОбследовано образцов клетокОтсутствие донор-специфических антителНаличие донор-специфических антител
Серологический (лимфоцитотоксический тест)1817 1
Метод по технологии хМАР на платформе Luminex18 135

Разработанный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA использовался в клинической практике у пациентки в течение 6 месяцев после трансплантации легких. Результаты проведенного обследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Мониторинг донор-специфических антител (ДСА) у реципиента М. после трансплантации легкого в течение 6 месяцев
Сутки после трансплантации ДСА к I классуДСА к II классу
7 суткиотрицательный отрицательный
9 суткиотрицательный положительный
15 сутки отрицательныйположительный
124 суткиотрицательный слабо положительный
165 суткиотрицательный отрицательный

Как видно из таблицы, у пациентки на 9 сутки посттрансплантационного периода выявили донор-специфические антитела ко второму классу HLA, которые сохранялись в течение трех месяцев на фоне проведения иммуносупрессивной терапии. Через шесть месяцев донор-специфические антитела в сыворотке пациентки не выявлены.

Таким образом, разработан диагностикум, содержащий выделенные из селезенки донора Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа.

Разработанный диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включает следующие приемы. Во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9% раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 часов.

Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включает следующие приемы. Для прогнозирования используют разработанный диагностикум, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов - не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

Для лучшего понимания сущности предложения приведем примеры.

Пример 1. Больной Г., 47 лет. Диагноз: хронический гломерунефрит, терминальная стадия хронической почечной недостаточности. 21.10.2011 произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А, В, В, Dr, совместимость по Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. Одновременно с изъятием донорской почки заготовлен фрагмент селезенки и по предлагаемой методике подготовлен диагностикум для определения донор-специфических антител. На 4 сутки у реципиента появились клинические признаки острого криза отторжения. Решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Проведено исследование сыворотки реципиента с криоконсервированными лимфоцитами селезенки донора (диагностикум). В сыворотке реципиента выявлено наличие донор-специфических антител к I и II классам HLA как серологическим методом, так и на платформе Luminex. Поставлен диагноз: острый гуморальный криз отторжения. Диагноз был подтвержден морфологически.

Пример 2. Больной К. 24 года. Диагноз: хроническая почечная недостаточность. 3.01.2012 года произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А В, Dr, совместимость по В, Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. В посттрансплантационном периоде отмечены: отсроченная функция трансплантата и замедленное восстановление азотовыделительной функции. На 17 сутки решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Исследование сыворотки реципиента проведено с подготовленным по предлагаемой методике диагностикумом. В сыворотке реципиента серологическим методом донор-специфических антител не выявлено, с помощью набора LIFECODES на платформе Luminex определены донор-специфические антитела к I классу HLA. Поставлен диагноз гуморальная реакция отторжения. После проведенной иммуносупрессивной терапии восстановилась функция трансплантата. При контрольном исследовании DSA на 30 сутки в сыворотке реципиента донор-специфических антител не выявлено.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Диагностикум, содержащий лимфоциты человека для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационном периоде, характеризующийся тем, что диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса, - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

2. Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включающий получение лимфоцитов донора, характеризующийся тем, что во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9%-ный раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 ч.

3. Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включающий реакцию на определение донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, характеризующийся тем, что используют диагностикум по п.1, полученный способом по п.2, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что определение донор-специфических антител проводят с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex.

www.freepatent.ru

Диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения

Группа изобретений относится к медицине и касается диагностикума, содержащего лимфоциты человека для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационном периоде, характеризующегося тем, что диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора; способа получения диагностикума; способа прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включающего реакцию на определение донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, характеризующегося тем, что используют указанный диагностикум. Изобретение обеспечивает получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, трансплантологии и хирургии, и может быть использовано для проведения мониторинга донор-специфических антител к системе HLA после аллотрансплантации органа в течение пяти лет и более.

Трансплантация органов, тканей и клеток - это замена больному путем хирургической операции пораженного, изношенного органа, части его или ткани, полностью утративших способность выполнять свои функции. Согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (в редакции от 20.06.2000 №91-ФЗ, от 16.10.2006 №160-ФЗ) является средством спасения жизни и восстановления здоровья граждан. Одной из главных причин потери трансплантата является реакция отторжения донорского органа. Различают сверхострую, острую и хроническую реакции отторжения. Сверхострая реакция отторжения протекает бурно с первых минут или часов после пересадки органа. Острая реакция отторжения развивается в период с 4 до 90 дня после операции. Хроническая реакция отторжения диагностируется через несколько недель, месяцев и лет после операции, может несколько раз рецидивировать после подавления ее иммуносупрессивной терапией. Реакция отторжения трансплантата обусловлена клеточными и/или гуморальными иммунными механизмами. В ответ на чужеродные человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) в организме реципиента вырабатываются донор-специфические антитела (ДСА).

Для диагностики реакции отторжения производят биопсию трансплантата [Cornell LD, Smith RN, Colvin RB. Kidney transplantation: mechanisms of rejection and acceptance. Annu Rev Pathol 2008; 3:189-220; Tomasoni S, Remuzzi G, Benigni A. Allograft rejection: acute and chronic studies. Contrib Nephrol 2008; 159:122-34], по результатам которой может отмечаться смешанная гистологическая картина. Для интерпретации результатов биопсии используются универсальные, регулярно обновляемые критерии Банфф (Banff) [Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff '05 Meeting Report: differential diagnosis of chronic allograft injury and elimination of chronic allograft nephropathy ('CAN') Am J Transplant 2007; 7(3):518-26;. Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions. Am J Transplant 2008; 8(4):753-60], на основании которых делается заключение о прогнозе и назначается лечение [Mengel M, Sis В, Halloran PF. SWOT analysis of Banff: strengths, weaknesses, opportunities and threatsof the international Banff consensus process and classification system for renal allograft pathology. Am J Transplant 2007; 7(10):2221-6]. В настоящее время маркером хронической посттрансплантационной нефропатии, опосредованной антителами, считают обнаружение методом иммунофлуоресцентной микроскопии C4d-фрагмента на поверхности эндотелия перитубулярных капилляров. Выявлена корреляция между отложением C4d и наличием в сыворотке реципиента донор-специфических антител.

Для исследования специфических антител используется ДИАГНОСТИКУМ - стандартный препарат, используемый в качестве антигена при серологических исследованиях. В настоящее время определение донор-специфических антител (ДСА) в посттрансплантационном периоде является важным диагностическим критерием реакции отторжения трансплантата. ДСА de novo могут образовываться как в ранние сроки на 3-21 сутки после трансплантации, так и через несколько лет после пересадки органа. Мониторинг донор-специфических антител у реципиента можно осуществлять в течение длительного времени после трансплантации только в том случае, если донор живой, то есть при родственной трансплантации. Исследование образования de novo донор-специфических антител у реципиента в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа не представляется возможным ввиду отсутствия донорских лимфоцитов. Особая трудность отмечается при мультиорганном заборе, когда от одного донора трансплантируют органы нескольким реципиентам и требуется большое количество донорских клеток. Таким образом, для проведения определения донор-специфических антител требуется большое количество стандартизованного антигенного материала донора. С этой целью используют два вида клеток: лимфоциты периферической крови и лимфоциты селезенки донора.

В настоящее время существуют несколько методов определения донор-специфических антител в сыворотке реципиента.

Серологический метод. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови, реже селезенки клетки или лимфоузла. В основе метода лежит комплементзависимый микролимфоцитотоксический тест (cross-match реакция) [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Этот тест базируется на способности антител к главному комплексу гистосовместимости в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты.

Цитометрический метод. Использование этого метода позволяет выявить очень низкие концентрации антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови. Сывороточные антитела реципиента связываются с антигенами HLA на поверхности лимфоцитов донора. После этого добавляются антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуоресцентной меткой. Дополнительное добавление моноклональных антител к CD3 и CD19 позволяют дифференцировать антитела к I классу (на CD3 + лимфоцитах, Т-клетки) и ко II классу (на CD19 + лимфоцитах, В-клетки) HLA [Robson A., Martin S.Т and В cell. crossmatching using three-colour flow cytometry // Transplant Immunology. - 1996. - V. 4. - 3. - P. 203-208]. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако, помимо антител к антигенам HLA, выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантитела. Обусловленная этими факторами низкая специфичность метода приводит к получению ложноположительных результатов.

Метод на основе хМАР-технологии. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови крови. Определение донор-специфических антител проводят по технологии хМАР на платформе Luminex с помощью наборов LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) фирмы Invitrogen (США) [Detection of donor-specific antibodies using HLA-coated microspheres: another tool for kidney transplant risk stratification / E.M.Gibney, L.R.Cagle, B.Freed, S.E.Wamell, L.Chan, A.C.Wiseman // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2006. - V. 21. - Is. 9. - P.2625-2629]. Набор содержит смесь Luminex частиц. Одни частицы в смеси коньюгированы с моноклональными AT к I классу HLA, другие - к II классу HLA. Донорские лимфоциты лизируют, затем лизат смешивают с этими двумя категориями частиц. При инкубировании частицы связываются с растворенными донорскими молекулами HLA, образуя человеческие лейкоцитарные антигены, специфические для донора. Смесь частиц содержит также контрольные частицы, определяющие уровень фонового сигнала, для подтверждения нормальной работы тест-системы. Таким образом, способ определения донор-специфических антител с помощью хМАР-технологии обладает высокой чувствительностью, что позволяет выявить низкие уровни антител, и высокой специфичностью, что минимизирует количество ложноположительных результатов.

Прототип. Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является постановка cross-match реакции (перекрестная проба) перед трансплантацией органа, для определения предсуществующих донор-специфических антител у реципиента [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Основным биологическим материалом для проведения реакции является периферическая венозная кровь реципиента и донора. Кровь донора используется для получения лимфоцитов, поэтому она должна быть жидкой. Для предотвращения свертывания, как правило, используют динатриевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТАNa2). Следует учитывать, что ЭДТА связывает ионы Са2+, что влияет на активность комплемента и тем самым может затруднить серологическое исследование. Выделяют лимфоциты из крови с помощью центрифугирования на градиенте плотности. При трансплантации трупного органа альтернативным источником лимфоцитов служит селезенка донора. В этом случае в чашку Петри помещают фрагмент селезенки донора (1-2 см3). Добавляют в чашку изотонический раствор и тщательно, до состояния кашицы измельчают фрагмент селезенки ножницами. Добавляют еще 5-7 мл изотонического раствора и хорошо размешивают измельченную ткань селезенки. Отбирают пипеткой жидкую часть клеточной взвеси и далее выделяют лимфоциты на градиенте плотности. После выделения клеток проводят оценку их жизнеспособности. Для оценки жизнеспособности лимфоцитов используют метод прижизненной окраски трипановым синим. Минимальный допустимый уровень жизнеспособности лимфоцитов при серологических исследованиях составляет 80%. Далее проводят комплемент-зависимую цитотоксическую реакцию (лимфоцитотоксический тест). Для этого в сыворотку реципиента вносят лимфоциты донора и инкубируют в течение 30 минут при +37°С. Затем добавляют кроличий комплемент и инкубируют еще 60 минут при +37°С. Вносят краску (5% водный раствор эозина) и после инкубации в течение 5 минут добавляют 20% раствор формалина. Через 15-20 минут оценивают результат реакции под микроскопом (по количеству живых и мертвых лимфоцитов). Результат исследования выражали в баллах в зависимости от относительного содержания погибших клеток. Так, при 0-20% погибших клеток результат считают отрицательным, 20-30% - слабоположительным (сомнительным), 31-41% - положительным, 41-80 - выраженно положительным, 81-100% - сильно выраженным положительным.

