Диагностические антигенные препараты: диагностикумы, аллергены, токсины. Получение. Применение. Диагностикумы на основе антител это


62. Диагностикумы. Получение, применение.

В диагностических целях при обнаружении антител в сы­воротке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосите­лей используются серологические реакции.

Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроор­ганизмов или определенные антигены.

Необходимость использования диагностикумов для сероло­гических реакций связана не только с явным их преимущест­вом перед живыми культурами микробов (безопасность в ра­боте), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувст­вительностью к антителам и способностью длительно сохра­нять антигенные свойства.

Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещест­ва, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко.

В серологических реакциях (реакции агглютинации, реак­ции пассивной гемагглютинации, реакции связывания компле­мента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы.

Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации.

Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с ад­сорбированными на них антигенами, извлеченными из бакте­рий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выяв­ления антигена в выделениях больных, в тканях и др., при­меняют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сен­сибилизированные антителами.

Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации.

В настоящее время в лабораториях используются следу­ющие диагностикумы.

1. Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Приме­няется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных.

2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглю­тинации с сывороткой больных.

3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Исполь­зуются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью.

4. Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшноти­фозного бактерионосительства.

5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона.

6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллезной инфекции.

7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенси­билизированные очищенным Vi-антигеном S. typhi, применяет­ся в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионоси­тельства.

8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения кли­нического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа.

9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом кле­щевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугирова­нию (для осветления) и инактивируют химическими вещест­вами.

 Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания.

studfiles.net

36. Диагностические препараты. Антигенные препараты (диагностикумы, эритроцитарные диагностикумы, антигены).

Идентификация вирусов, бактерий, грибов, а также диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний производится с помощью специальных диагностических препаратов. Такие препараты позволяют достоверно выявлять аллергические и иммунопатологические расстройства, определять иммунный статус и иммунологическую совместимость тканей.

Диагностикумы представляют собой взвесь убитых бактерий, либо антигенов, которые используются в серологических исследованиях, а также для того чтобы определить наличие антител в сыворотке крови. В диагностиках содержатся в зависимости от их целевого назначения различные иммунореагенты (иммуномодуляторы, антитела, антигены, аллергены). Идентифицировать микроорганизмы можно также с помощью реакции иммунитета больного на диагностические иммунные сыворотки.

В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции.

Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены.

Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства.

Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко.

В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы.

Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации.

Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами.

Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации.

37. Диагностические сыворотки. Получение и применение. Способ получения адсорбированных агглютинирующих сывороток по Кастеллани.

Диагностические сыворотки (диагностикумы) представляют собой взвесь убитых бактерий определенного вида. К диагностическим специфическим сывороткам, применяемым для обнаружения в тех или иных материалах антигенов или для определения вида и даже типа микроба или вируса, относятся агглютинирующие, преципитирующие и лизирующие (комплементсвязывающие). Такая классификация основана на функциональной способности специфических гамма-глобулинов склеивать (агглютинировать), осаждать (преципитировать), растворять (лизировать) соответствующие антигены. Наиболее широко агглютинирующие сыворотки применяют при дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, рода Brucella, Listeria, возбудителей риккетсиозных и вирусных инфекций. Агглютинирующие сыворотки готовят путем гипериммунизации животных различными корпускулярными антигенами, введением их парентеральным путем. В качестве антигенов используют живые или убитые различными способами культуры соответствующих микробов. Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600. Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки — сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглютинации с двумя — тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген, в отношении которого проводилась адсорбция.

Адсорбированные сыворотки применяют при идентификации выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод). Преципитирующие сыворотки предпочтительно готовят для диагностики сибирской язвы. Иммунизируют внутривенным способом лошадей слабовирулентной культурой возбудителя сибирской язвы. Реакции преципитации используют в судебно-медицинской и ветеринарной экспертизе. При ряде инфекционных заболеваний образуются так называемые комплементсвязывающие антитела. При их определении в практике используются специфические диагностические сыворотки, содержащие такие антитела. Показательным примером является приготовление специфических диагностических ящурных сывороток. Идентификацию штамма циркулирующего вируса ящура проводят с помощью реакции связывания комплемента (РСК). Специфическую типовую и вариантную сыворотки получают от морских свинок, которых заражают вирусосодержащей суспензией соответствующего типа, Диагностические комплементсвязывающие сыворотки используются как контрольные при постановке РСК на бруцеллез, сап, кампилобактериоз, вирусные респираторные болезни, грипп и другие бактерийные, вирусные и паразитарные инфекции. При постановке РСК непременным условием является применение в качестве одного из ее компонентов комплемента. Комплемент-- это неспецифический фактор гуморального иммунитета, содержащийся в сыворотках крови теплокровных и холоднокровных животных. Наиболее изучен комплемент морской свинки. Поэтому при постановке РСК в качестве комплемента используют сыворотку крови морских свинок.

studfiles.net

ДИАГНОСТИКУМЫ — Большая Медицинская Энциклопедия

ДИАГНОСТИКУМЫ (греч, diagnostikos способный распознавать) — взвеси обезвреженных микроорганизмов, используемые в качестве антигенов для серологических реакций. Опасность работы с живыми культурами, их способность к изменчивости и наличие широких антигенных связей делают целесообразным применение Д.— более стандартных и гомогенных препаратов, содержащих определенные антигенные компоненты.

С помощью Д. в реакциях агглютинации, пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) и др. выявляют специфические антитела в сыворотках людей и животных с целью постановки диагноза и изучения иммунного состояния организма.

Особенно широко используют Д. в лабораторных исследованиях при кишечных инфекциях. Однако общность антигенной структуры кишечных бактерий обусловливает наличие перекрестных реакций и требует дифференцированного выявления антител. С этой целью проводят избирательное подавление отдельных антигенов: с помощью фенола или формалина подавляют О-агглютинабельность, как предложили Феликс и Олицкий (A. Felix, L. Olitzki, 1928). Воздействуя спиртом по способу Вина и Зонтага или прогреванием по Кауффманну, получают O-диагностикумы с инактивированным жгутиковым антигеном. Еще более перспективно применение моно диагностикумов, принцип создания которых разработан Ф. Г. Бернгофом (1944). В этих препаратах содержится лишь один антигенный компонент, и они взаимодействуют только с определенными специфическими антителами.

