Иммунологические методы исследований. Диагностические тесты выявления антигенов антител


Иммунологические методы исследований - Биоветлаб

Лабораторная диагностика гипотиреоза у собак

Гипотиреоз считается достаточно широко распространенной эндокринной патологией у собак. Основными причинами первичного гипотиреоза являются лимфоцитарный тиреоидит и идиопатическая ... читать подробнее

АКТГ - адренокортикотропный гормон

Адренокортикотропный гормон (АКТГ) - пептидный гормон передней доли гипофиза. Он отвечает за стимуляцию, биосинтез и секрецию гормонов коры надпочечников, в ... читать подробнее Рыболовный интернет-магазин

Это  диагностические лабораторные  методы, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител.  Широко  используются  для  выявления  возбудителей  инфекционных  и паразитарных  заболеваний,  определения гормонов,  беременности,  видовой принадлежности  белков,  опухолевых  антигенов,  диагностики  аутоиммунных   болезней,     для  определения  групп  крови  и  совместимости  переливаемой  крови.  Иммунологические  исследования  позволяют  не только  идентифицировать  различные  вирусные, бактериальные или   паразитарные заболевания,  но  также  определять  титры  антител к ним,  что  позволяет   оценивать   устойчивость  организма  к  отдельным  видам  инфекционных  болезней и  прогнозировать  их  развитие.   С  помощью  иммунологических  методов  изучают  иммунитет  по отношению к массовым инфекциям,  например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

В  основе  этих  методов  исследований  лежит  реакция  «антиген-антитело»   с  образованием  иммунных  комплексов,  которые  можно  обнаружить  в  сыворотке  крови  (в  пробирке)  различными  методами.

Антиген - это вещество, которое «узнается» организмом животного как чужеродное, и которое может запускать иммунную (защитную) реакцию.  Антигенами  могут  быть  бактерии, вирусы,  грибы, паразиты,  а  также  любые другие  вещества  из  внешней  или  внутренней  среды   (пыльца растений,    белки  трансплантатов   тканей   и  органов,  поверхностные  белки клеток крови при  ее  переливании  и  другие  соединения).  В  некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов.    Одним  из  главных  способов,   с  помощью  которого  организм  защищается  от  проникновения  антигенов,   является  выработка  антител.  

Антитела   (иммуноглобулины — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)  - это белки, которые образуются клетками организма животного в ответ на внедрение в него антигена.   Антитела образуются  против не  всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившие название антигенных детерминант. Наиболее важным свойством антител является их способность специфически (то есть избирательно) связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело «узнает» и связывается только с  одним  определенным антигеном.  Кроме  этого  возможно  получение  искусственным  путем  антител,  которые  будут  специфически  связываться  с  другими  антителами, что  широко  используется  для  создания  различных  диагностических  тест систем.  Сыворотка  крови,  содержащая  антитела  к  другим  антителам  называется  антисывороткой. 

Таким  образом,  высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа. 

С  помощью  иммунологических  исследований  решаются  две  основные  задачи:

  1. Определение  антигенов.  Когда  неизвестным  компонентом  реакции  является антиген. Для его  обнаружения в  исследуемом  материале  используют диагностические иммунные сыворотки крови, содержащие  высокоспецифичные  антитела, которые  были  получены от животных после их вакцинации определенными антигенами. 
  2. Определение  антител.  В этом случае неизвестен состав антител в сыворотке крови. Их определяют по взаимодействию с заведомо известными антигенами (диагностикумами – стандартными препаратами, используемыми в качестве антигена в  иммунологических  или,  как  их  еще  называют, серологических реакциях). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител (иммуноглобулинов), специфичных  к  примененному антигену.

При   исследовании  антител  к  инфекционным  заболеваниям,  например  к  лептоспирозу  или  токсоплазмозу,  достоверные результаты получают при исследовании «парных» проб сывороток. Сначала  анализируют кровь  больного,   взятую  в первые дни заболевания. Затем, через 10 – 14 дней, изучают повторную пробу  и  на  основании  динамики нарастания антител  ставят  окончательный  диагноз. 

 Иммунологические  реакции  протекают  в  две  фазы:

  1. Специфическое связывание   антител и антигенов. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут.
  2. Неспецифическое проявление реакции, характеризующееся внешними признаками образования иммунных комплексов антиген-антитело.  Эта фаза может развиваться в течение нескольких минут или часов.