Самым существенным недостатком метода является невозможность исследования образования de novo донор-специфических антител у реципиента органов в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа ввиду отсутствия лимфоцитов донора, необходимых для постановки реакции. Наиболее доступным для исследования видом ткани донора служит периферическая кровь. В то же время в периферической крови преобладают Т-лимфоциты (60-70%), несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса. Содержание В-лимфоцитов, главный источник человеческих лейкоцитарных антигенов II класса, малочисленно (10-15%). Так как при оценке результатов лимфоцитотоксического теста гибель 0-20% клеток рассматривается как отрицательный результат, низкое содержание В-лимфоцитов может стать причиной неправильной трактовки результатов. Также существенно затрудняет чтение реакции «фоновая» гибель клеток более 10%.

Таким образом, существует необходимость разработки высококачественного диагностикума для определения у реципиента образования de novo донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. Обоснованным является использование лимфоцитов селезенки длительных сроков хранения. С этой целью предложено вместе с трансплантируемыми органами у донора осуществить забор селезенки или ее фрагмента, получить суспензию Т- и В-лимфоцитов селезенки, оценить популяционный состав и жизнеспособность лимфоцитов, затем после добавления криопротекторов сохранить жизнеспособные клетки в условиях сверхнизких температур. Диагностикум позволит в течение длительного времени (год и более) контролировать наличие донор-специфических антител у реципиента после аллотрансплантации.

Достигаемым техническим результатом является получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии.

I. Получение лимфоцитов селезенки

1. Заготовка ткани селезенки осуществляется на основании приказа Минздравсоцразвития России и РАМН от 25.05.2007 №357/40 «Об утверждении Перечня органов и (или) тканей человека - объектов трансплантации, Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих трансплантацию органов и (или) тканей человека, и Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих забор и заготовку органов и (или) тканей человека». Хирург, после заготовки трансплантируемых органов, через выполненный ранее доступ в брюшную полость, с сохранением стерильности операционного поля, мануально выделяет селезенку. С целью предотвращения кровотечения на сосудистую ножку органа накладывается лигатура. Режущим хирургическим инструментарием отсекается один из полюсов селезенки. Отсеченный фрагмент помещается в стерильный транспортный контейнер, содержащий 200 мл охлажденного до +4°С раствора 0,9% раствором NaCl. Контейнер герметично закрывают. Транспортировка биоматериала осуществляется в условиях, поддерживающих температуру ткани +4°С. В случае невозможности заготовки ткани селезенки, без повреждения донорского органа при операции забора, биоматериал заготавливается при последующей обработке органа. Хирургом, подготавливающим орган к имплантации, в соответствии с интраоперационной ситуацией, острым методом выделяется фрагмент селезенки объемом не менее ¼ органа. Упаковка и транспортировка ткани селезенки выполняются по описанной ранее методике. Передача биоматериала в медицинское учреждение оформляется стандартным актом, в котором указывается: дата, ФИО донора, № истории болезни, тип тканей, учреждения передавшее и принявшее биоматериал, лица передавшее и принявшие биоматериал. Операция заготовки ткани селезенки занимает 15-20 минут, однако в зависимости от объема операции органного донорства длительность нахождения лимфоцитов в условиях гипоксии на этапах заготовки ткани селезенки и ее транспортировки в лабораторию может составлять от 6 до 12 часов.

2. Выделение популяций лимфоцитов. При поступлении в лабораторию в асептических условиях в стерильном лотке хирургическими ножницами селезенку нарезают фрагментами объемом до 0,5 см3. 3-4 фрагмента селезенки помещают в стерильную пробирку и измельчают в гомогенизаторе вместе с раствором Хенкса, получают взвесь лимфоцитов. В пробирки, содержащие 1 мл раствора «Лимфолит» плотностью 1,077, наслаивают по 2 мл суспензии лимфоцитов и центрифугируют 20 минут при 1000-1500 rpm. Интерфазу, кольцо лимфоцитов на градиенте плотности, аккуратно отбирают пипеткой. Полученную клеточную суспензию дважды отмывают раствором Хенкса путем центрифугирования в течение 5 минут при 1000-1500 rpm. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 1 мл раствора Хенкса. 100 мкл клеточной суспензии отбирают для оценки количества, фенотипа и жизнеспособности лимфоцитов.

3. Оценка качества лимфоцитов. Оценку качества лимфоцитов селезенки проводят с помощью проточной цитометрии. В цитометрические пробирки к 100 мкл суспензии лимфоцитов добавляют 20 мкл моноклональных антител CD3-FITC/CD19-PE и 20 мкл витального красителя 7 амино-актиномицина D (7AAD) и инкубируют в течение 20 минут. После чего в пробирки вносят 1 мл фосфатного буфера (PBS) и анализируют на проточном цитометре. В норме в селезенке преобладают CD 19 позитивные клетки (В-лимфоциты), содержание которых составляет 40-50%, концентрация CD3 + клеток (Т-лимфоциты) варьирует от 25 до 35% [Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.].

Обследовано 15 взвесей лимфоцитов селезенки доноров органов, подготовленных к криохранению. Выявленное содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 27,2% до 33,5%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,2% до 53,3%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 91,2-97,8%.

Значительное влияние на качество лимфоцитов оказывает длительность нахождения клеток в условиях гипоксии. Обследованы образцы лимфоцитов селезенки от 5 доноров, хранившиеся в условиях гипоксии при +4°С до 72 часов. Методом проточной цитометрии определяли общее количество лимфоцитов и долю клеток включавших витальный краситель 7AAD. Каждый образец обследовали через 12, 24, 36, 48 и 72 часа хранения. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью витального ДНК-специфичного красителя 7AAD на проточном цитометре. Выявлено, что содержание жизнеспособных клеток через 12 и 24 часа хранения составляет от 93 до 97%, через 36 часов варьирует от 89 до 94%, через 48 часов - от 85 до 92% и через 72 часа - от 76 до 82%. Таким образом, для получения качественного диагностикума на основе лимфоцитов селезенки человека продолжительность этапов должна быть максимально короткой. Время от момента прекращения перфузии тканей донора до криоконсервирования клеток не должно превышать 48 часов.

II. Криоконсервирование клеток

1. Приготовление раствора криопротектора. В каждую пробирку для криоконсервирования вносят 180 мкл 99% DMSO, 250 мкл раствора Хенкса, 920 мкл фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Пробирки помещают в холодильник на +4°С.

2. Расчет необходимого числа пробирок для хранения. Рассчитывают количество образцов для криоконсервирования по формуле:

Х=n·4+2, где

Х - количество образцов для криоконсервирования, n - количество реципиентов, кому были выполнена операция трансплантации органа/ов от данного донора. Например: у донора С. изъяты печень, легкие, почка и поджелудочная железа. Органы трансплантированы следующим образом: реципиенту №1 поджелудочная железа + почка, реципиенту №2 - печень, реципиенту №3 - легкие. Количество образцов необходимое для криоконсервирования составляет: Х=3·4+2=14. Таким образом, должно быть подготовлено к криохранению 14 пробирок с лимфоцитами селезенки донора.

3. Внесение лимфоцитов в среду для хранения. В охлажденные пробирки для криоконсервирования с подготовленным и охлажденным раствором криопротектора пипеткой вносят по 1,5 млн лимфоцитов в 450 мкл раствора Хенкса. Пробирки для криоконсервирования плотно закрывают крышками и перемешивают содержимое с помощью вихревого смешивателя типа Vortex. Затем пробирки помещают в холодовой штатив и в течение 5-7 минут переносят в программный замораживатель.

4. Помещение на хранение. Пробирки с клеточным материалом, подготовленные для криоконсервирования, помещают в камеру программного замораживателя, предварительно охлажденную до +4°С. Криоконсервирование проходит по следующей программе:

Стартовая температура: +4°С

Этап №1: охлаждение 1°С/мин до -70°С

Этап №2: охлаждение 70°С/мин до -196°С

Затем образцы лимфоцитов донора переносят в отдельно выделенное хранилище криобанка и хранят при температуре -196°С в течение 5 лет и более.

III. Размораживание лимфоцитов донора

При необходимости из хранилища достают одну пробирку с лимфоцитами селезенки донора и помещают в водяную баню при температуре 37°С до полного исчезновения кристалликов льда. Затем пробирки с взвесью лимфоцитов центрифугируют 1000-1500 rpm в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 0,5 мл раствора Хенкса. После чего возможно тестирование сыворотки реципинта на наличие донор-специфических антител, которое может проводится двумя способами: серологическим (лимфоцитотоксический тест) или с применением набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. По истечению общего срока хранения, при отсутствии необходимости дальнейшего хранения биоматериала, невостребованные образцы изымаются из криохранилища и утилизируются.

IV. Контроль качества диагностикума

Обследовано 12 образцов лимфоцитов селезенки доноров органов, после криохранения. Выявлено, содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 25,7% до 31,4%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,7% до 52,8%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 87,9-91,7%. Таким образом, предложенная методика получения и хранения лимфоцитов доноров органов позволяет получить высококачественный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. В дальнейшем определение антител проводят по любой из существующих методик.

Для оценки эффективности полученных по предлагаемой методике клеток селезенки доноров органов для определения донор-специфических антител у реципиентов проведено исследование 18 образцов дигностикумов, хранившихся от 3 суток до 1 года. Определение антител проводили серологическим методом и с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. В таблице 1 представлены результаты определения антител у реципиентов органов, с использованием диагностикумов. При этом методом на платформе Luminex донор-специфические антитела выявлены у 5 реципиентов, течение посттрансплантационного периода которых осложнилось развитием реакции отторжения. Серологическим методом антитела выявлены только у одного реципиента. Таким образом, для определения DSA в посттрансплантационном периоде мы рекомендуем использовать методы, основанные на использовании х-МАР технологии на платформе Luminex.