Показана возможность сохранения свойств бактериальных Д. путем их лиофилизации (см.).

Д., применяемые для серодиагностики различных инфекций, принципиально сходны, однако отдельные виды этих препаратов имеют определенную специфику.

Общепризнано, что РПГА более чувствительна и специфична, чем бактериальная агглютинация. В качестве антигенов в РПГА применяют формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные антигенами, полученными по методам Буавена и Вестфаля.

Возможно также использование эритроцитарных Д. для выявления антигена в тканях, выделениях больных, экстрактах различных веществ и т. п. В этих случаях применяют эритроциты, сенсибилизированные антителами,— «антительные диагностикумы».

Вирусные Д. применяют в основном в реакции связывания комплемента (РСК), РТГА и реакции нейтрализации. Готовят их из вируссодержащих культуральных жидкостей, обработанных (инактивированных) различными способами.

Краткая характеристика основных Д. и сфера их применения представлены в таблице.

Имеются также экспериментальные препараты, используемые в научной работе: эритроцитарные колидиагностикумы, дифтерийные эритроцитарные Д., гемагглютинирующие антигены вирусов паротита, коревой Гемагглютинирующий антиген и др.

См. также Агглютинация , Серологические исследования.

Таблица. Краткая характеристика основных диагностикумов и цель их применения

Диагностикумы

Краткая характеристика

Цель применения (используется сыворотка обследуемого)

Бактериальные диагностикумы

Диагностикумы из бактерий семейства кишечных: шигелл Флекснера, Зонне, Ньюкасла; сальмонелл тифа (ОН, О), паратифа А и В, холеры су ис, тифимуриум, энтеритидис

Микробная взвесь (3 млрд. микробных тел в 1 мл), инактивированная 0,4—0,5% р-ром формалина

Постановка реакции агглютинации для уточнения клин, диагноза заболевания

Сальмонеллезные О-диагностикумы (2, 4, 7, 8, 9 и 3, 10)

Микробная взвесь, содержащая парциальный О-антиген (3 млрд. микробных тел в 1 мл),полученная из селекционированных штаммов, инактивированная 15% р-ром глицерина

Постановка реакции агглютинации для выявления О-антител при сальмонеллезах

Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы (а, b, с, d, eh, с, k, lv, gm, p, st и антигены второй фазы — 1, 2, 5, 6, 7)

Микробная взвесь, содержащая компоненты жгутикового антигена 1-й и 2-й фаз (3 млрд. микробных тел в 1 мл), полученная из селекционированных штаммов, инактивированная 0,5% р-ром формалина

Постановка реакции агглютинации для выявления Н-антител с диагностической целью и для установления заболевания в анамнезе

Vi-диагностикум

Микробная взвесь (3 млрд. микробных тел в 1 мл) из штаммов, содержащих Vi-фактор, обработанная 0,4% р-ром формалина и 0,6% р-ром хлорида кальция

Постановка реакции агглютинации для выявления брюшнотифозного бактерионосительства

Бруцеллезный единый диагностикум

Взвесь бруцелл в 12% р-ре поваренной соли, окрашенная в синий цвет и инактивированная 0,5% р-ром фенола

Постановка реакции агглютинации (реакция Райта и реакция Хаддлсона для выявления инфицированных людей и животных— см.Бруцеллез, методы исследования)

Туляремийный диагностикум

Микробная взвесь (25 млрд. микробных тел в 1 мл) вакцинного штамма, инактивированная 0,5% р-ром формалина

Постановка объёмно-капельной реакция агглютинации на стекле для серодиагностики и изучения иммунного состояния привитых

Лептоспирозные диагностикумы

Лиофилизированная микробная взвесь 11 штаммов наиболее распространенных серотипов

Постановка РСК для подтверждения клин, диагноза заболевания

Риккетсиозные диагностикумы

Корпускулярные антигены — взвесь риккетсий, выращенная в желточных мешках куриных эмбрионов или легочнориккетсиозный материал от зараженных грызунов, обработанный эфиром, целитом или при дифференциальном центрифугировании

Постановка реакции агглютинации для дифференциальной диагностики риккетсиозов

Эритроцитарные диагностикумы

Эритроцитарные диагностикумы из шигелл Флекснера — Зонне

Формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные антигенами Буавена, Вестфаля и др.

Постановка РПГА для уточнения клин» диагноза дизентерии

Эритроцитарный сальмонеллезный Vi-диагностикум

Формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном

Постановка РПГА для выявления брюшнотифозного бактерионосительства

Эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы (1, 2, 12; 1, 4, 12; 6, 7; 6, 8; 1, 9, 12; 3, 10 и комплексный)

1% взвесь формалинизированных эритроцитов, сенсибилизированных антигенами Буавена, Вестфаля и др.

Постановка РПГА для уточнения клин» диагноза заболевания

Лиофилизированный туляремийный эритроцитарный диагностикум

Формалинизированные лиофилизированные эритроциты, сенсибилизированные туляремийным антигеном

Постановка РПГА для уточнения клин., диагноза туляремии, а также реакции нейтрализации антител для обнаружения: антигена

Вирусные диагностикумы

Антиген вируса осповакцины

Сухой препарат живого вируса осповакцины, культивированного на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов

Постановка РПГА для выявления антигемагглютининов у больных и привитых

Аденовирусный специфический антиген

Готовят культивированием вируса 6 типа в культуре перевиваемых клеток А-1 (антиген, общий для всех аденовирусов)

Постановка РСК для выявления комплементсвязывающих антител в сыворотке больных

Диагностикумы клещевого энцефалита и этиологически сходных с ним заболеваний

Вируссодержащая суспензия мозга белых мышей, осветленная путем центрифугирования и инактивирования бета-пропилактоном

Постановка РСК и РТГА для уточнения клин, диагноза заболевания

Орнитозный антиген

Сухой препарат из кипяченых вируссодержащих желточных мешков куриных эмбрионов, экстрагированных эфиром, осажденных ацетоном и инактивированных мертиолатом