Внешние проявления некоторых реакций зависят от свойств антигена (размеры частиц, физико-химическое состояние), класса и вида антител, а также условий проведения теста (консистенции среды, концентрации солей, рН, температуры), в том числе от методов постановки «меток» на образовавшийся иммунный комплекс.

В  зависимости  от  механизма  и  учета результатов   иммунологические методы  исследования  подразделяют  на:   реакции,  основанные  на  явлении  агглютинации;  реакции,  основанные  на явлении преципитации;  реакции с участием комплемента;  реакции нейтрализации,  реакции с использованием химических и физических методов (иммуноферментный  и  иммунофлюоресцентный  анализы).

Реакция  агглютинации. 

В этой  реакции  антигенами  являются  крупные  частицы  - микробные  клетки,  эритроциты, лейкоциты  и  т.д.,  которые склеиваются антителами и выпадают в осадок  на дно пробирки  в  виде  иммунных комплексов в форме хлопьев или зерен, видимых невооруженным глазом.   Это  возможно  благодаря особенностям строения  молекулы  антител, которые  имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками - по одному на конце каждой из двух “ветвей”. Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены.   Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок.  На  этом  основано  определение  групп  крови и  совместимости  переливаемой  крови  перед  гемотрансфузией,  когда  эритроциты  склеиваются  антителами  той  или  иной  специфичности. 

При  диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух направлениях:

  1.  определяют вид выделенного от больного животного микроба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки,  содержащей  специфические  антитела;
  2.  обнаруживают антитела в сыворотке больного животного, используя стандартный микробный диагностикум,  включающий  антигены.  Титром агглютинирующей  сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.

Для  обнаружения   лептоспироза  у  животных  и  человека  используют  реакцию  микроагглютинации  (РМА), которую  проводят    на специальных  планшетах  в  микрообъемах.  При  этом  легко наблюдать  образование клеточного  осадка  на  дне  лунки.

Отличаясь  чувствительностью,  реакция  агглютинации  также  используется  для  идентификации  антител  к  растворимым,  мелкодисперсным  антигенам.   В  этом  случае  она  называется  реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации  (РНГА).   Для  этого  антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах или частицах латекса.  Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки крови, содержащей антитела к данному антигену.

Реакция  преципитации.

Преципитация  или  осаждение  иммунных  комплексов  происходит   вследствие взаимодействия антител с растворимыми антигенами.   В  результате  чего  происходит  их  агрегация, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата).  Различные разновидности реакции преципитации  проводят  либо  в  жидкой  среде,  либо  чаще  всего  в  твердых  гелях агара.  Метод,  основанный на  реакции  преципитации,  также  называется  методом  иммунодиффузии. 

Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки, вырезанные  в  агарозном  геле, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.   Этот  метод   используется  для  диагностики  инфекционного  гепатита  у  животных. 

Иммунологические  методы  с  использованием  химических  и  физических  меток. 

Эти  методы  обладают  высокой  чувствительностью  и  специфичностью,  и  нашли  широкое  применение  в  лабораторной диагностике болезней  животных  и  человека. 

Иммунофлюоресцентный анализ   основан на использовании  антител  меченных флюоресцирующими веществами  (флюорохромами).  Меченые антитела связываются с антигеном, образуя  иммунные комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии.  Этот  метод  часто  используют  в  иммуногистохими,  т.е.  для  определения  локализации антигена  в  клетках  и тканях.  При  этом  можно  установить  распределение  антигена  в  тканях  и  клетках.  С  другой  стороны  иммунофлуоресценция  позволяет  обнаружить  антитела,  направленные  к  известному  антигену  данной  ткани  или  клетки.  Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа:  прямой, непрямой  и  конкурентный. 

Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для выявления антигенов, например,  вирусов в зараженных клетках,  обнаружения бактерий и риккетсий в мазках, а также различных клеточных антигенов. Так, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета.

Непрямая иммунофлюоресценция  -     материал,  содержащий  известный  антиген, переносят  на предметное стекло  и инкубируют в присутствии исследуемой сыворотки крови для образования иммунных комплексов, а затем после отмывания не связавшихся реагентов выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей антисывороткой. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. 

Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

Иммуноферментный  анализ - наиболее  надежный,  экономичный  и  высокочувствительный  метод,  применяемый  для  количественной  оценки  антител  и  антигенов.  Его  отличает  простота проведения реакции, возможность инструментального учета и автоматизации всех ее этапов.

Внедрение  в  лабораторную  практику  иммуноферментного  анализа   позволило   значительно   расширить  возможности  диагностики  инфекционных  заболеваний,  аутоиммунных   и  гормональных  нарушений. 

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

ИФА  основан на использовании антител, конъюгированных или связанных с ферментами, в  основном   пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой.  Комплексы  антител  с  ферментами  называются  конъюгатами.  Механизм  реакции  при  определении  антигена  заключается в  следующем:

На твердый носитель, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют  антитела к искомому  веществу  или  инфекционному  агенту. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. Затем  несорбированные белки отмывают специальным раствором и в лунки добавляют  исследуемый  материал, например  сыворотку  крови,  где  находятся  искомые  антигены (вирусы  или  бактерии и т.д.).  Антитела, закрепленные на пластиковой подложке, «подбирают» антигены, присутствующие в крови пациента, специфически  с  ними  связываясь.  Затем добавляют антитела, связанные с ферментом - конъюгаты. Оставшиеся молекулы сформируют «сэндвич», состоящий из следующих слоев: фиксированное на подложке антитело —антиген — связанное с ферментом антитело.

Чтобы обнаружить  образовавшиеся иммунные  комплексы, т.е. соединения  меченых  антител с антигенами,  добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к антителам ферментом.  После добавления в данную систему хромогенного субстрата последний расщепляется ферментом конъюгата, в результате чего изменяется цвет раствора в лунке.

Интенсивность окрашивания пробы исследуемого материала прямо пропорциональна содержанию в ней искомого антигена. Учет интенсивности реакции опытных и контрольных проб проводят  на  основании  измерения  оптической  плотности на специальных  приборах  - спектрофотометрах.  Чем выше оптическая плотность  в данной ячейке, тем большее количество специфических антител содержится в пробе.

Описанная  выше  последовательность  проведения  реакции  называется  «сандвич» вариантом  ИФА. 

В  случае,   когда  неизвестным  компонентом    является  антитело,  первая реакция происходит между искомым  антителом   и очищенным антигеном возбудителя,  фиксированным  на  поверхности лунок планшета.   Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую реакцию, в которой в качестве антигена выступает специфически  связавшееся  антитело, а в качестве антител к нему — конъюгат.  Это  вариант  непрямого  иммуноферментного  анализа.  Например,  с  помощью  этого  вариант  ИФА  определяют  антитела  к  токсоплазмозу - паразитарному заболеванию кошек, собак и человека.

В  последнее  время   все  более  широкое  распространение  в  ветеринарии  получили  экспресс-тесты  диагностики  инфекционных  заболеваний.   Экспресс-тесты  не требуют специальной длительной  подготовки  проб, просты  в применении,   отсутствует  необходимость  в  использовании  дополнительных  реагентов  и  оборудования, поскольку все иммунореагенты находятся в составе тест-кассеты. время  исполнения анализа  не  более  -  15-25 минут. И в то же время этот метод достаточно надежен - достоверность достигает 92-98%.  Их  можно  применять в  любом  месте:  в кабинете, при  выезде  на  дом, в лаборатории. Иммунохроматографические диагностические методы являются позднейшей разработкой, отвечающей всем требованиям, и наиболее широко используемыми в мире диагностическими экспресс-методами.  

От наличия возможности быстро обнаружить возбудителя  инфекционного заболевания может зависеть здоровье и жизнь животного, поэтому  быстрая  диагностика  позволит назначить адекватное лечение в минимальные сроки.

Принцип  работы   экспресс-тестов  основан  на  методе  иммунохроматографии (ИХА),  сущность  которого  заключается  в  следующем:  при  нанесении  исследуемого  образца  жидкости (сыворотка  крови, смывы со слизистых)  на  специальную  нитроцеллюлозную мембрану    на  которой закреплены специфически связывающиеся агенты (антитела или антигены),  раствор с исследуемым биологическим материалом проходит вдоль мембраны  за  счет  капиллярных  сил.  В  случае  присутствия  в  исследуемом  материале  тестируемого  антигена   или  антитела  происходит    связывание  с  агентами  на  подложке (мембране).   В  результате  чего  на  мембране   появляются одна или две четко окрашенные полосы, свидетельствующие о негативном или позитивном результате теста.