Таблица 1
Определение донор-специфических антител у реципиентов органов с использованием диагностикумов
Метод исследования Обследовано образцов клеток Отсутствие донор-специфических антител Наличие донор-специфических антител
Серологический (лимфоцитотоксический тест) 18 17 1
Метод по технологии хМАР на платформе Luminex 18 13 5

Разработанный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA использовался в клинической практике у пациентки в течение 6 месяцев после трансплантации легких. Результаты проведенного обследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Мониторинг донор-специфических антител (ДСА) у реципиента М. после трансплантации легкого в течение 6 месяцев
Сутки после трансплантации ДСА к I классу ДСА к II классу
7 сутки отрицательный отрицательный
9 сутки отрицательный положительный
15 сутки отрицательный положительный
124 сутки отрицательный слабо положительный
165 сутки отрицательный отрицательный

Как видно из таблицы, у пациентки на 9 сутки посттрансплантационного периода выявили донор-специфические антитела ко второму классу HLA, которые сохранялись в течение трех месяцев на фоне проведения иммуносупрессивной терапии. Через шесть месяцев донор-специфические антитела в сыворотке пациентки не выявлены.

Таким образом, разработан диагностикум, содержащий выделенные из селезенки донора Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа.

Разработанный диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включает следующие приемы. Во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9% раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 часов.

Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включает следующие приемы. Для прогнозирования используют разработанный диагностикум, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов - не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

Для лучшего понимания сущности предложения приведем примеры.

Пример 1. Больной Г., 47 лет. Диагноз: хронический гломерунефрит, терминальная стадия хронической почечной недостаточности. 21.10.2011 произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А, В, В, Dr, совместимость по Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. Одновременно с изъятием донорской почки заготовлен фрагмент селезенки и по предлагаемой методике подготовлен диагностикум для определения донор-специфических антител. На 4 сутки у реципиента появились клинические признаки острого криза отторжения. Решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Проведено исследование сыворотки реципиента с криоконсервированными лимфоцитами селезенки донора (диагностикум). В сыворотке реципиента выявлено наличие донор-специфических антител к I и II классам HLA как серологическим методом, так и на платформе Luminex. Поставлен диагноз: острый гуморальный криз отторжения. Диагноз был подтвержден морфологически.

Пример 2. Больной К. 24 года. Диагноз: хроническая почечная недостаточность. 3.01.2012 года произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А В, Dr, совместимость по В, Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. В посттрансплантационном периоде отмечены: отсроченная функция трансплантата и замедленное восстановление азотовыделительной функции. На 17 сутки решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Исследование сыворотки реципиента проведено с подготовленным по предлагаемой методике диагностикумом. В сыворотке реципиента серологическим методом донор-специфических антител не выявлено, с помощью набора LIFECODES на платформе Luminex определены донор-специфические антитела к I классу HLA. Поставлен диагноз гуморальная реакция отторжения. После проведенной иммуносупрессивной терапии восстановилась функция трансплантата. При контрольном исследовании DSA на 30 сутки в сыворотке реципиента донор-специфических антител не выявлено.

1. Диагностикум, содержащий лимфоциты человека для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационном периоде, характеризующийся тем, что диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса, - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

2. Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включающий получение лимфоцитов донора, характеризующийся тем, что во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9%-ный раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 ч.

3. Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включающий реакцию на определение донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, характеризующийся тем, что используют диагностикум по п.1, полученный способом по п.2, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что определение донор-специфических антител проводят с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex.

www.findpatent.ru

ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОНОР-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ГЛАВНОМУ КОМПЛЕКСУ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, трансплантологии и хирургии, и может быть использовано для проведения мониторинга донор-специфических антител к системе HLA после аллотрансплантации органа в течение пяти лет и более.

Трансплантация органов, тканей и клеток - это замена больному путем хирургической операции пораженного, изношенного органа, части его или ткани, полностью утративших способность выполнять свои функции. Согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (в редакции от 20.06.2000 №91-ФЗ, от 16.10.2006 №160-ФЗ) является средством спасения жизни и восстановления здоровья граждан. Одной из главных причин потери трансплантата является реакция отторжения донорского органа. Различают сверхострую, острую и хроническую реакции отторжения. Сверхострая реакция отторжения протекает бурно с первых минут или часов после пересадки органа. Острая реакция отторжения развивается в период с 4 до 90 дня после операции. Хроническая реакция отторжения диагностируется через несколько недель, месяцев и лет после операции, может несколько раз рецидивировать после подавления ее иммуносупрессивной терапией. Реакция отторжения трансплантата обусловлена клеточными и/или гуморальными иммунными механизмами. В ответ на чужеродные человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) в организме реципиента вырабатываются донор-специфические антитела (ДСА).

Для диагностики реакции отторжения производят биопсию трансплантата [Cornell LD, Smith RN, Colvin RB. Kidney transplantation: mechanisms of rejection and acceptance. Annu Rev Pathol 2008; 3:189-220; Tomasoni S, Remuzzi G, Benigni A. Allograft rejection: acute and chronic studies. Contrib Nephrol 2008; 159:122-34], по результатам которой может отмечаться смешанная гистологическая картина. Для интерпретации результатов биопсии используются универсальные, регулярно обновляемые критерии Банфф (Banff) [Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff '05 Meeting Report: differential diagnosis of chronic allograft injury and elimination of chronic allograft nephropathy ('CAN') Am J Transplant 2007; 7(3):518-26;. Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions. Am J Transplant 2008; 8(4):753-60], на основании которых делается заключение о прогнозе и назначается лечение [Mengel M, Sis В, Halloran PF. SWOT analysis of Banff: strengths, weaknesses, opportunities and threatsof the international Banff consensus process and classification system for renal allograft pathology. Am J Transplant 2007; 7(10):2221-6]. В настоящее время маркером хронической посттрансплантационной нефропатии, опосредованной антителами, считают обнаружение методом иммунофлуоресцентной микроскопии C4d-фрагмента на поверхности эндотелия перитубулярных капилляров. Выявлена корреляция между отложением C4d и наличием в сыворотке реципиента донор-специфических антител.

Для исследования специфических антител используется ДИАГНОСТИКУМ - стандартный препарат, используемый в качестве антигена при серологических исследованиях. В настоящее время определение донор-специфических антител (ДСА) в посттрансплантационном периоде является важным диагностическим критерием реакции отторжения трансплантата. ДСА de novo могут образовываться как в ранние сроки на 3-21 сутки после трансплантации, так и через несколько лет после пересадки органа. Мониторинг донор-специфических антител у реципиента можно осуществлять в течение длительного времени после трансплантации только в том случае, если донор живой, то есть при родственной трансплантации. Исследование образования de novo донор-специфических антител у реципиента в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа не представляется возможным ввиду отсутствия донорских лимфоцитов. Особая трудность отмечается при мультиорганном заборе, когда от одного донора трансплантируют органы нескольким реципиентам и требуется большое количество донорских клеток. Таким образом, для проведения определения донор-специфических антител требуется большое количество стандартизованного антигенного материала донора. С этой целью используют два вида клеток: лимфоциты периферической крови и лимфоциты селезенки донора.

В настоящее время существуют несколько методов определения донор-специфических антител в сыворотке реципиента.

Серологический метод. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови, реже селезенки клетки или лимфоузла. В основе метода лежит комплементзависимый микролимфоцитотоксический тест (cross-match реакция) [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Этот тест базируется на способности антител к главному комплексу гистосовместимости в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты.

Цитометрический метод. Использование этого метода позволяет выявить очень низкие концентрации антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови. Сывороточные антитела реципиента связываются с антигенами HLA на поверхности лимфоцитов донора. После этого добавляются антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуоресцентной меткой. Дополнительное добавление моноклональных антител к CD3 и CD19 позволяют дифференцировать антитела к I классу (на CD3 + лимфоцитах, Т-клетки) и ко II классу (на CD19 + лимфоцитах, В-клетки) HLA [Robson A., Martin S.Т and В cell. crossmatching using three-colour flow cytometry // Transplant Immunology. - 1996. - V. 4. - 3. - P. 203-208]. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако, помимо антител к антигенам HLA, выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантитела. Обусловленная этими факторами низкая специфичность метода приводит к получению ложноположительных результатов.

Метод на основе хМАР-технологии. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови крови. Определение донор-специфических антител проводят по технологии хМАР на платформе Luminex с помощью наборов LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) фирмы Invitrogen (США) [Detection of donor-specific antibodies using HLA-coated microspheres: another tool for kidney transplant risk stratification / E.M.Gibney, L.R.Cagle, B.Freed, S.E.Wamell, L.Chan, A.C.Wiseman // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2006. - V. 21. - Is. 9. - P.2625-2629]. Набор содержит смесь Luminex частиц. Одни частицы в смеси коньюгированы с моноклональными AT к I классу HLA, другие - к II классу HLA. Донорские лимфоциты лизируют, затем лизат смешивают с этими двумя категориями частиц. При инкубировании частицы связываются с растворенными донорскими молекулами HLA, образуя человеческие лейкоцитарные антигены, специфические для донора. Смесь частиц содержит также контрольные частицы, определяющие уровень фонового сигнала, для подтверждения нормальной работы тест-системы. Таким образом, способ определения донор-специфических антител с помощью хМАР-технологии обладает высокой чувствительностью, что позволяет выявить низкие уровни антител, и высокой специфичностью, что минимизирует количество ложноположительных результатов.

Прототип. Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является постановка cross-match реакции (перекрестная проба) перед трансплантацией органа, для определения предсуществующих донор-специфических антител у реципиента [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Основным биологическим материалом для проведения реакции является периферическая венозная кровь реципиента и донора. Кровь донора используется для получения лимфоцитов, поэтому она должна быть жидкой. Для предотвращения свертывания, как правило, используют динатриевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТАNa2). Следует учитывать, что ЭДТА связывает ионы Са2+, что влияет на активность комплемента и тем самым может затруднить серологическое исследование. Выделяют лимфоциты из крови с помощью центрифугирования на градиенте плотности. При трансплантации трупного органа альтернативным источником лимфоцитов служит селезенка донора. В этом случае в чашку Петри помещают фрагмент селезенки донора (1-2 см3). Добавляют в чашку изотонический раствор и тщательно, до состояния кашицы измельчают фрагмент селезенки ножницами. Добавляют еще 5-7 мл изотонического раствора и хорошо размешивают измельченную ткань селезенки. Отбирают пипеткой жидкую часть клеточной взвеси и далее выделяют лимфоциты на градиенте плотности. После выделения клеток проводят оценку их жизнеспособности. Для оценки жизнеспособности лимфоцитов используют метод прижизненной окраски трипановым синим. Минимальный допустимый уровень жизнеспособности лимфоцитов при серологических исследованиях составляет 80%. Далее проводят комплемент-зависимую цитотоксическую реакцию (лимфоцитотоксический тест). Для этого в сыворотку реципиента вносят лимфоциты донора и инкубируют в течение 30 минут при +37°С. Затем добавляют кроличий комплемент и инкубируют еще 60 минут при +37°С. Вносят краску (5% водный раствор эозина) и после инкубации в течение 5 минут добавляют 20% раствор формалина. Через 15-20 минут оценивают результат реакции под микроскопом (по количеству живых и мертвых лимфоцитов). Результат исследования выражали в баллах в зависимости от относительного содержания погибших клеток. Так, при 0-20% погибших клеток результат считают отрицательным, 20-30% - слабоположительным (сомнительным), 31-41% - положительным, 41-80 - выраженно положительным, 81-100% - сильно выраженным положительным.