Постановка РСК для диагностики орни-тоза людей, птиц и животных

Гриппозный диагностикум сухой

Аллантоисная жидкость развивающихся куриных эмбрионов, инфицированных одним из штаммов вируса гриппа типа А, В или С, инактивированная формалином, мертиолатом. В связи с изменчивостью антигенной структуры вируса гриппа предусмотрена частая смена производственных штаммов

Постановка РТГА для уточнения клин., диагноза заболевания

Парагриппозный диагностикум типа 1, 2, 3 для РТГА, сухой

Культуральная жидкость (почки эмбриона человека), содержащая один из штаммов вируса парагриппа, обработанная твином-80, эфиром и мертиолатом

Постановка РТГА для уточнения клин, диагноза заболевания

Библиография: Зуев А. С. Бактериальный vi-диагностикум для выявления хронических носителей брюшнотифозных бактерий, Журн, микр., эпид, и иммун., № 2, с. 51, 1959, библиогр.; Зуев А. С., Новоселова А. И. и Ликина И. В. Разработка методики производственного изготовления О-диагностикумов и Н-монодиагностикумов и применение их при серодиагностике салмонеллезов, там же, № 3, с. 42, 1956; Иммунология и профилактика кишечных инфекций, под ред. С. И. Диденко, с. 180, М., 1962; Каральник Б. В. Эритроцитарные диагностикумы, М., 1976; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 172, М., 1973; Субботина Ю. Л. и д р. Серологическая диагностика сальмонеллезов и антигенные связи в реакциях с эритроцитарными и бактериальными О-диагностикумами, Журн, микр., эпид, и иммун., № 3, с. 19, 1970, библиогр.

Л. Б. Богоявленская.

xn--90aw5c.xn--c1avg

Иммунодиагностика

Иммунодиагностика

Иммунодиагностика - это определение возбудителя, его иммунологически активных дериватов или синтезированных в ответ на их внедрение факторов иммунного ответа организма, с помощью специфических иммунодиагностических препаратов.

Иммунодиагностические препараты, называемые просто диагностическими, бывают нескольких типов: антигенные, иммуноглобулиновые и антительные.

Антигенные диагностикумы - это диагностические препараты на основе микробов, либо вирусов, токсинов, грибов и пр. (микробо-вирусо-токсинные препараты), предназначенные для определения антител в прямых иммунологических реакциях либо антигена в непрямых.

Антительные диагностикумы - это диагностические препараты на основе глобулинов иммунных сывороток или антител, предназначенные для обнаружения антигена в прямых иммунологических реакциях или антител в непрямых.

Иммуноглобулиновые диагностикумы - это препараты на основе иммуноглобулинов нормальных сывороток, основанные на эффекторных свойствах молекулы ИГ. У ИГ на Fc- фрагменте есть рецепторы для связывания некоторых агентов, например, С3 компонента системы комплемента, белка А золотистого стафилококка, Т- и В- лимфоцитов, макрофагов и антител к иммуноглобулинам и пр. Эта связь осуществляется не по типу антиген-антитело, но бывает необходимым определять С-реактивный белок, проводить быструю индикацию стафилококка по белку А и пр. Для этих целей готовят иммуноглобулиновый диагностикум.

К настоящему времени разработано достаточно много как иммунореагентов, так и иммунологических реакций (более 200), требующих определенной систематизации.

Предлагаем нашу классификацию иммунологических реакций в сокращенном виде. При классификации иммунологических реакций необходимо уточнить: протекают они in vivo (в организме) или вне организма, в эксперименте (in vitro). Кроме того, иммунологические реакции должны быть поделены на клеточные - с участием лимфоцитов и гуморальные - с участием антител. Поэтому краткая (общая) схема иммунологических реакций может быть проиллюстрирована следующим образом:

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

протекающие in vivo. воспроизводимые in vitro

(реакции иммунитета) (иммунодиагностические)

гуморальные клеточные серологические клеточные

В данном разделе нас интересуют серологические реакции, воспроизводимые in vitro. Полная схема иммунологических реакций представлена в монографии В.А. Шамардина и др. (1989). Иммунологические реакции делятся нами по основному признаку: протекающие по типу антиген-антитело или по эффекторному типу. В данном разделе нас интересуют те реакции, которые протекают по типу антиген-антитело. Их следует различать по феномену, визуализирующему взаимодействие иммунореагентов (например, феномен агглютинации и пр.).

Реакции, основанные на определенном феномене, целесообразно делить на большие группы, имеющие общность характера взаимодействия (прямые, непрямые, осадочные, диффузионные и пр.) Такая схема отражена в таблице № 15 .

Таблица № 15.

Иммунодиагностические реакции, воспроизводимые in vitro

Феномены иммунодиагностических реакций

Агглютинации

Потребления

комплемента

Иммунофлюо-ресценции

Преципитации

Нейтрализации

Иммуноконъю-

гации

группы иммунодиагностических реакций

а. прямые

б. непрямые

в.торможения

г. сорбции

а.прямые

б. непрямые

в. торможения

а.прямые

б.непрямые

в.торможения

а. осадочные

б. диффузионные

а. гашения

действия

б.нейтрализа-ции

а. прямые

б.непрямые

в. торможение

Иммунологические феномены

Феномен агглютинации. Феномен основан на взаимодействии антител и антигенов с образованием характерного осадка (агглютината). При этом не менее, чем один из реагентов должен находиться в клеточной форме или быть в форме клеточного диагностикума.

К прямому методу следует относить все варианты взаимодействия клеток с антителами (агглютинация бактерий, эритроцитов, клеток тканей человека и пр.). К прямому методу относят разновидности РА микробов, агглютинации тромбоцитов, гемагглютинации и пр.

К непрямому методу относят все варианты взаимодействия антигена и антител, когда один из них находится в форме диагностикума (латексного, эритроцитарного, ализаринового, бентонитового, угольного и пр.). Непрямой метод составляют двухкомпонентные реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), варианты Ко-агглютинации, определение антигена в сорбированном виде (РОСА) и пр.