В настоящее время существуют экспресс-тесты для диагностики ряда заболеваний, таких как:   парвовирусный  энтерит  собак,  чума  плотоядных,  панлейкопения  кошек,  вирусный иммунодефицит  кошек,  вирусная лейкемия  кошек, калицивироз кошек,  дирофиляриоз,  анаплазмоз,  болезнь  Лайма,  а  также  некоторых  гормонов   и   ферментов. 

Еще  одним иммунологическим  методом   с  использованием  нитроцеллюлозной  мембраны  является  иммуноблотинг.  Сначала   сложные  смеси  белков,  например,  с  поверхности  вирусной  оболочки,  разделяют  методом  электрофореза в полиакриламидном  геле. Затем  разделенные  белки  переносят  на  нитроцеллюлозную  мембрану. Далее  не специфически  связанные с  мембраной  антигены  могут  быть  идентифицированы  с  помощью  меченых  антител.  Данный  метод  получил  широкое  распространение  в  лабораторной  диагностике  заболеваний  человека  (например  ВИЧ-инфекции),  а  также  в  научно  исследовательских  работах. 

Таким  образом,  иммунологические методы,  используемые в   клинической практике  и  экспериментальных исследованиях,  очень  разнообразны.  Многие  из  них  являются  методами  экспресс-диагностки  и  позволяют  в  кратчайшие  сроки  провести  анализы  на  инфекционные  заболевания  или  оценить  иммунный  статус   животного  или  человека. 

Светлакова Е. С. Ветеринарный врач-лаборант лаборатории «BIOVETLAB».

ПОХОЖИЕ ПУБЛИКАЦИИ

Заболевание вызывает микроскопический паразит Otodectescynotis, паразитирующий у нескольких видов животных, таких как собаки, кошки, хорьки. Продолжительность жизни взрослого клеща составляет около 2 месяцев. В процессе жизнедеятельности паразит питается кожными чешуйками, серой и отделяемым сальных желез слуховых проходов. У человека при контакте с питомцем, зараженным клещом, может возникать зудящая сыпь на теле, быстро проходящая при уничтожении паразитов на животном.

Отит – это общее название воспалительных заболеваний ушей. В зависимости от того, какие отделы уха затронуты патологическим процессом, отиты делятся на наружный, среднего и внутреннего уха. У животных чаще регистрируют наружный отит, при котором воспаление затрагивает только наружный слуховой канал до барабанной перепонки. Средний отит у кошек и собак представляет собой воспаление полости, расположенной позади барабанной перепонки. При длительном течении заболевания регистрируется одновременное поражение среднего и наружного уха.

www.biovetlab.ru

Выявление антител в крови

Содержание статьи:

тест на антитела в кровиСегодня врачи, которые работают в лабораториях, уже знают, как правильно определить возбудители болезни. Это делается при помощи анализа выработанных антител иммунной системой человеческого организма.

Определение реакции антител на своеобразный возбудитель, который находится в составе крови называется еще серологическим методом. Он сформирован на процессе натуральных иммунных реакциях человеческого организма, который способен в определенное время вырабатывать антитела, такие как: IgG, IgM, IgA. Это естественная реакция на присутствие инфекции, и без выработки этих антител невозможно определить инфекцию и начать правильное лечение.

Выявление антител и их назначение

Основным материалом для исследования иммунной системы служит кровь человека. Таким образом, все процедуры могут быть косвенными и непрямыми, но в любом случае имеют отношение именно к крови.

Важно! Процедуры по выявлению антител направлены и на выявление ДНК болезни, а не только на определение ее вида или типа.

Определим некоторые заболевания, которые выявляет анализ на антитела:

  • Сифилис. Анализ на антитела широко применяются в диагностике этого заболевания, и дает всегда положительные результаты.
  • Также, при помощи антител, исследуются вирусы и вирусные болезни.
  • Герпес половых органов всегда определяется анализом на антитела.
  • Также, к вирусным заболеваниям, которые исследуются при помощи антител, относится гепатит и ВИЧ.