Самым существенным недостатком метода является невозможность исследования образования de novo донор-специфических антител у реципиента органов в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа ввиду отсутствия лимфоцитов донора, необходимых для постановки реакции. Наиболее доступным для исследования видом ткани донора служит периферическая кровь. В то же время в периферической крови преобладают Т-лимфоциты (60-70%), несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса. Содержание В-лимфоцитов, главный источник человеческих лейкоцитарных антигенов II класса, малочисленно (10-15%). Так как при оценке результатов лимфоцитотоксического теста гибель 0-20% клеток рассматривается как отрицательный результат, низкое содержание В-лимфоцитов может стать причиной неправильной трактовки результатов. Также существенно затрудняет чтение реакции «фоновая» гибель клеток более 10%.

Таким образом, существует необходимость разработки высококачественного диагностикума для определения у реципиента образования de novo донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. Обоснованным является использование лимфоцитов селезенки длительных сроков хранения. С этой целью предложено вместе с трансплантируемыми органами у донора осуществить забор селезенки или ее фрагмента, получить суспензию Т- и В-лимфоцитов селезенки, оценить популяционный состав и жизнеспособность лимфоцитов, затем после добавления криопротекторов сохранить жизнеспособные клетки в условиях сверхнизких температур. Диагностикум позволит в течение длительного времени (год и более) контролировать наличие донор-специфических антител у реципиента после аллотрансплантации.

Достигаемым техническим результатом является получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии.

I. Получение лимфоцитов селезенки

1. Заготовка ткани селезенки осуществляется на основании приказа Минздравсоцразвития России и РАМН от 25.05.2007 №357/40 «Об утверждении Перечня органов и (или) тканей человека - объектов трансплантации, Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих трансплантацию органов и (или) тканей человека, и Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих забор и заготовку органов и (или) тканей человека». Хирург, после заготовки трансплантируемых органов, через выполненный ранее доступ в брюшную полость, с сохранением стерильности операционного поля, мануально выделяет селезенку. С целью предотвращения кровотечения на сосудистую ножку органа накладывается лигатура. Режущим хирургическим инструментарием отсекается один из полюсов селезенки. Отсеченный фрагмент помещается в стерильный транспортный контейнер, содержащий 200 мл охлажденного до +4°С раствора 0,9% раствором NaCl. Контейнер герметично закрывают. Транспортировка биоматериала осуществляется в условиях, поддерживающих температуру ткани +4°С. В случае невозможности заготовки ткани селезенки, без повреждения донорского органа при операции забора, биоматериал заготавливается при последующей обработке органа. Хирургом, подготавливающим орган к имплантации, в соответствии с интраоперационной ситуацией, острым методом выделяется фрагмент селезенки объемом не менее ¼ органа. Упаковка и транспортировка ткани селезенки выполняются по описанной ранее методике. Передача биоматериала в медицинское учреждение оформляется стандартным актом, в котором указывается: дата, ФИО донора, № истории болезни, тип тканей, учреждения передавшее и принявшее биоматериал, лица передавшее и принявшие биоматериал. Операция заготовки ткани селезенки занимает 15-20 минут, однако в зависимости от объема операции органного донорства длительность нахождения лимфоцитов в условиях гипоксии на этапах заготовки ткани селезенки и ее транспортировки в лабораторию может составлять от 6 до 12 часов.

2. Выделение популяций лимфоцитов. При поступлении в лабораторию в асептических условиях в стерильном лотке хирургическими ножницами селезенку нарезают фрагментами объемом до 0,5 см3. 3-4 фрагмента селезенки помещают в стерильную пробирку и измельчают в гомогенизаторе вместе с раствором Хенкса, получают взвесь лимфоцитов. В пробирки, содержащие 1 мл раствора «Лимфолит» плотностью 1,077, наслаивают по 2 мл суспензии лимфоцитов и центрифугируют 20 минут при 1000-1500 rpm. Интерфазу, кольцо лимфоцитов на градиенте плотности, аккуратно отбирают пипеткой. Полученную клеточную суспензию дважды отмывают раствором Хенкса путем центрифугирования в течение 5 минут при 1000-1500 rpm. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 1 мл раствора Хенкса. 100 мкл клеточной суспензии отбирают для оценки количества, фенотипа и жизнеспособности лимфоцитов.

3. Оценка качества лимфоцитов. Оценку качества лимфоцитов селезенки проводят с помощью проточной цитометрии. В цитометрические пробирки к 100 мкл суспензии лимфоцитов добавляют 20 мкл моноклональных антител CD3-FITC/CD19-PE и 20 мкл витального красителя 7 амино-актиномицина D (7AAD) и инкубируют в течение 20 минут. После чего в пробирки вносят 1 мл фосфатного буфера (PBS) и анализируют на проточном цитометре. В норме в селезенке преобладают CD 19 позитивные клетки (В-лимфоциты), содержание которых составляет 40-50%, концентрация CD3 + клеток (Т-лимфоциты) варьирует от 25 до 35% [Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.].

Обследовано 15 взвесей лимфоцитов селезенки доноров органов, подготовленных к криохранению. Выявленное содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 27,2% до 33,5%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,2% до 53,3%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 91,2-97,8%.

Значительное влияние на качество лимфоцитов оказывает длительность нахождения клеток в условиях гипоксии. Обследованы образцы лимфоцитов селезенки от 5 доноров, хранившиеся в условиях гипоксии при +4°С до 72 часов. Методом проточной цитометрии определяли общее количество лимфоцитов и долю клеток включавших витальный краситель 7AAD. Каждый образец обследовали через 12, 24, 36, 48 и 72 часа хранения. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью витального ДНК-специфичного красителя 7AAD на проточном цитометре. Выявлено, что содержание жизнеспособных клеток через 12 и 24 часа хранения составляет от 93 до 97%, через 36 часов варьирует от 89 до 94%, через 48 часов - от 85 до 92% и через 72 часа - от 76 до 82%. Таким образом, для получения качественного диагностикума на основе лимфоцитов селезенки человека продолжительность этапов должна быть максимально короткой. Время от момента прекращения перфузии тканей донора до криоконсервирования клеток не должно превышать 48 часов.

II. Криоконсервирование клеток

1. Приготовление раствора криопротектора. В каждую пробирку для криоконсервирования вносят 180 мкл 99% DMSO, 250 мкл раствора Хенкса, 920 мкл фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Пробирки помещают в холодильник на +4°С.

2. Расчет необходимого числа пробирок для хранения. Рассчитывают количество образцов для криоконсервирования по формуле:

Х=n·4+2, где

Х - количество образцов для криоконсервирования, n - количество реципиентов, кому были выполнена операция трансплантации органа/ов от данного донора. Например: у донора С. изъяты печень, легкие, почка и поджелудочная железа. Органы трансплантированы следующим образом: реципиенту №1 поджелудочная железа + почка, реципиенту №2 - печень, реципиенту №3 - легкие. Количество образцов необходимое для криоконсервирования составляет: Х=3·4+2=14. Таким образом, должно быть подготовлено к криохранению 14 пробирок с лимфоцитами селезенки донора.

3. Внесение лимфоцитов в среду для хранения. В охлажденные пробирки для криоконсервирования с подготовленным и охлажденным раствором криопротектора пипеткой вносят по 1,5 млн лимфоцитов в 450 мкл раствора Хенкса. Пробирки для криоконсервирования плотно закрывают крышками и перемешивают содержимое с помощью вихревого смешивателя типа Vortex. Затем пробирки помещают в холодовой штатив и в течение 5-7 минут переносят в программный замораживатель.

4. Помещение на хранение. Пробирки с клеточным материалом, подготовленные для криоконсервирования, помещают в камеру программного замораживателя, предварительно охлажденную до +4°С. Криоконсервирование проходит по следующей программе:

Стартовая температура: +4°С

Этап №1: охлаждение 1°С/мин до -70°С

Этап №2: охлаждение 70°С/мин до -196°С

Затем образцы лимфоцитов донора переносят в отдельно выделенное хранилище криобанка и хранят при температуре -196°С в течение 5 лет и более.

III. Размораживание лимфоцитов донора

При необходимости из хранилища достают одну пробирку с лимфоцитами селезенки донора и помещают в водяную баню при температуре 37°С до полного исчезновения кристалликов льда. Затем пробирки с взвесью лимфоцитов центрифугируют 1000-1500 rpm в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 0,5 мл раствора Хенкса. После чего возможно тестирование сыворотки реципинта на наличие донор-специфических антител, которое может проводится двумя способами: серологическим (лимфоцитотоксический тест) или с применением набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. По истечению общего срока хранения, при отсутствии необходимости дальнейшего хранения биоматериала, невостребованные образцы изымаются из криохранилища и утилизируются.

IV. Контроль качества диагностикума

Обследовано 12 образцов лимфоцитов селезенки доноров органов, после криохранения. Выявлено, содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 25,7% до 31,4%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,7% до 52,8%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 87,9-91,7%. Таким образом, предложенная методика получения и хранения лимфоцитов доноров органов позволяет получить высококачественный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. В дальнейшем определение антител проводят по любой из существующих методик.

Для оценки эффективности полученных по предлагаемой методике клеток селезенки доноров органов для определения донор-специфических антител у реципиентов проведено исследование 18 образцов дигностикумов, хранившихся от 3 суток до 1 года. Определение антител проводили серологическим методом и с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. В таблице 1 представлены результаты определения антител у реципиентов органов, с использованием диагностикумов. При этом методом на платформе Luminex донор-специфические антитела выявлены у 5 реципиентов, течение посттрансплантационного периода которых осложнилось развитием реакции отторжения. Серологическим методом антитела выявлены только у одного реципиента. Таким образом, для определения DSA в посттрансплантационном периоде мы рекомендуем использовать методы, основанные на использовании х-МАР технологии на платформе Luminex.