К методу торможения относят сложные многокомпонентные реакции, первым этапом которых является нейтрализация предполагаемого в исследуемом материале растворимого агента антисывороткой (либо антител исследуемой сыворотки - антигеном), вторым этапом - визуализация этого взаимодействия путем введения в смесь гомологичных диагностикумов (антительных, во втором случае – антигенных либо взвесь бактериального диагностикума). Результатом многоэтапных взаимодействий будет агглютинат. К методу торможения относят реакции: задержка прямой агглютинации и гемагглютинации (соответственно, РЗА, РТГА), варианты торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), подавления гемагглютинации непрямой (РПНГ), определения класса агглютинирующих антител (РОКА) и др.

К методу определения специфически сорбированного агента относятся сложные и многокомпонентные реакции, первым этапом которых является специфическое связывание антигена антительным диагностикумом (либо антител - антигенным диагностикумом), а вторым этапом - агглютинация комплекса антителами, во втором случае антигеном. К методу относятся реакции: непрямой метод Кумбса, определения гаптена (РОГ), угнетение непрямой гемагглютинации (РУНГА), реакция расклеивания эритроцитов (РРЭ).

Феномен потребления комплемента. Феномен основан на взаимодействии антител и антигена в присутствии комплемента

К прямому методу относят разновидности лизиса клеток при непосредственной реакции их с антителами в присутствии комплемента (бактериолиз, гемолиз, тромбоцитолиз и пр.).

К непрямому методу относят варианты лизиса нативных эритроцитов, нагруженных антигеном, за счет взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Непрямой метод представлен реакциями: непрямого бактериолиза (бактерии нагружены вирусом) и непрямого гемолиза (эритроциты нагружены антигеном).

К методу с индикаторной системой относят большую группу многокомпонентных, двух- или многосистемных реакций, основанных на лизисе индикаторных клеток. В качестве этих индикаторных клеток обычно используют гемолитическую систему (нативные эритроциты барана, нагруженные гемолитической сывороткой). Первым этапом является взаимодействие растворимых антигена и антител (один из компонентов находится в исследуемом материале) в присутствии комплемента. Второй этап - внесение индикаторной системы, по состоянию которой (лизис эритроцитов или нет) судят о наличии в исследуемом материале антител (или антигена). Метод составляют реакции: Борде-Жангу, потребления комплемента (РПК), варианты связывания комплемента (РСК) - в жидкой фазе и на плотной среде (в геле).

К методу торможения относят также группу реакций, на первом этапе которых проходит адсорбция комплемента комплексом антиген-антитело, что регистрируется на втором этапе, путем внесения клеточного антигена (торможение прямого метода) или диагностикума на нативных эритроцитах (торможение непрямого метода) либо гемсистемы на нативных эритроцитах барана. К методу относятся: реакция нейтрализации лизиса микроба (РНЛМ), торможения непрямого гемолиза (РТНГем), подавление связывания комплемента (РПСК).

Феномен иммунофлюоресценции. Феномен основан на взаимодействии клеток, адсорбированных на предметном стекле, с иммунными сыворотками, предварительно меченными флюоресцирующим красителем. Это приводит к характерному свечению комплекса при просмотре в люминисцентном микроскопе.

К прямому методу относят варианты непосредственного взаимодействия клеток (ткани, микробы и пр.) с мечеными антителами, например, реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФП), реакции иммунофлюоресценции в притертом препарате (РИФПП) и пр.

К непрямому методу относят варианты выявления взаимодействия комплекса антиген -антитело с помощью дополнительно внесенного меченого антительного диагностикума. К методу относятся реакции: целлюлозно-флюоресцирующих антител (РЦФА), иммунофлюоресценции непрямой (РИФН), иммунофлюоресценции с использованием бумажных дисков (РИФБД), иммунофлюоресценции комплемента (РИФК).

К торможению иммунофлюоресценции относят многокомпонентные реакции, которые основаны на конкуренции за взаимодействие с гомологичным антигеном меченых антител и антител исследуемой сыворотки - реакция тушения иммунофлюоресценции (РИФТ).

Феномен преципитации. Основан на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в жидкой фазе или в геле. Это приводит к образованию мелкодисперсного агрегата (преципитата).

К методам образования преципитата в жидкой фазе относятся реакции: пробирочная Крауса, кольцепреципитации Асколи, капилярной преципитации, флокуляции и различные осадочные реакции (Кана, Закс-Витебского и пр.).

Метод, основанный на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в геле, по принципу диффузии компонентов, составляют реакции: простая одномерная и двумерная диффузия, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и его модификации.

Феномен нейтрализации. Основан на регистрации реакции антител с патогенными агентами (микробами, вирусами и пр.) или с их токсинами. Это приводит к нейтрализации возбудителя или его болезнетворного действия на организм.

Метод иммобилизации представлен реакциями: иммобилизации трепонем, иммунного прилипания, иммобилизации холерного вибриона, ингибиции метаболизма микробов.

Метод гашения болезнетворного действия составляют: нейтрализация инфекционного действия (на животных, куриных эмбрионах и культурах тканей) с учетом результатов их взаимодействия по летальности, бляшкообразованию, гемагглютинации, гемолитическим свойствам токсина, некротическом действии токсина и пр.

Феномен иммуноконъюгации. Основан на взаимодействия растворимых антигенов и антител на твердой фазе. Обнаружение комплекса проводят по определению метки.

По природе метки феномен составляют несколько семейств: радиоиммунный (РИА), иммуноферментный (ИФА), иммуномагнитный (ИМА), иммуноспектральный (ИСА) и др.

К семейству радиоиммунных реакций относятся: варианты радиоиммунного анализа (РИА), иммунорадиометрического анализа (ИРМА), радиосорбционные тесты (РИСТ и РАСТ), твердый сэндвич-радиоиммунный тест (ТСРИТ) и др.

К семейству иммуноферментных реакций относятся: метод ферментативного усиления (МФУ), иммуносорбентный метод со связанным ферментом (ЕLISА), варианты сэндвич-иммуноферментного анализа (ТСИФА) и пр.

В свою очередь эти большие группы реакций следует дополнительно делить на прямые, непрямые и торможения (конкурентные пробы).

Разновидности иммунологических реакций

В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов).

Феномен агглютинации

Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).

Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо:

1. Растворитель- 0,85 % раствор хлорида натрия.

2. Известную 2 % бактериальную взвесь.