Отметим, тем не менее, что такой метод имеет определенные недостатки. Выработанные антитела способны сохраняться в составе крови еще некоторое время, даже после того, как лечение прекратится и будет диагностировано полное излечение пациента.

Как выявить антиген

анализ на антителаУчитывая, что каждое живое существо полностью уникально, начиная от бактерии и простейших и заканчивая человеком, то у каждого из них есть и свой уникальный белок или маркер, как его еще называют. Таким образом, в результате исследований и анализов составлена идеальная таблица антигенов, которые принадлежат строго к определённому виду инфекции.

Получается, что как только болезнь проникает в организм, иммунная система вырабатывает антиген, по которому можно определить, с чем мы имеем дело.

Если для исследования необходима не только кровь, но и мазок, а это бывает, требуется при исследовании на вероятность заболевания, передающегося половым путем, то биологический материал забирают для ПИФ (прямой иммунофлюоресценции).

Здесь мазок берется со стенки уретры, а у женщины с влагалища, уретра и шейка матки, таким образом, получается максимально корректное исследование.

Отметим плюсы метода:

  • Невысокий и приемлемый уровень стоимости.
  • Быстрота проведения анализа, в среднем необходимо буквально пару часов на получение результатов.

Из основных реакций, которые отмечаются при ммуннофлюрисценции, отметим:

  • РНИФ.
  • Агглютинация (РПГА, РГА).
  • Реакция, которая основана на связывании комплимента (РСК).

Важно! Также, к непрямой реакции иммуннофлюрисценции относится (ИФА), это иммуноферментный анализ, который позволяет обнаруживать в биологическом материале сопутствующие клетки.

Достоинства исследований на антитела

К достоинствам таких методов исследований человеческого организма и его крови, которые направлены на определение реакции антител, на присутствие соответствующего возбудителя или присутствия антигенов соответственных возбудителе, можно отнести тот факт, что при возникновении определенного количества спорных ситуаций — они способны показать врачам стадии заболеваний, а также их динамику.

Недостатки исследований

тест на антителаК недостаткам подобных исследований относится то, что в крови присутствуют так называемые “следы” инфекционных антигенов или подобных возбудителей. Антитела или антигены в организме сохраняются довольно долгое время после заражения.

Что касается таких инфекций, как СПИД или гепатит, то антитела способны сохраняться еще очень долго. Такие периоды называются серонегативными, и они часто выступают причиной ложноположительных анализов.

Еще одна проблема, которая часто встречается при непрямых методах – это определенное количество специфических “следов” наличия бактерий. Это более для возбудителей, которые называются «вредными». Возбудители могут быть немного изменены, однако похожи, словно братья и сестры. Именно такие бактерии провоцируют выработку организмом одинаковых антител, а в результате, в анализе нереально точно определить, с чем именно врач сейчас столкнулся.

Примером такой ситуации может быть присутствие в составе крови антител Chlamidia trachomatis, которые при этом совершенно не связаны с влагалищным хламидозом. Антитела в этом случае могут быть вызваны присутствием другой формы хламидии (Chlamidia pneumonia) – это легочная форма.

 

ЧИТАЙТЕ ТАК ЖЕ

rodinkam.net

исследование сыворотки на наличие антител с применением желатина. — КиберПедия

Оборудование и реактивы:

· 10% раствор желатина

· тест-эритроциты для скрининга антител

· раствор натрия хлорида 0,9%

· термостат лабораторный на +48°С или водяная баня на +48°С

· пробирки вместимостью 5-10 мл

· пипетки

· штативы

· часы (секундомер)

Порядок проведения исследования:

1. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

2. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.

3. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойств застудневать при температуре +4-8°С, желатин не пригоден.

4. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре +46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 минут.

5. В пробирки, по извлечении их из водяной бани или термостата, наливают 5-8 мл раствора NaCl 0,9%. Содержимое пробирок перемешивают путем одно-двукратного перевертывания их и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

Трактовка результата:

Содержимое пробирок просматривают в проходящем свете.

Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.

Для этого каплю содержимого помещают на предметное стекло и просматривают под малым увеличением.

Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус-положительных эритроцитов и отсутствие с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в испытуемой сыворотке анти- D антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что антитела не выявлены.