Таблица 1
Определение донор-специфических антител у реципиентов органов с использованием диагностикумов
Метод исследования Обследовано образцов клеток Отсутствие донор-специфических антител Наличие донор-специфических антител
Серологический (лимфоцитотоксический тест) 18 17 1
Метод по технологии хМАР на платформе Luminex 18 13 5

Разработанный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA использовался в клинической практике у пациентки в течение 6 месяцев после трансплантации легких. Результаты проведенного обследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Мониторинг донор-специфических антител (ДСА) у реципиента М. после трансплантации легкого в течение 6 месяцев
Сутки после трансплантации ДСА к I классу ДСА к II классу
7 сутки отрицательный отрицательный
9 сутки отрицательный положительный
15 сутки отрицательный положительный
124 сутки отрицательный слабо положительный
165 сутки отрицательный отрицательный

Как видно из таблицы, у пациентки на 9 сутки посттрансплантационного периода выявили донор-специфические антитела ко второму классу HLA, которые сохранялись в течение трех месяцев на фоне проведения иммуносупрессивной терапии. Через шесть месяцев донор-специфические антитела в сыворотке пациентки не выявлены.

Таким образом, разработан диагностикум, содержащий выделенные из селезенки донора Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа.

Разработанный диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включает следующие приемы. Во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9% раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 часов.

Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включает следующие приемы. Для прогнозирования используют разработанный диагностикум, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов - не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

Для лучшего понимания сущности предложения приведем примеры.

Пример 1. Больной Г., 47 лет. Диагноз: хронический гломерунефрит, терминальная стадия хронической почечной недостаточности. 21.10.2011 произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А, В, В, Dr, совместимость по Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. Одновременно с изъятием донорской почки заготовлен фрагмент селезенки и по предлагаемой методике подготовлен диагностикум для определения донор-специфических антител. На 4 сутки у реципиента появились клинические признаки острого криза отторжения. Решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Проведено исследование сыворотки реципиента с криоконсервированными лимфоцитами селезенки донора (диагностикум). В сыворотке реципиента выявлено наличие донор-специфических антител к I и II классам HLA как серологическим методом, так и на платформе Luminex. Поставлен диагноз: острый гуморальный криз отторжения. Диагноз был подтвержден морфологически.

Пример 2. Больной К. 24 года. Диагноз: хроническая почечная недостаточность. 3.01.2012 года произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А В, Dr, совместимость по В, Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. В посттрансплантационном периоде отмечены: отсроченная функция трансплантата и замедленное восстановление азотовыделительной функции. На 17 сутки решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Исследование сыворотки реципиента проведено с подготовленным по предлагаемой методике диагностикумом. В сыворотке реципиента серологическим методом донор-специфических антител не выявлено, с помощью набора LIFECODES на платформе Luminex определены донор-специфические антитела к I классу HLA. Поставлен диагноз гуморальная реакция отторжения. После проведенной иммуносупрессивной терапии восстановилась функция трансплантата. При контрольном исследовании DSA на 30 сутки в сыворотке реципиента донор-специфических антител не выявлено.

edrid.ru

Диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения

Группа изобретений относится к медицине и касается диагностикума, содержащего лимфоциты человека для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационном периоде, характеризующегося тем, что диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора; способа получения диагностикума; способа прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включающего реакцию на определение донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости, характеризующегося тем, что используют указанный диагностикум. Изобретение обеспечивает получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, трансплантологии и хирургии, и может быть использовано для проведения мониторинга донор-специфических антител к системе HLA после аллотрансплантации органа в течение пяти лет и более.

Трансплантация органов, тканей и клеток - это замена больному путем хирургической операции пораженного, изношенного органа, части его или ткани, полностью утративших способность выполнять свои функции. Согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» (в редакции от 20.06.2000 №91-ФЗ, от 16.10.2006 №160-ФЗ) является средством спасения жизни и восстановления здоровья граждан. Одной из главных причин потери трансплантата является реакция отторжения донорского органа. Различают сверхострую, острую и хроническую реакции отторжения. Сверхострая реакция отторжения протекает бурно с первых минут или часов после пересадки органа. Острая реакция отторжения развивается в период с 4 до 90 дня после операции. Хроническая реакция отторжения диагностируется через несколько недель, месяцев и лет после операции, может несколько раз рецидивировать после подавления ее иммуносупрессивной терапией. Реакция отторжения трансплантата обусловлена клеточными и/или гуморальными иммунными механизмами. В ответ на чужеродные человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) в организме реципиента вырабатываются донор-специфические антитела (ДСА).

Для диагностики реакции отторжения производят биопсию трансплантата [Cornell LD, Smith RN, Colvin RB. Kidney transplantation: mechanisms of rejection and acceptance. Annu Rev Pathol 2008; 3:189-220; Tomasoni S, Remuzzi G, Benigni A. Allograft rejection: acute and chronic studies. Contrib Nephrol 2008; 159:122-34], по результатам которой может отмечаться смешанная гистологическая картина. Для интерпретации результатов биопсии используются универсальные, регулярно обновляемые критерии Банфф (Banff) [Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff '05 Meeting Report: differential diagnosis of chronic allograft injury and elimination of chronic allograft nephropathy ('CAN') Am J Transplant 2007; 7(3):518-26;. Solez K, Colvin RB, Racusen LC; Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions. Am J Transplant 2008; 8(4):753-60], на основании которых делается заключение о прогнозе и назначается лечение [Mengel M, Sis В, Halloran PF. SWOT analysis of Banff: strengths, weaknesses, opportunities and threatsof the international Banff consensus process and classification system for renal allograft pathology. Am J Transplant 2007; 7(10):2221-6]. В настоящее время маркером хронической посттрансплантационной нефропатии, опосредованной антителами, считают обнаружение методом иммунофлуоресцентной микроскопии C4d-фрагмента на поверхности эндотелия перитубулярных капилляров. Выявлена корреляция между отложением C4d и наличием в сыворотке реципиента донор-специфических антител.

Для исследования специфических антител используется ДИАГНОСТИКУМ - стандартный препарат, используемый в качестве антигена при серологических исследованиях. В настоящее время определение донор-специфических антител (ДСА) в посттрансплантационном периоде является важным диагностическим критерием реакции отторжения трансплантата. ДСА de novo могут образовываться как в ранние сроки на 3-21 сутки после трансплантации, так и через несколько лет после пересадки органа. Мониторинг донор-специфических антител у реципиента можно осуществлять в течение длительного времени после трансплантации только в том случае, если донор живой, то есть при родственной трансплантации. Исследование образования de novo донор-специфических антител у реципиента в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа не представляется возможным ввиду отсутствия донорских лимфоцитов. Особая трудность отмечается при мультиорганном заборе, когда от одного донора трансплантируют органы нескольким реципиентам и требуется большое количество донорских клеток. Таким образом, для проведения определения донор-специфических антител требуется большое количество стандартизованного антигенного материала донора. С этой целью используют два вида клеток: лимфоциты периферической крови и лимфоциты селезенки донора.

В настоящее время существуют несколько методов определения донор-специфических антител в сыворотке реципиента.

Серологический метод. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови, реже селезенки клетки или лимфоузла. В основе метода лежит комплементзависимый микролимфоцитотоксический тест (cross-match реакция) [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Этот тест базируется на способности антител к главному комплексу гистосовместимости в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты.

Цитометрический метод. Использование этого метода позволяет выявить очень низкие концентрации антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови. Сывороточные антитела реципиента связываются с антигенами HLA на поверхности лимфоцитов донора. После этого добавляются антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуоресцентной меткой. Дополнительное добавление моноклональных антител к CD3 и CD19 позволяют дифференцировать антитела к I классу (на CD3 + лимфоцитах, Т-клетки) и ко II классу (на CD19 + лимфоцитах, В-клетки) HLA [Robson A., Martin S.Т and В cell. crossmatching using three-colour flow cytometry // Transplant Immunology. - 1996. - V. 4. - 3. - P. 203-208]. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако, помимо антител к антигенам HLA, выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантитела. Обусловленная этими факторами низкая специфичность метода приводит к получению ложноположительных результатов.

Метод на основе хМАР-технологии. Антигеном для определения донор-специфических антител служат лимфоциты периферической крови крови. Определение донор-специфических антител проводят по технологии хМАР на платформе Luminex с помощью наборов LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) фирмы Invitrogen (США) [Detection of donor-specific antibodies using HLA-coated microspheres: another tool for kidney transplant risk stratification / E.M.Gibney, L.R.Cagle, B.Freed, S.E.Wamell, L.Chan, A.C.Wiseman // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2006. - V. 21. - Is. 9. - P.2625-2629]. Набор содержит смесь Luminex частиц. Одни частицы в смеси коньюгированы с моноклональными AT к I классу HLA, другие - к II классу HLA. Донорские лимфоциты лизируют, затем лизат смешивают с этими двумя категориями частиц. При инкубировании частицы связываются с растворенными донорскими молекулами HLA, образуя человеческие лейкоцитарные антигены, специфические для донора. Смесь частиц содержит также контрольные частицы, определяющие уровень фонового сигнала, для подтверждения нормальной работы тест-системы. Таким образом, способ определения донор-специфических антител с помощью хМАР-технологии обладает высокой чувствительностью, что позволяет выявить низкие уровни антител, и высокой специфичностью, что минимизирует количество ложноположительных результатов.

Прототип. Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является постановка cross-match реакции (перекрестная проба) перед трансплантацией органа, для определения предсуществующих донор-специфических антител у реципиента [Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки // В.Ю. Абрамов / Пособие для врачей. - М. - 2006. С.29-35]. Основным биологическим материалом для проведения реакции является периферическая венозная кровь реципиента и донора. Кровь донора используется для получения лимфоцитов, поэтому она должна быть жидкой. Для предотвращения свертывания, как правило, используют динатриевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТАNa2). Следует учитывать, что ЭДТА связывает ионы Са2+, что влияет на активность комплемента и тем самым может затруднить серологическое исследование. Выделяют лимфоциты из крови с помощью центрифугирования на градиенте плотности. При трансплантации трупного органа альтернативным источником лимфоцитов служит селезенка донора. В этом случае в чашку Петри помещают фрагмент селезенки донора (1-2 см3). Добавляют в чашку изотонический раствор и тщательно, до состояния кашицы измельчают фрагмент селезенки ножницами. Добавляют еще 5-7 мл изотонического раствора и хорошо размешивают измельченную ткань селезенки. Отбирают пипеткой жидкую часть клеточной взвеси и далее выделяют лимфоциты на градиенте плотности. После выделения клеток проводят оценку их жизнеспособности. Для оценки жизнеспособности лимфоцитов используют метод прижизненной окраски трипановым синим. Минимальный допустимый уровень жизнеспособности лимфоцитов при серологических исследованиях составляет 80%. Далее проводят комплемент-зависимую цитотоксическую реакцию (лимфоцитотоксический тест). Для этого в сыворотку реципиента вносят лимфоциты донора и инкубируют в течение 30 минут при +37°С. Затем добавляют кроличий комплемент и инкубируют еще 60 минут при +37°С. Вносят краску (5% водный раствор эозина) и после инкубации в течение 5 минут добавляют 20% раствор формалина. Через 15-20 минут оценивают результат реакции под микроскопом (по количеству живых и мертвых лимфоцитов). Результат исследования выражали в баллах в зависимости от относительного содержания погибших клеток. Так, при 0-20% погибших клеток результат считают отрицательным, 20-30% - слабоположительным (сомнительным), 31-41% - положительным, 41-80 - выраженно положительным, 81-100% - сильно выраженным положительным.