3. Исследуемую сыворотку.

  1. Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.

  2. Исследуемая культура.

  1. Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле.

1. Развернутый вариант РА.

В настоящее время реакция не применяется.

2. Капельный вариант РА.

Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.

Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле.

Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов.

Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат.

При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными.

Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать.

Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.

Диагностикумы

иммуноглобулиновые антительные антигенные

белковые небелковые

Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций.

1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Для постановки реакции необходимо иметь:

1. Диагностический препарат.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.

3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.

4. Инактиватор для исследуемых сывороток.

  1. Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.

Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах: в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант).

  1. Макровариант.

Постановка реакции осуществляется в 2 этапа.

1 этап. Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. Из первой лунки 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.

2 этап. Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу № 17).

  1. Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0,05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Таблица № 17.

Схема постановки развернутого варианта РНГА

Ингредиенты

Номера лунок и количество ингредиентов, в мл

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Исследуемая

сыворотка, 1:50

1,0

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Растворитель

-

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Полученные

разведения

1:50

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1:6400

1:12800

-

АЭД, 5 % взвесь

0,025

0,025

0,025

0,025

0,025

0.025

0,025

0,025

0,025

0,025

Результат РНГА

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

+

-

-

Титр РНГА

Титром РНГА является разведение сыворотки 1:3200

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Результаты РНГА учитывают по следующей схеме:

1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".

2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки.

3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки.

4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат.

Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка.

С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо.

Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД.

Реакция Ко-агглютинации (РКоА).

Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно.

Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин.

К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0,1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум.

На предметное стекло наносят две капли: первая капля - это испытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле.

Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана.

РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации.

Реакция не применяется.

РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы: РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный).

Метод выполняют в 4 этапа.

1 этап. Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА.

2 этап. Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель.

3 этап. Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

Таблица № 18.

Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1

Ингредиенты

Номера лунок и количество ингредиентов, мл

1

2

3

4

5

6

7

Известная сыворотка 1:100

1,0

-

-

-

-

-

Растворитель

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Полученные разведения

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

АЭД, 5 %

0,025

0,025

0,025

0,025

0,025

0,025

0,025

Экспозиция 45 мин при комнатной температуре

Результат РНГА

++++

++++

++++

++++

++++

-

-

Титр РНГА и рабочая доза антисыворотки

Титром антисыворотки является разведение 1:1600, а рабочая доза – (1:1600):3 = 1:533.

studfiles.net

I.Диагностические препараты.

Иммунобиологические препараты

для диагностики, профилактики и

лечения инфекционных заболеваний

Юрова В.А., Бутакова Л.Ю., Крафт Л.А., Куклина Н.В., Сазанская А.А., Карабасова Е.Б., Винникова Ю.В., Илинская Б.В., Прокопьев В.В.

Подписано в печать Бумага офсетная. Тираж: 500 экз.

Отпечатано в типографии: :;

ГОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию.

Иммунобиологические препараты

для диагностики, профилактики и

лечения инфекционных заболеваний

Учебное пособие для самостоятельной подготовки студентов к практическим занятиям по микробиологии

Барнаул, 2011

Рецензенты:

В учебном пособии изложены теоретические вопросы, касающиеся природы и использования иммунобиологических препаратов - диагно­стических и лечебно-профилактических: вакцин, сывороток, бактерио­фагов и др.

Студенты факультетов лечебного профиля (лечебного, педиатриче­ского, стоматологического) нуждаются в более глубоком изучении ме­ханизмов действия бактериологических препаратов, ответной реакции организма на введение вакцинных и сывороточных препаратов, ослож­нений, возникающих при использовании некоторых препаратов.

Иммунобиологические препараты для диагностики, профилак­тики и лечения инфекционных заболеваний: Юрова В.А., Бутако­ва Л.Ю., Крафт Л .А., Куклина Н.В., Сазанская А.А., Карабасова Е.Б., Винникова Ю.В., Илинская Б.В.. - Барнаул, 2002. - 46 с.

(с) Алтайский государственный медицинский университет, 2002

© Юрова В.А., Бутакова Л. Ю., КрафтЛ.А., Куклина Н.В., Сазанская

А.А., Карабасова Е.Б., Винникова Ю.В., Илинская Б.В., 2002

В профилактике, диагностике, лечении инфекционных заболеваний широко используются иммунобиологические препараты, изготавлива­емые из живых и убитых микроорганизмов (бактерий, риккетсий, виру­сов), продуктов их жизнедеятельности (токсинов), а также отдельных антигенов микробной клетки, извлеченных различными методами. Так­же для лечебных и диагностических целей используются сыворотки и специфические гамма-глобулины и иммуноглобулины. Кроме того, широко используются в диагностических и лечебных целях препараты бактериофагов.

Сведения о составе, получении, механизме действия иммунобиоло­гических препаратов необходимы врачу в его практической деятельнос­ти. Вместе с тем, возможность ознакомления с вновь созданными вак­цинными и сывороточными препаратами, особенностями их применения у практических врачей есть не всегда. Кроме того, в современных учеб­никах не полностью отражены вопросы, касающиеся получения, меха­низма действия и использования иммунобиологических препаратов.

Все вышесказанное привело к необходимости создания учебного по­собия, содержащего сведения об иммунобиологических препаратах. Дан­ное пособие включает информацию о получении, активном начале, при­менении иммунобиологических препаратов, об осложнениях, возника­ющих при использовании некоторых из них. Пособие предназначено для подготовки студентов третьего курса лечебного, педиатрического, сто­матологического и медико-профилактического факультетов к практи­ческим занятиям по частной микробиологии.

Классификация иммунобиологических препаратов

  • Препараты, содержащие антигены - диагностикумы, аллергены,токсины.

  • II.Лечебно-профилактические препараты.

Раздел I

Диагностические препараты

Диагностические препараты используются при лабораторной диаг­ностике ряда заболеваний, точный диагноз которых может быть постав­лен только при помощи бактериологических и вирусологических иссле­дований. Кроме того, диагностические препараты необходимы при под­тверждении лабораторными методами диагноза заболевания, имеюще­го атипичное течение, либо заболевания, характеризующегося полимор­физмом симптомов. Помимо этого, диагноз заболеваний, не встреча­ющихся на данной территории и в данное время, должен быть обяза­тельно подтвержден лабораторными методами.