Если антитела к антигенам эритроцитов выявлены, а специфичность их подтверждается в лаборатории, имеющей панель типированных эритроцитов, в антиглобулиновом тесте, то, зная их специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании крови специальным выбором донора. Если у больного выявлены антитела, но определить их специфичность невозможно, совместимость переливаний крови можно обеспечить индивидуальным подбором донора.

При обнаружении антител к антигенам эритроцитов выписывают ответ, который переносится в историю болезни.

Результаты исследования заносятся в регистрационный журнал с обязательным указанием серии, сроков вскрытия и сроков годности используемых реагентов.

Бланк ответа остается у больного, хранится в течение всей жизни и предъявляется при госпитализации.

Современным подходом к выполнению всего спектра иммуногематологических исследований является Гелевая технология. Метод основан на агглютинации эритроцитов в полиакриламидном геле, помещенном в микропробирки пластиковых диагностических карт. Гель может быть нейтральным, либо содержащим специфические моноклональные антитела или антиглобулиновый реагент.

Исследуемые эритроциты или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем диагностические карточки центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют осадок на дне микропробирки, в то время как агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля. Расположение агглютинатов в геле определяется силой агглютинации и положительный результат может быть оценен от 1+ до 4+. Размер частиц геля, специальный подбор моноклональных или поликлональных антител позволяет достичь наилучших результатов чувствительности и специфичности. А его прозрачность делает считывание результатов более надежными и позволяет интерпретировать самые сложные диагностические случаи.

Виды исследований, которые можно выполнить с помощью гелевой технологии:

· определение групп крови (прямая и двойная реакция)

· определение резус-принадлежности

· широкое типирование антигенов эритроцитов всех известных систем

· скрининг и идентификация аллоантиэритроцитарных антител

· диагностика аутосенсибилизации к антигенам эритроцитов

· индивидуальный подбор гемокомпонентов для переливания и пробы на совместимость

· диагностика посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных.

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик. Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты тестов могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для обучения в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод. Гелевый тест выполняется и оценивается по вышеприведенным правилам. Отсутствие этапов отмывание эритроцитов при выполнении непрямого антиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные данные.

 

5. Правила взятия крови у пациента и оформления документации.

Для иммуногематологических исследований кровь берется из вены в сухую чистую пробирку, на которой предварительно стеклографом (маркером) надписывается фамилия и инициалы пациента.

Количество зависит от объема исследований, но не менее 3-4 мл.

Сроки хранения крови перед исследованием: не более 72 часов при температуре +4-+8ºС.

 

С образцом крови в лабораторию передается направление, оформленное следующим образом:

Направление

cyberpedia.su

Иммунодиагностические реакции

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum —сыворотка и logos — учение),т.е. методы изучения  антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело,  определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз  болезни.

 Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых  антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др,

При выделении микроба от больного проводят  идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т,е.  сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих антимикробные антитела. Это так называемая  серологическая идентификация микроорганизмов.

Реакция агглютинации: Реакция агглютинации (от лат. oggiutinatio —  склеивание) — склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов. Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий),  «склеенных» антителами (рис. 7.37).  

Реакцию агглютинации  используют для: определения возбудителя, выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.

 1. Определение возбудителя, выделенного от больного

Ориентировочная реакция агглютинации нз стекле . К капле агглютинирующей сыворотки  (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от  больного. Образуется хлопьевидный осадок.

 Развернутая реакция агглютинации с возбудителем,  выделенным от больного .

К разведениям  агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного

 2.Определение антител в сыворотке крови больного :

Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного. К разведениям сыворотки больного  добавляют диагностикум.  

— Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие Q-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.

— Агглютинация с Н-диогностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) —  крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации  выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного зритроциторного диагностиками, который представляет собой эритроциты с  адсорбированными на них антигенами

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими  антителами сыворотки крови ,что вызывает  склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки ввиде фестончатого осадка. При отрицательной реакции  эритроциты оседают в виде «пуговки». РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым  добавляют эритроцитарный диагностикум.

 Иногда применяют антительный эритроцитарный  диагностикам — эритроциты, на которых адсорбированы  антитела, Например, можно обнаружить ботупиничес- кий токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют  реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА).

  Реакция Кумбса Реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются  неполными, одновалентными. Они специфически  взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не  вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют анти глобул и новую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов

С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом  эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных:  эритроциты резус-положительного плода соединяются с  циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной  матери.