Самым существенным недостатком метода является невозможность исследования образования de novo донор-специфических антител у реципиента органов в послеоперационном периоде при трансплантации трупного органа ввиду отсутствия лимфоцитов донора, необходимых для постановки реакции. Наиболее доступным для исследования видом ткани донора служит периферическая кровь. В то же время в периферической крови преобладают Т-лимфоциты (60-70%), несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса. Содержание В-лимфоцитов, главный источник человеческих лейкоцитарных антигенов II класса, малочисленно (10-15%). Так как при оценке результатов лимфоцитотоксического теста гибель 0-20% клеток рассматривается как отрицательный результат, низкое содержание В-лимфоцитов может стать причиной неправильной трактовки результатов. Также существенно затрудняет чтение реакции «фоновая» гибель клеток более 10%.

Таким образом, существует необходимость разработки высококачественного диагностикума для определения у реципиента образования de novo донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. Обоснованным является использование лимфоцитов селезенки длительных сроков хранения. С этой целью предложено вместе с трансплантируемыми органами у донора осуществить забор селезенки или ее фрагмента, получить суспензию Т- и В-лимфоцитов селезенки, оценить популяционный состав и жизнеспособность лимфоцитов, затем после добавления криопротекторов сохранить жизнеспособные клетки в условиях сверхнизких температур. Диагностикум позволит в течение длительного времени (год и более) контролировать наличие донор-специфических антител у реципиента после аллотрансплантации.

Достигаемым техническим результатом является получение высококачественного диагностикума, содержащего Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа, для диагностики гуморального отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии.

I. Получение лимфоцитов селезенки

1. Заготовка ткани селезенки осуществляется на основании приказа Минздравсоцразвития России и РАМН от 25.05.2007 №357/40 «Об утверждении Перечня органов и (или) тканей человека - объектов трансплантации, Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих трансплантацию органов и (или) тканей человека, и Перечня учреждений здравоохранения, осуществляющих забор и заготовку органов и (или) тканей человека». Хирург, после заготовки трансплантируемых органов, через выполненный ранее доступ в брюшную полость, с сохранением стерильности операционного поля, мануально выделяет селезенку. С целью предотвращения кровотечения на сосудистую ножку органа накладывается лигатура. Режущим хирургическим инструментарием отсекается один из полюсов селезенки. Отсеченный фрагмент помещается в стерильный транспортный контейнер, содержащий 200 мл охлажденного до +4°С раствора 0,9% раствором NaCl. Контейнер герметично закрывают. Транспортировка биоматериала осуществляется в условиях, поддерживающих температуру ткани +4°С. В случае невозможности заготовки ткани селезенки, без повреждения донорского органа при операции забора, биоматериал заготавливается при последующей обработке органа. Хирургом, подготавливающим орган к имплантации, в соответствии с интраоперационной ситуацией, острым методом выделяется фрагмент селезенки объемом не менее ¼ органа. Упаковка и транспортировка ткани селезенки выполняются по описанной ранее методике. Передача биоматериала в медицинское учреждение оформляется стандартным актом, в котором указывается: дата, ФИО донора, № истории болезни, тип тканей, учреждения передавшее и принявшее биоматериал, лица передавшее и принявшие биоматериал. Операция заготовки ткани селезенки занимает 15-20 минут, однако в зависимости от объема операции органного донорства длительность нахождения лимфоцитов в условиях гипоксии на этапах заготовки ткани селезенки и ее транспортировки в лабораторию может составлять от 6 до 12 часов.

2. Выделение популяций лимфоцитов. При поступлении в лабораторию в асептических условиях в стерильном лотке хирургическими ножницами селезенку нарезают фрагментами объемом до 0,5 см3. 3-4 фрагмента селезенки помещают в стерильную пробирку и измельчают в гомогенизаторе вместе с раствором Хенкса, получают взвесь лимфоцитов. В пробирки, содержащие 1 мл раствора «Лимфолит» плотностью 1,077, наслаивают по 2 мл суспензии лимфоцитов и центрифугируют 20 минут при 1000-1500 rpm. Интерфазу, кольцо лимфоцитов на градиенте плотности, аккуратно отбирают пипеткой. Полученную клеточную суспензию дважды отмывают раствором Хенкса путем центрифугирования в течение 5 минут при 1000-1500 rpm. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 1 мл раствора Хенкса. 100 мкл клеточной суспензии отбирают для оценки количества, фенотипа и жизнеспособности лимфоцитов.

3. Оценка качества лимфоцитов. Оценку качества лимфоцитов селезенки проводят с помощью проточной цитометрии. В цитометрические пробирки к 100 мкл суспензии лимфоцитов добавляют 20 мкл моноклональных антител CD3-FITC/CD19-PE и 20 мкл витального красителя 7 амино-актиномицина D (7AAD) и инкубируют в течение 20 минут. После чего в пробирки вносят 1 мл фосфатного буфера (PBS) и анализируют на проточном цитометре. В норме в селезенке преобладают CD 19 позитивные клетки (В-лимфоциты), содержание которых составляет 40-50%, концентрация CD3 + клеток (Т-лимфоциты) варьирует от 25 до 35% [Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.].

Обследовано 15 взвесей лимфоцитов селезенки доноров органов, подготовленных к криохранению. Выявленное содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 27,2% до 33,5%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,2% до 53,3%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 91,2-97,8%.

Значительное влияние на качество лимфоцитов оказывает длительность нахождения клеток в условиях гипоксии. Обследованы образцы лимфоцитов селезенки от 5 доноров, хранившиеся в условиях гипоксии при +4°С до 72 часов. Методом проточной цитометрии определяли общее количество лимфоцитов и долю клеток включавших витальный краситель 7AAD. Каждый образец обследовали через 12, 24, 36, 48 и 72 часа хранения. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью витального ДНК-специфичного красителя 7AAD на проточном цитометре. Выявлено, что содержание жизнеспособных клеток через 12 и 24 часа хранения составляет от 93 до 97%, через 36 часов варьирует от 89 до 94%, через 48 часов - от 85 до 92% и через 72 часа - от 76 до 82%. Таким образом, для получения качественного диагностикума на основе лимфоцитов селезенки человека продолжительность этапов должна быть максимально короткой. Время от момента прекращения перфузии тканей донора до криоконсервирования клеток не должно превышать 48 часов.

II. Криоконсервирование клеток

1. Приготовление раствора криопротектора. В каждую пробирку для криоконсервирования вносят 180 мкл 99% DMSO, 250 мкл раствора Хенкса, 920 мкл фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Пробирки помещают в холодильник на +4°С.

2. Расчет необходимого числа пробирок для хранения. Рассчитывают количество образцов для криоконсервирования по формуле:

Х=n·4+2, где

Х - количество образцов для криоконсервирования, n - количество реципиентов, кому были выполнена операция трансплантации органа/ов от данного донора. Например: у донора С. изъяты печень, легкие, почка и поджелудочная железа. Органы трансплантированы следующим образом: реципиенту №1 поджелудочная железа + почка, реципиенту №2 - печень, реципиенту №3 - легкие. Количество образцов необходимое для криоконсервирования составляет: Х=3·4+2=14. Таким образом, должно быть подготовлено к криохранению 14 пробирок с лимфоцитами селезенки донора.

3. Внесение лимфоцитов в среду для хранения. В охлажденные пробирки для криоконсервирования с подготовленным и охлажденным раствором криопротектора пипеткой вносят по 1,5 млн лимфоцитов в 450 мкл раствора Хенкса. Пробирки для криоконсервирования плотно закрывают крышками и перемешивают содержимое с помощью вихревого смешивателя типа Vortex. Затем пробирки помещают в холодовой штатив и в течение 5-7 минут переносят в программный замораживатель.

4. Помещение на хранение. Пробирки с клеточным материалом, подготовленные для криоконсервирования, помещают в камеру программного замораживателя, предварительно охлажденную до +4°С. Криоконсервирование проходит по следующей программе:

Стартовая температура: +4°С

Этап №1: охлаждение 1°С/мин до -70°С

Этап №2: охлаждение 70°С/мин до -196°С

Затем образцы лимфоцитов донора переносят в отдельно выделенное хранилище криобанка и хранят при температуре -196°С в течение 5 лет и более.

III. Размораживание лимфоцитов донора

При необходимости из хранилища достают одну пробирку с лимфоцитами селезенки донора и помещают в водяную баню при температуре 37°С до полного исчезновения кристалликов льда. Затем пробирки с взвесью лимфоцитов центрифугируют 1000-1500 rpm в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в 0,5 мл раствора Хенкса. После чего возможно тестирование сыворотки реципинта на наличие донор-специфических антител, которое может проводится двумя способами: серологическим (лимфоцитотоксический тест) или с применением набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. По истечению общего срока хранения, при отсутствии необходимости дальнейшего хранения биоматериала, невостребованные образцы изымаются из криохранилища и утилизируются.

IV. Контроль качества диагностикума

Обследовано 12 образцов лимфоцитов селезенки доноров органов, после криохранения. Выявлено, содержание Т-лимфоцитов (CD3 + клетки) варьировало от 25,7% до 31,4%, концентрация В-лимфоцитов (CD19 + клетки) - от 41,7% до 52,8%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 87,9-91,7%. Таким образом, предложенная методика получения и хранения лимфоцитов доноров органов позволяет получить высококачественный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде. В дальнейшем определение антител проводят по любой из существующих методик.

Для оценки эффективности полученных по предлагаемой методике клеток селезенки доноров органов для определения донор-специфических антител у реципиентов проведено исследование 18 образцов дигностикумов, хранившихся от 3 суток до 1 года. Определение антител проводили серологическим методом и с помощью набора LIFECODES Donor Specific Antibody (DSA) на платформе Luminex. В таблице 1 представлены результаты определения антител у реципиентов органов, с использованием диагностикумов. При этом методом на платформе Luminex донор-специфические антитела выявлены у 5 реципиентов, течение посттрансплантационного периода которых осложнилось развитием реакции отторжения. Серологическим методом антитела выявлены только у одного реципиента. Таким образом, для определения DSA в посттрансплантационном периоде мы рекомендуем использовать методы, основанные на использовании х-МАР технологии на платформе Luminex.