В диагностике инфекционных заболеваний широко применяются мик­робиологические приемы диагностирования. При этом используются бак­териологический, вирусологический, серологический, аллергический,им­мунологические методы диагностики, а также методы молекулярной гиб­ридизации и ПЦР. Для каждого из этих методов необходимы опреде­ленные диагностические иммунобиологические препараты: диагностикумы, диагностические сыворотки (видовые, типовые, комплексные, ад­сорбированные и др.), комплемент, аллергены, бактериофаги, системы для проведения РИФ и ИФА, зонды нуклеиновых кислот.

Классификация диагностических препаратов

1.Препараты, содержащие антитела - диагностические сыво­ротки:

  • агглютинирующие;

  • преципитирующие;

  • антитоксические;

  • гемолитические;

  • противовирусные;

  • люминесцирующие;

  • антиглобулиновые.

2.Препараты, содержащие антигены:

2.1) диагностикумы:

2.1.1.бактериальные;

2.1.2.эритроцитарные;

2.1.3.вирусные;

2.2.)токсины;

2.3.)аллергены.

3. Диагностические бактериофаги.

1. Диагностические сыворотки

В диагностике инфекционных заболеваний широко используют­ся иммунные реакции для идентификации микроорганизмов (бактерий и вирусов) или токсинов. Для постановки таких реакций необходимы специфичес­кие диагностические сыворотки.

1.1. Агглютинирующие сыворотки.

Агглютинирующие сыворотки получают путем иммунизации кроли­ков взвесью убитых микроорганизмов или их антигенов с последующим взятием у них крови и приготовлением сыворотки. Агглютинирующие сыворотки применяют для идентификации микроорганизмов в реакции агглютинации. Недостатком таких сывороток является то, что они спо­собны давать групповые реакции агглютинации, т.к. они содержат ан­титела к бактериям, имеющим общие антигены. Поэтому, в настоящее время большинство сывороток используется адсорбированными , Ад­сорбированные сыворотки содержат только типовые или видовые ан­титела, соответствующие определенному типу или виду антигена. Для получения таких сывороток применяют метод Кастеллани - метод ад­сорбции. Этот метод заключается в истощении сыворотки на групповые агглютинины путем насыщения ее родственными гетерогенными бакте­риями. При этом происходит адсорбция групповых антител, а специ­фические антитела остаются в сыворотке. Таким путем можно получить монорецепторные сыворотки - сыворотки, содержащие антитела толь­ко к одному антигену, и поливалентные сыворотки, дающие реакции аг­глютинации с двумя-тремя родственными бактериями, имеющими об­щий антиген. Титром агглютинирующей сыворотки называется то ее на­ибольшее разведение, при котором идет реакция агглютинации.

Агглютинирующие сыворотки широко применяют, например, при диагностике заболеваний, вызываемых эшерихиями, сальмонеллами и другими представителями семейства энтеробактерий.

1.2. Преципитирующие сыворотки.

Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов ан­тигенами бактерий, их экстрактами и токсинами. Титром преципитирующей сыворотки называется то максимальное разведение антигена, при котором идет реакция преципитации. Преципитирующие сыворотки вы­пускаются с высоким титром - не менее 1:100000. Это связано с тем, что антиген, определяемый в реакции преципитации, имеет мелкодис­персную структуру и в единице объема его может содержаться больше, чем в таком же объеме сыворотки - антител.

Специфические преципитирующие сыворотки применяются при ди­агностике инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляре­мия, дифтерия, и др.), в судебно-медицинской экспертизе для определе­ния видовой принадлежности белка, в санитарной практике для обнару­жения соответствия белковых веществ в продуктах (при подозрении на фальсификацию).

Реакция преципитации может быть поставлена в виде кольцепреци-питации или реакции преципитации в геле.

1.3.Гемолитические сыворотки.

Гемолитические сыворотки получают путем иммунизации кроликоввзвесью эритроцитов барана. Титром сыворотки называют то ее макси­мальное разведение, которое в присутствии комплемента вызывает ге­молиз 3% взвеси эритроцитов барана. Гемолитические сыворотки ис­пользуют для титрования комплемента и при постановке реакции свя­зывания комплемента в индикаторной системе.

1.4.Противовирусные сыворотки.

Иммунные противовирусные сыворотки получают путем иммуниза­ции различных животных в зависимости от вида вируса. Например, сы­воротку против аденовирусов получают иммунизацией кроликов, сыво­ротку против вируса гриппа - иммунизацией белых хорьков и т.д.

Диагностические противовирусные сыворотки используются для оп­ределения вида или типа вируса в РТГА, РСК., РН.

1.5.Люминесцирующие сыворотки. Люминесцирующие сыворотки представляют собой иммунные сы­воротки, содержащие специфические антитела, меченые флюоресциру­ющими красителями. При приготовлении люминесцирующих сыворотокпроводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сывороткиразличных флюорохромов путем прочной химической связи. Люминес­цирующие сыворотки используют при постановке РИФ.

1.6. Анпшглобулиновые сыворотки.

Антиглобулиновые сыворотки (АГС) содержат антитела к иммуног­лобулинам сыворотки человека или кролика - в зависимости оттого, ка­кая иммунная сыворотка используется в реакции. АГС получают путем иммунизации животных иммуноглобулинами человека или кролика. Такие сыво­ротки используют для постановки непрямой РИФ, реакции ИФА, реак­ции Кумбса.

studfiles.net

диагностикумы, аллергены, токсины. Получение. Применение — Мегаобучалка

Диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроор­ганизмов или определенные антигены. Необходимость использования диагностикумов для сероло­гических реакций связана не только с явным их преимущест­вом перед живыми культурами микробов (безопасность в ра­боте), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувст­вительностью к антителам и способностью длительно сохра­нять антигенные свойства.

Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещест­ва, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко.

Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации.

Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с ад­сорбированными на них антигенами, извлеченными из бакте­рий, и применяются в РПГА.

Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК, РТГА и РН.