Можно также выявлять неполные антитела против  антигенных микробов.

Реакция торможения гемагглютинации Гемагглютинины вирусов склеивают эритроциты. Это  свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов, что необходимо для  последующей постановки РТГА. Реакция торможения гемагглютинации основана на  блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов  антитепами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Реакция преципитации Реакция преципитации (от лат. praecipito — осаждать) — это формирование и осаждение комплекса растворимого  молекулярного антигена с антителами в виде помутнения,  называемого преципитатом. Он образуется при смешивании  антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток  одного из них снижает уровень образования иммунного  комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.   

Реакция кольцепреципитации, Реакцию проводят в  узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов об- эазуется непрозрачное кольцо преципитата . Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция  называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).  

Иммуноэлектрофорез — сочетание метода  электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью  электрофореза, затем в канавку геля параллельно зонам электрофорезавносят иммунную сыворотку. Антитела иммунной сыворотки диффундируют в гель и образуют в месте «встречи» с  антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) {от лат, floccus —  хлопья шерсти} — появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции  токсин—антитоксин или анатоксин—антитоксин , Ее применяют для определения активности антитоксической  сыворотки или анатоксина.

Штаммы возбудителя дифтерии — С, cliphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенны- МИ, Образование экзотоксина зависит от наличия в бактерияхпрофага, несущего tox-ген, кодирующий образование  экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью  реакции преципитации в агаре.

Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на  чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия  микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорято  нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о  специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

 

 Реакция связывания комплемента Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они  образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент  антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело . Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным

 РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней  гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и  гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз  сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет  (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело,  вызывая гемолиз (реакция отрицательная). РСК применяют для  диагностики многих инфекционных болезней, в частности  сифилиса (реакция Вассермана).

 Реакция иммунофлюоресценции Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, или метод Кунса). Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс- диагностики для выявления антигенов микробов или  определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с  антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лу- чах люминесцентного микроскопа (рис. 7.61). Бактерии в  мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой,  светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью а нти глобул и новой (против  антител) сыворотки, меченной флюорохромом. Для зтого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не  связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на  микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок а нти глобул и  новой {антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в  люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

 Иммуноферментный анализ  — выявление  антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-га- лактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции —  интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству  связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных  болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций,  гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов,  лекарственных препаратов и других биологически активных  веществ.Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из  компонентов иммунной реакции (антиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или  антигенов. При положительном результате изменяется цвет  хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания. I. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют  сыворотку крови больного, анти глобул и новую сыворотку,  меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

IT. При определении антигена  в лунки с  сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку  крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую  сыворотку против него и вторичные антитела (против  диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем  субстрат/хромоген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65).

Конкурентный ИФА для определения антител: искомые  антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с  другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

 Иммуноблоттинг —  высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИЧ>А или РИА). Иммуноблоттинг ислользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью  электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг — от англ. blot — пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА, Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»  антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного B). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител  больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов  человека, меченную ферментом C). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген 4- антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата D), изменяющего окраску под действием фермента.

 

 Полимеразная цепная реакция : основана на  амплификации, т.е. увеличении количества копий  специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют («расплетают» при нагревании) и достраивают (при  охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити. В результате из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно  повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание  новых комплементарных нитей ДНК происходит при  добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких од- нонитевых ДНК, комплементарных З'-концам ДНК искомого гена), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

 