Таблица 1
Определение донор-специфических антител у реципиентов органов с использованием диагностикумов
Метод исследования Обследовано образцов клеток Отсутствие донор-специфических антител Наличие донор-специфических антител
Серологический (лимфоцитотоксический тест) 18 17 1
Метод по технологии хМАР на платформе Luminex 18 13 5

Разработанный диагностикум для определения донор-специфических антител к HLA использовался в клинической практике у пациентки в течение 6 месяцев после трансплантации легких. Результаты проведенного обследования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Мониторинг донор-специфических антител (ДСА) у реципиента М. после трансплантации легкого в течение 6 месяцев
Сутки после трансплантации ДСА к I классу ДСА к II классу
7 сутки отрицательный отрицательный
9 сутки отрицательный положительный
15 сутки отрицательный положительный
124 сутки отрицательный слабо положительный
165 сутки отрицательный отрицательный

Как видно из таблицы, у пациентки на 9 сутки посттрансплантационного периода выявили донор-специфические антитела ко второму классу HLA, которые сохранялись в течение трех месяцев на фоне проведения иммуносупрессивной терапии. Через шесть месяцев донор-специфические антитела в сыворотке пациентки не выявлены.

Таким образом, разработан диагностикум, содержащий выделенные из селезенки донора Т-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, и В-лимфоциты, несущие на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса в соотношении, пригодном для обеспечения проведения полноценной реакции антиген-антитело при исследовании донор-специфических антител к I и II классу HLA в сыворотке реципиента в течение длительного времени после трансплантации органа.

Разработанный диагностикум содержит лимфоциты, полученные из селезенки мультиорганного донора, при этом содержание Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса, составляет от 25 до 35%, В-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости II класса - от 41 до 55%, жизнеспособность клеток - не менее 80%.

Способ получения диагностикума для определения донор-специфических антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости после трансплантации органов у мультиорганного донора, включает следующие приемы. Во время операции по изъятию органов для трансплантации у мультиорганного донора забирают селезенку или ее фрагмент, помещают в стерильный контейнер, содержащий охлажденный до +4° - +6°С 0,9% раствор хлорида натрия, затем селезенку в стерильных условиях нарезают на небольшие фрагменты, помещают их в стерильную пробирку с раствором Хенкса и гомогенезируют, из полученной взвеси клеток на градиенте плотности выделяют лимфоциты и с помощью проточной цитометрии оценивают качество полученных клеток, отбирают образцы с содержанием Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов не менее 41%, жизнеспособностью не менее 80%, вносят в них раствор криопротектора, с конечной концентрацией DMSO 10%, лимфоциты замораживают с помощью двухэтапной программы при стартовой температуре +4°С, с охлаждением на первом этапе в режиме 1°С/мин до -70°С и охлаждением на втором этапе в режиме 70°С/мин до -196°С, с последующим хранением диагностикума в жидком азоте при температуре -196°С, при этом время от момента забора селезенки до помещения диагностикума в жидкий азот не должно превышать 48 часов.

Способ прогнозирования реакции отторжения после трансплантации органов от мультиорганного донора, включает следующие приемы. Для прогнозирования используют разработанный диагностикум, причем для постановки реакции клетки размораживают на водяной бане при температуре +37°С, далее на проточном цитометре проводят контроль качества диагностикума, при содержании Т-лимфоцитов не менее 25%, В-лимфоцитов - не менее 41%, жизнеспособности клеток не менее 80% осуществляют реакцию на определение донор-специфических антител, при выявлении которых прогнозируют высокий риск развития реакции отторжения.

Для лучшего понимания сущности предложения приведем примеры.

Пример 1. Больной Г., 47 лет. Диагноз: хронический гломерунефрит, терминальная стадия хронической почечной недостаточности. 21.10.2011 произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А, В, В, Dr, совместимость по Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. Одновременно с изъятием донорской почки заготовлен фрагмент селезенки и по предлагаемой методике подготовлен диагностикум для определения донор-специфических антител. На 4 сутки у реципиента появились клинические признаки острого криза отторжения. Решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Проведено исследование сыворотки реципиента с криоконсервированными лимфоцитами селезенки донора (диагностикум). В сыворотке реципиента выявлено наличие донор-специфических антител к I и II классам HLA как серологическим методом, так и на платформе Luminex. Поставлен диагноз: острый гуморальный криз отторжения. Диагноз был подтвержден морфологически.

Пример 2. Больной К. 24 года. Диагноз: хроническая почечная недостаточность. 3.01.2012 года произведена аллотрансплантация почки; miss-match по локусам А, А В, Dr, совместимость по В, Dr. На момент трансплантации реакция cross-match - отрицательная. В посттрансплантационном периоде отмечены: отсроченная функция трансплантата и замедленное восстановление азотовыделительной функции. На 17 сутки решено провести определение донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения. Исследование сыворотки реципиента проведено с подготовленным по предлагаемой методике диагностикумом. В сыворотке реципиента серологическим методом донор-специфических антител не выявлено, с помощью набора LIFECODES на платформе Luminex определены донор-специфические антитела к I классу HLA. Поставлен диагноз гуморальная реакция отторжения. После проведенной иммуносупрессивной терапии восстановилась функция трансплантата. При контрольном исследовании DSA на 30 сутки в сыворотке реципиента донор-специфических антител не выявлено.

bankpatentov.ru

Предсуществующие антитела (специфическая пресенсибилизация)

При селекции пары кроме определения фенотипа HLA донора и реципиента обязательно устанавливается факт наличия или отсутствия у реципиента т.н. предсуществующих антител. Наличие антител свидетельствует о специфической пресенсибилизации реципиента и существенным образом влияет на решение, выполнять ли трансплантацию донорского органа.

Специфическая пресенсибилизация может быть выявлена приблизительно у трети больных и чаще всего бывает результатом переливания крови, беременности или перенесенной раннее трансплантации.

Предсуществующие антитела, специфические к лимфоцитам конкретного донора, обнаруживают при лимфоцитотоксическом тесте (лимфоциты донора и сыворотка реципиента). Такая реакция получила название перекрестной пробы, или cross-match.

Соответственно общему правилу, трансплантация аллогенного органа категорически запрещена при наличии у реципиента антител к антигенам системы HLA донора. Высокий процент активности предсуществующих антител (>25%) является фактором риска развития сверхострого отторжения трансплантата и рассматривается как отрицательный прогностический показатель.

Иммунологическая селекция пары донор-реципиент

● Определение совместимости по системе АВО (группа крови донора и реципиента)

● Определение степени гистосовместимости (HLA-генотип донора и реципиента)

● Определение предсуществующих антител с помощью реакции cross-match (уровень специфической пресенсибилизации реципиента)

Механизмы отторжения аллотрансплантатов

После реваскуляризации донорского органа развивается иммунная реакция «хозяин против трансплантата», направленная против его трансплантационных антигенов. Реакция отторжения основывается на соответствующих механизмах антител-зависимого или клеточного повреждения тканей, или их комбинации. В данное время принято различать:

1. В зависимости от механизма иммунной реакции:

● гуморальное отторжение - реализуется с помощью гуморальных антител;

● клеточное отторжение - реализуется с помощью лимфоцитов.

2. В зависимости от скорости клинических проявлений:

● сверхострое отторжение, при котором трансплантат может быть поврежден и целиком разрушен на протяжении нескольких часов или даже минут после реваскуляризации;

● острое отторжение - повреждение трансплантата в течение первых трех недель после трансплантации;

● хроническое отторжение - развивается на протяжении нескольких месяцев или лет.

3. В зависимости от количества клинических патоморфологических изменений:

● Легкой степени

● Средней степени

● Тяжелой степени

Сверхострое отторжение является результатом предыдущей специфической пресенсибилизации реципиента (гемотрансфузии, беременности, которые предшествуют трансплантации). Эта реакция реализуется за счет гуморальных антител и потому часто называется гуморальным отторжением. Гуморальное отторжение представляет собой реакцию гиперчувствительности немедленного типа.

При сверхостром отторжении предсуществующие антитела повреждают трансплантат или вследствие их непосредственного влияния на эндотелий капилляров, или в связи с развитием иммунного воспаления, которое сопровождается нарушениями системы гемокоагуляции. Следствием этих нарушений являются образование тромбов в сосудах трансплантата и некроз трансплантата. Этот процесс нельзя остановить ни одним из известных методов иммуносупрессии.

Сверхострое отторжения развивается в тех случаях, если при селекции пары донор-реципиент не было учтено совпадение по системе АВО, а также при высоком титре предсуществующих антител у реципиента. Печень является единственным органом, для которого сверхострое отторжение не характерно, даже при положительной реакции cross-match.

Сверхострое отторжение

● Обусловлено наличием предсуществующих антител у реципиента и является гуморальной реакцией гиперчувствительности немедленного типа.

● Необратимое повреждение трансплантата происходит на протяжении нескольких часов или даже минут.

● Остановить реакцию невозможно даже жесткими режимами иммуносупрессии.

Острое отторжение является реакцией гиперчувствительности замедленного типа, в патогенезе которой главная роль принадлежит клеточному звену иммунитета. Эта реакция основана на принципе иммунологического распознавания инородного антигена и заканчивается взаимодействием активированного Т лимфоцита с клеткой-мишенью, в результате чего реализуется киллерный эффект.

Разрушение трансплантата происходит на протяжении нескольких дней или месяцев после трансплантации. Гистологически для острого отторжения характерна инфильтрация трансплантата мононуклеарами, кровоизлияниями и отеками, выраженность которых варьирует. Клеточные инфильтраты сначала носят ячеистый характер, потом наступает тотальная инфильтрация, в основном лимфоцитами. Дальнейшая инфильтрация макрофагами и сегментоядерными клетками свидетельствует о завершении процесса отторжения. Хотя эндотелий сосудов служит основной мишенью для этой реакции, обычно целостность сосудов не нарушается.

Острое (клеточное) отторжение обычно можно остановить, усилив режим иммуносупрессии. После успешного подавления острого отторжения гистологически в трансплантате обнаруживаются участки склероза (места наиболее выраженной клеточной инфильтрации). Сохраненные участки трансплантата обычно выглядят нормально. После купирования отторжения функция донорского органа продолжительное время может оставаться удовлетворительной.

Острое отторжение

● реакция гиперчувствительности замедленного типа;

● обусловлено клеточным звеном иммунитета;

● развивается на протяжении нескольких дней или месяцев после трансплантации;

● поддается иммуносупрессивной терапии;

● после купирования отторжения орган может долго сохранять свою функцию.

Хроническое отторжение– поздняя дегенерация трансплантата через несколько месяцев или лет после трансплантации органа. Этот процесс медленно прогрессирует и не зависит от жесткости режима иммуносупрессии. В развитии поздней дисфункции трансплантата принимают участие как антигензависимые, так и неспецифические факторы. Для диагностики причины дисфункции требуется выполнение пункционной биопсии.