Аллергены — диагностические препараты, предназначенные для выявления специфической сенсибилизации организма. Это очищенные фильтраты бульонных куль­тур, реже взвеси убитых микроорганизмов или АГ, выделенные из них.

Кожные пробы.Инфекционные аллергены (в/к, н/к) вводят, как правило, внутрикожно или накожно, путем втирания в скарифицированные участки кожи. При внутрикожном способе в среднюю треть передней поверхно­сти предплечья специальной тонкой иглой вводят 0,1 мл аллерге­на. Через 28 — 48 ч оценивают результаты реакции ГЗТ, определяя на месте введения размеры папулы.

Неинфекционные аллергены(прик-тест, н/к, в/к) (пыльца растений, бытовая пыль, пищевые продукты, лекарственные и химические препараты) вводят в кожу уколом (прик-тест), накожно путем скарификации и втирания или внутрикожной инъекцией разведенного раствора аллергена. Результаты учи­тывают в течение 20 мин (ГНТ) по величине папулы (иногда до 20 мм в диаметре), наличию отека и зуда. Внутрикожные пробы ставят в случае отрицательного или сомнительного результата прик-теста. По сравнению с последним, дозу аллергена уменьшают в 100-5000 раз. Кожные пробы на наличие ГЗТ широко применяют для выяв­ления инфицированности людей микобактериями туберкулеза (проба Манту), возбудителями бруцеллеза (проба Бюрне), лепры (реакция Митсуды), туляремии, сапа, актиномикоза, и др.

Токсины, вещества бактериального происхождения, способные угнетать физиологические функции, что приводит к заболеванию или гибели животных и человека. В отличие от других органических и неорганических ядовитых веществ, токсины при попадании в организм вызывают образование антител.При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия, скарлатина) для определения напряженности иммунитета и восприимчивости детей используются в/к пробы с применением соответствующих разведенных токсинов. Положительная реакция (местное воспаление кожи в области введения токсина) обусловливается ядовитым действием токсина на ткани кожи. Отрицательный результат реакции объясняется нейтрализацией введенного в кожу токсина соответствующим антитоксином, содержащимся в иммунном организме в достаточном для этого количестве.Получают из токсигенных штаммов микробов (дифтерийная палочка или скарлатинозный стрептококк) методом посева на жидкую питательную среду (мартеновский бульон) с последующей фильтрацией через бактериальные фильтры. Из полученных токсинов готовят диагностические токсины Шика (дифтерийный) и Дика (скарлатинный)., в среднюю часть внутренней поверхности предплечья.

64. Иммунные сыворотки. Современная классификация сывороток. Получение , очистка, применение. Требования, предъявляемые к сывороточным препаратам.66. Антительные препараты – сыворотки, применяемые для диагностики инфекционных заболеваний. Способы получения. Применение.

Сыворотки иммунные диагностические - иммунные с-ки, содержащие Ат против одного (моновалентные, моноспецифические) или нескольких (поливалентные, полиспецифические) Аг.

Получают путем иммунизации животных (кроликов и др.) известными полноценными Аг. По достижении необходимого титра животных обескровливают, получают с-ку, в случае необходимости адсорбируют групповые Ат, определяют титр, стерилизуют, контролируют.

 

Для идентификации микробов широкое распространение получили агглютинирующие сыворотки.. Наиболее широкое применение получили агглютинирующие сыворотки против возбудителей кишечных инфекций (сальмонеллезные, дизентерийные), используются агглютинирующие сыворотки для идентификации дифтерийных микробов, бруцелл, лептоспир и др.

Применение агглютинирующих сывороток основано на способности многих микробов вступать в реакцию агглютинации с соответствующими им антителами.

Явление агглютинации, т. е. склеивание бактерий, впервые было отмечено в 1889 г. A. Charrin и G. Roger при действии иммунной сыворотки на синегнойную палочку. Наблюдения их были подтверждены и расширены И. И. Мечниковым (1891), который показал в опытах на синегнойной палочке, пневмококке и вибрионе Мечникова, что явление склеивания закономерно имеет место при взаимодействии бактерий с соответствующими им иммунными сыворотками.

Диагностические иммунные сыворотки применяют в различных иммунологических реакциях для установления вида, подвида или серотипа (серовара) возбудителя инфекционной болезни, определения различных антигенов в биологических материалах. В зависимости от характера иммунологических реакций различают агглютинирующие, преципитирующие, флюоресцирующие, гемолитические, меченные радиоактивными нуклидами, ферментами и другие диагностические сыворотки. В клинической практике широко применяют диагностические сыворотки для определения группы крови, проведения тканевого типирования, при аллогенных трансплантациях и переливаниях крови, для характеристики иммунологического статуса организма (определения классов иммуноглобулинов и др.).

 

67. Понятие об иммуномодуляторах. Принцип действия. Применение.

Иммуномодуляторы – вещества, оказывающие влияние на функцию иммунной системы, изменяющие активность иммунной системы в сторону повешения (иммуностимуляторы) или понижения (иммунодепрессанты) её активности.

К экзогенным иммуномодуляторам отно­сится большая группа веществ различной хи­мической природы и происхождения, оказы­вающих неспецифическое активирующее или супрессивное действие на иммунную систему, но являющихся чужеродными для организма. Антибиотики, левамизол, полисахариды, ЛПС, адъюванты.

Эндогенные иммуномодуляторы представляют собой достаточно большую группу олигопептидов, синтезируемых самим организмом, его иммунокомпетентными клетка­ми, и способных активировать иммунную сис­тему путем усиления функции иммунокомпетентных клеток. К ним относятся регуляторные пептиды: интерлейкины, интерфероны, гормоны тимуса.

Применение иммуномодуляторов: при первичных и вторичных иммунодефицитах различного происхождения, при онкологических болезнях, при транспланта­ции органов и тканей, при лечении иммуно­патологических и аллергических болезней, в иммунопрофилактике и лечении инфек­ционных болезней.

Созданы препараты, обладающие иммуномодулирующим действием: интерферон, лейкоферон, виферон.

69. Химиотерапевтические препараты. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Основные группы химиотерапевтических препаратов, механизм их антибактериального действия.

Химиотерапия — специфическое антимикробное, антипаразитар­ное лечение при помощи химических веществ. Эти вещества обла­дают важнейшим свойством — избирательностью действия против болезнетворных микроорганизмов в условиях макроорганизма.

Основоположником химиотерапии является П. Эрлих, который установил, что химические вещества, содержащие мышьяк, губительно действуют на спирохеты и трипаносомы, и получил в 1910 г. первый химиотерапевтический препарат — сальварсан (соединение мы­шьяка, убивающее возбудителя, но безвредное для макроорга­низма).

См. учебник

70. Антибиотики. Классификация антибиотиков по источникам получения и спектру действия. Механизм действия антибиотиков.

Антибиотики — химиотерапевтические вещества, продуцируемые микроорганизмами, животными клетками, растениями, а также их производные и синтетические продукты, которые обладают избирательной спо­собностью угнетать и задерживать рост микроорганизмов, а также подавлять развитие злокачественных новообразований.

megaobuchalka.ru

Серологические реакции в диагностике инфекционных болезней

Серологические реакции обозначают в соответствии с феноменами, сопровождающими образование комплекса антиген — антитело при взаимодействии различных по свойствам компонентов. Различают реакции агглютинации, преципитации и лизиса. 

Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации (РА) основана на применении корпускулярного антигена (взвесь бактерий, сенсибилизированных эритроцитов, частиц латекса и др.), взаимодействующего со специфическими антителами, в результате чего образующийся комплекс антиген — антитело выпадает в виде осадка. Эту реакцию широко применяют в лабораторной практике для серологической диагностики бактериальных инфекций и для идентификации выделенных микроорганизмов. 

РА используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза (реакции Райта, Хеддльсона), туляремии, лептоспироза (РАЛ — реакция агглютинации и лизиса лептоспир), листериоза, сыпного тифа (РАР — реакция агглютинации риккетсий), шигеллеза, иерсиниоза, псевдотуберкулеза и др. 

Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РИГА или РПГА). 

Для постановки этой реакции используют эритроциты животных (барана, обезьяны, морских свинок, некоторых птиц), сенсибилизированных антителами или антигеном, что достигается инкубацией взвеси эритроцитов и раствора антигена или иммунной сыворотки.

Диагностикумы, полученные на основе эритроцитов, сенсибилизированных антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами. Они предназначены для определения антител в серийных разведениях сывороток крови, например эритроцитарные шигеллезные диагностикумы, эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы. 

Соответственно диагностикумы на основе эритроцитов, сенсибилизированных специфическими иммуноглобулинами, называют антительными (иммуноглобулиновыми) диагностикумами и они служат для выявления антигенов в различном материале, например эритроцитарный иммуноглобулиновый дифтерийный диагностикум для РИГА, применяемый для выявления дифтерийного экзотоксина коринебактерий в жидкой питательной среде при посеве в нее материала из носа и ротоглотки. 

Реакцию гемагглютинации применяют для диагностики как бактериальных (брюшной тиф, паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), так и вирусных (грипп, аденовирусные инфекции, корь и др.) инфекций. По чувствительности и специфичности РИГА превосходит РА. 

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют для титрования противовирусных антител в сыворотках крови, а также с целью установления типовой принадлежности выделенных вирусных культур. РТГА можно применить для диагностики тех вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами. 

Принцип метода состоит в том, что сыворотка, содержащая антитела к конкретному типу вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность и эритроциты остаются неагглютинированными. 

Реакция торможения (задержки) пассивной гемагглютинации (РТПГА). 

В РТПГА участвуют три компонента: иммунная сыворотка, антиген (исследуемый материал) и сенсибилизированные эритроциты. 

Если в исследуемом материале есть антиген, специфически реагирующий с антителами иммунной стандартной сыворотки, то он связывает их, и при последующем добавлении эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, гомологичным сыворотке, гемагглютинация не наступает. 

РТПГА применяют для обнаружения микробных антигенов, для количественного их определения, а также для контроля специфичности РПГА. 

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

В качестве носителя антител (иммуноглобулинов) используют частицы латекса. РЛА является экспресс-методом диагностики инфекционных болезней, учитывая время проведения (до 10 мин) и возможность обнаружить антиген в небольшом объеме исследуемого материала. 

РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b, Neisseria meningitidis в цереброспинальной жидкости, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, для диагностики сальмонеллеза, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода составляет 1—10 нг/мл, или 10³—10⁶ бактериальных клеток в 1 мкл. 

Реакция коагглютинации (РКоА)

Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А стафилококков присоединять специфические иммуноглобулины. РКА — метод экспресс-диагностики — служит для выявления растворимых термостабильных антигенов в секретах человека и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Обнаружение специфических антигенов в составе ЦИК требует их предварительного осаждения из сыворотки крови. 

Реакция преципитации

В реакции преципитации (РП) в результате взаимодействия антител с высокодисперсными растворимыми антигенами (белки, полисахариды) образуются комплексы с участием комплемента — преципитаты. Это чувствительный тест, используемый для выявления и характеристики разнообразных антигенов и антител. Простейшим примером качественной РП является образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку — реакция кольцепреципитации. Широко применяют различные разновидности РП в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез). 

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на феномене гемолиза с участием комплемента, т.е. способна выявлять только комплементсвязывающие антитела. 

РСК широко применяют для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций, риккетсиозов, хламидиозов, инфекционного мононуклеоза, протозойных инфекций, гельминтозов. РСК является сложной серологической реакцией, в которой участвуют две системы: исследуемая (сыворотка крови), представленная системой антиген — антитело и комплементом, и гемолитическая (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). Гемолитическая сыворотка представляет собой инактивированную прогреванием сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Она содержит антитела против эритроцитов барана. 

Положительный результат РСК — отсутствие гемолиза — наблюдают в случае, если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену. При этом образовавшийся комплекс антиген — антитело связывает комплемент, а в отсутствии свободного комплемента добавление гемолитической системы не сопровождается гемолизом. В случае отсутствия в сыворотке антител, соответствующих антигену, образования комплекса антиген — антитело не происходит, комплемент остается свободным и сыворотка вызывает гемолиз эритроцитов, т.е. наличие гемолиза — это отрицательный результат реакции.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

medbe.ru


Смотрите также