В патогенезе хронического отторжения в основном принимают участие гуморальные антитела к антигенам системы HLA донора. Патологическая картина при хроническом отторжении отличается от таковой при остром и сверхостром отторжениях. Клеточная инфильтрация выражена слабо, а в препарате преобладают плазмоциты и наблюдается фиброз интерстициальной ткани.

Для хронического отторжения характерно постепенное повреждение и облитерация просвета сосудов трансплантата (артерий, артериол). Повреждение и пролиферация эндотелия сосудов приводит к их облитерации, следствием чего является ишемия трансплантата, замещение его паренхимы фиброзной тканью и медленное ухудшение функции пересаженного органа, вплоть до полной потери этой функции.

Хроническое отторжение

● в реакции принимают участие гуморальные антитела к антигенам системы HLA донора;

● дегенерация трансплантата наблюдается через несколько месяцев или лет после трансплантации;

● характерно повреждение и пролиферация эндотелия, облитерация сосудов, ишемия трансплантата и замещение его паренхимы фиброзной тканью.

 

Профилактика и лечение отторжения.

Иммуносупресcивная терапия

Во время выполнения первых трансплантаций было известно лишь одно средство иммуносупрессии – тотальное облучение тела. Это приводило к 100% летальности реципиентов. После того, как Piter Medawar (1945) доказал иммунологическую природу отторжения, была обоснована необходимость применения фармакологической иммуносупрессии, а в скором времени и доказана эффективность кортикостероидов,чуть позже – азатиоприна и их сочетания. В 1976 году J.Borel доказал феноменальные иммуносупрессивные свойства циклоспорина и это открыло новую эпоху в трансплантации органов. В 1986 году появился новый препарат - FK 506 (такролимус, програф), который обладает высокой чистотой иммуносупрессивного действия. Альтернативой азатиоприна являются препараты микофеноловой кислоты: селлсепт и майфортик, обладающие более выраженными иммуносупрессивными свойствами и меньшей миелотоксичностью чем азатиоприн. В последние годы находят применение моноклональные антитела -зенапакс и симулект, для профилактики острого отторжения (индукционная иммуносупрессия).

В Украине для базовой иммуносупрессии используется сочетание циклоспорина или прографа с кортикостероидами и селлсептом или майфортиком. С 2001 г. для профилактики острого отторжения в индукционной иммуносупрессивной терапии применяется генетически-модифицированные моноклональные антитела (зенапакс и симулект).

Кортикостероиды

Малые дозы кортикостероидов используются для проведения базовой многокомпонентной иммуносупрессии, а большие дозы - для лечения острого отторжения. Применение кортикостероидов основано на их противовоспалительных и иммуносупрессивных свойствах. Иммуносупрессивные свойства стероидов: 1) способны тормозить синтез антител; 2) связывать комплемент; 3) ингибировать синтез из макрофагов цитокинов, которые инициируют острое отторжение (интерлейкин-1, интерлейкин-2 и α-интерферон).

Для базовой и антикризовой иммуносупрессивной терапии могут быть использованы преднизолон, метилпреднизолон, солумедрол и другие стероиды. Как правило, перед реперфузией трансплантата внутривенно вводят 1 г метилпреднизолона. В последующем, если используется комбинация стероидов с циклоспорином, каждый день на протяжении первой недели вводят 150-200 мг преднизолона с редукцией дозы до 20 мг до конца первого месяца и до 10 мг до конца первого года после трансплантации.

Азатиоприн

Азатиоприн действует на протяжении ранней пролиферативной фазы клеточного цикла и блокирует первичный клеточный и гуморальный ответы. Благодаря этим иммуносупрессивным свойствам препарат вот уже более 30 лет применяется в трансплантологии.

Ежедневная доза азатиоприна составляет 1-2 мг/кг/сут, если он применяется в виде поддерживающей терапии. Поскольку миелосупрессивный эффект азатиопринадозозависим, при назначении препарата следует ориентироваться на содержание лейкоцитов в периферической крови.

Основным побочным эффектом терапии есть миелосупресивное действие азатиоприна. Чаще всего в клинике наблюдаются такие проявления побочных эффектов азатиоприна, как лейкопения, тромбоцитопения, макроцитарная анемия или панцитопения.

Циклоспорин

Циклоспорин блокирует иммунный ответ Т-лимфоцитов за счет ингибирования продукции интерлейкина-2 (IL-2) Для исключения возможности применения неадекватно низкой или избыточной дозы препарата, а также с целью предотвращения нефро-гепато-нейротоксичности последнего, производят мониторирование концентрации циклоспорина в крови. Исследования проводится через 12 часов после приема последней дозы препарата. Оптимальной является концентрация 150-250 нг/мл.

Для орального применения используется микроэмульсионная форма циклоспорина (Сандиммун-Неорал). Применение этой формы циклоспорина снизило риск развития осложнений и побочных эффектов иммуносупрессивной терапии.



infopedia.su

5. Реиммунизация доноров для получения антител анти-d

Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались антитела-D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает возможность сохранить титр антитела в крови иммунизируемых лиц или добиться его повышения. Подбор крови-антигена для реиммунизации проводится так же, как и для иммунизации.

Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания иммунизации и появления антител и затем повторяется каждые четыре месяца. У лиц, иммунизированных беременностями или трансфузиями крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре месяца, но только вне периода беременности и лактации.

Курс реиммунизации состоит из двух-трехкратного внутривенного или внутримышечного введения крови донора по 2-3 мл с интервалом два-три дня. Такие курсы повторяются каждые четыре месяца.

6. Время появления антител

Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от четырех месяцев до года и более лет от начала иммунизации. Титр антител может быть от 1:2 до 1:1024 и выше. Стойкие высокие титры анти-D у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливаются не ранее, чем через полтора года.

Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее, чем у 70% иммунизируемых лиц.

7. Иммунизация доноров для получения антител анти-с и анти-е

Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие сочетания фенотипа крови иммунизируемого лица и эритроцитов, применяемых для иммунизации:

┌────────────┬──────────────────────┬────────────────────────────┐

│Планируемые │ Фенотип крови │ Фенотип эритроцитов, │

│ антитела │ иммунизируемого лица │ применяемых для иммунизации│

├────────────┼──────────────────────┼─────────────────┬──────────┤

│ │ ccddee │ Ccddee │ CCddee │

│ ├──────────────────────┼─────────────────┼──────────┤

│ анти-С │ ccDee │ Ccddee │ CCddee │

│ │ ccDEe │ CcDee │ CCDee │

│ │ │ CcDEe │ CCDEe │

├────────────┼──────────────────────┼─────────────────┼──────────┤

│ │ ccddee │ ccddEe │ │

│ анти-Е │ Ccddee │ │ │

│ ├──────────────────────┼─────────────────┼──────────┤

│ │ CcDee │ ccddEe │ ccDEE │

│ │ │ ccDEe │ CcDEE │

│ │ │ CcDEe │ │

└────────────┴──────────────────────┴─────────────────┴──────────┘

Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуется две схемы иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат.

Первая схема иммунизации

Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови донора антигена с перерывом по два дня. Первые пять инъекций - по 2 мл и последующие пять - по 1 мл. Затем следует перерыв в четыре месяца.

Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных введений крови с интервалами по два дня. Первые пять инъекций - по 1 мл и последующие пять - по 0,5 мл.

Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводят третий курс иммунизации (реиммунизации), аналогичный второму, и так повторяют каждые четыре месяца.

Вторая схема иммунизации

Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных инъекций крови с интервалами по два - три дня. Первая инъекция - 10 мл и последующие пять - 5 мл. Через восемь - десять месяцев проводится второй курс.

Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови по 5 мл с интервалами по три-четыре дня.

Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводится третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный второму, и так повторяется каждые четыре месяца.

studfiles.net

2. Подготовка донора, кровь которого

используется в качестве антигена

Антигеном для резус-иммунизации служат эритроциты консервированной крови активных доноров группы О(I) или одноименной с кровью иммунизируемого лица.

Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров, дающих кровь для переливания больным, донор антигена должен быть обследован два раза в год у врача-инфекциониста с целью исключения латентно протекающего заболевания печени.

Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью. Рекомендуется для каждой группы лиц (в количестве до десяти человек) использовать для иммунизации эритроциты одного и того же донора.

Кровь, используемая в качестве антигена, заготавливается стерильно в мелкой расфасовке на любом консервирующем растворе и годна к употреблению семь дней. После вскрытия флакона путем прокола пробки кровь должна быть использована сразу для иммунизации одного или нескольких доноров. Оставлять кровь после вскрытия флакона до прихода следующей группы доноров воспрещается. Для иммунизации могут быть использованы также криоконсервированные размороженные эритроциты со сроком хранения, предусмотренным для этой среды.

Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с антисывороткой соответствующей специфичности.

При иммунизации антигенами С и Е в течение курса рекомендуется для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и того же донора, преимущественно свежеконсервированные.

3. Условия иммунизации и реиммунизации

Инъекции антигена проводят в условиях соблюдения асептики, в специально отведенном помещении, в котором не производится работа с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков. Для иммунизации применяют шприцы одноразового пользования, а при отсутствии - обычные шприцы, которые должны быть автоклавированы.

Перед началом и на 8-30 день после окончания каждого курса иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на наличие, специфичность и активность антител.

Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров антигенами системы резус. Однако при необходимости в этих схемах могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев между курсами, и в дозах - в пределах+-5 мл.

При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь, используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна быть отрицательной по фактору Келл.

4. Иммунизация доноров для получения антител анти-d

Для получения антител анти-D рекомендуется иммунизировать лиц фенотипа ccddee, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа ccDee. Однако следует иметь в виду, что в процессе такой иммунизации иногда, кроме антител анти-D, образуются антитела анти-С. Для избежания этого можно привлекать к иммунизации лиц фенотипа Ccddee, применяя в качестве антигена кровь фенотипа ccDee, а также фенотипа CcDee.

Иммунизация лиц гомозиготных по антигену С, т.е. фенотипа CCddee кровью вышеуказанных генотипов не разрешается ввиду возможности образования у них антител анти-с.

Схема иммунизации

Первый курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена в количестве: первая - 10 мл крови, последующие две инъекции - по 5 мл с интервалами между ними три-четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс иммунизации.

Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена по 5 мл на каждую с интервалами по три-четыре дня.

Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не выработалось антител, через шесть месяцев после второго курса следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные второму курсу.

Если после четвертого курса у донора не выработается антител, через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами, следует провести сокращенные курсы по типу реиммунизации.

Если и после такой длительной иммунизации антитела не образуются, донора от иммунизации отстраняют.

После выработки у донора активных антител для сохранения и дальнейшего повышения их титра им необходимо периодически проводить инъекции антигена - реиммунизацию.

studfiles.net


Смотрите также