dendrit.ru

7.6. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ И АНТИГЕНОВ

7.6. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ И АНТИГЕНОВ

Методы определения антител и антигенов основаны на различных способах регистрации их взаимодей-ствия. С некоторой степенью условности их можно разделить на 3 группы:— методы, основанные на реакции преципитации;— методы, основанные на реакции агглютинации;— методы, основанные на использовании меченых антител или антигенов.Методы, основанные на реакции преципитации. За счет мультивалентности антител и антигена при их смешивании образуется так называемая решетка, которая может содержать антиген и антитела в разных пропорциях. На основе реакции преципитации разработаны различные количественные методы.Двойная диффузия в агаре по Оухтерлони. В лунки, вырезанные в агаровом или агарозном геле, по-мещают антиген и антисыворотку, которые диффундируют навстречу друг другу. В том участке геля, где их соотношения эквивалентны, образуется видимый преципитат. Если анализу подвергается смесь антигенов, то образуется несколько линий преципитации. Если соседние лунки содержат один и тот же антиген, то линии преципитации сливаются. Если антигены разные, то образуется либо так называемая шпора, что свидетельству-ет о частичном родстве антигенов, либо, в случае неродственных антигенов, линии преципитации будут пере-секаться.Радиальная иммунодиффузия по Манчини. Этот метод отличается более высокой чувствительно-стью, чем предыдущий, так как антисыворотка входит в состав агара, в который из лунки диффундирует анти-ген. По мере удаления от лунки концентрация антигена постепенно падает, пока не становится эквивалентной концентрации антител в агаре. При этом образуется хорошо различимое кольцо преципитации. Чем выше кон-центрация внесенного антигена, тем больше диаметр кольца. Если в реакции используется несколько стандар-тов с известной концентрацией антигена, то путем сравнения или постройки калибровочной кривой можно проводить количественное определение антигена в образцах.Метод широко используется для определения концентрации иммуноглобулинов, C3-комплемента ком-понента, С-реактивного белка, а-фетопротеина, трансферрина. В Москве фирмой «Реафарм» выпускаются ста-ционарные иммунодиффузионные планшеты для определения содержания иммуноглобулинов различных клас-сов в крови или других биологических жидкостях. В табл. 11—13 приведены нормы показателей для этого ме-тода.Таблица 11. Концентрация иммуноглобулинов (г/л) взрослого человека в сыворотке крови в норме («Реафарм»)ИммуноглобулинДиапазон колебаний концентрацииIgG8—20IgA0,9—4,5IgM0,6—2,5Таблица 12. Концентрация иммуноглобулинов (г/л) в различных биологических жидкостях в норме («Реа-фарм»)ИммуноглобулинЦереброспиналь-ная жидкостьМочаСпермальная жидкостьIgG1,0-4,00,4—0,8140—330IgA1,5-60,15—0,251—60IgM<1,000Таблица 13. Концентрация иммуноглобулинов (г/л) в сыворотке крови детей в возрасте до 14 лет («Реа-фарм»)ВозрастIgGIgAIgMНоворожденные7,5—15,0<0,060,11—0,351—3 мес2,7—7,80,06—0;580,12—0,874—6 мес1,9—8,60,1—0,960,25—1,27—12 мес3,5—11,80,36—1,650,36—1,041—2 года5,2—10,80,36—1,650,72—1,63—6 лет6,5—14,10,83—2,170,55—2,17—9 лет7,6—13,31,08—2,00,55—1,69—13 лет7,7—15,11,08—3,250,7—1,5Иммуноэлектрофорез. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза с имму-нопреципитацией. Существуют различные варианты иммуноэлектрофореза. Если электрофоретической разгон-ке подвергают антиген, то после снятия напряжения вдоль направления движения антигена в электрическом поле в геле вырезают канавку, в которую заливают антисыворотку. С помощью данного метода путем анализа образовавшейся дуги преципитации в клинической иммунологии полуколичественно определяют концен-трацию иммуноглобулинов различных классов и идентифицируют миеломные белки.Для определения антигенов, мигрирующих в сторону положительно заряженного электрода, может применяться встречный Иммуноэлектрофорез. Этот метод высокочувствителен и занимает относительно мало времени. Его используют для идентификации антигенов вирусного гепатита В, антител к ДНК при СКВ, анти-тел к Aspergillus при бронхолегочном аспергиллезе, антител к N. Meningitidis.Для количественного определения концентрации некоторых белков (альбумина, трансферрина, церу-лоплазмина) применяют ракетный Иммуноэлектрофорез. При этом препарат, содержащий антиген, вносят в различных разведениях в серию последовательных лунок в геле, содержащем антисыворотку. После электро-форетической разгонки образуются дуги преципитации, напоминающие по своей форме ракету. С уменьшени-ем концентрации антигена будет соответственно уменьшаться и длина дуг.Для разделения сложной смеси антигенов используют двухмерный (перекрестный) электрофорез. Ме-тод включает два этапа. На первом этапе белки диффундируют под влиянием электрического поля в агарозном геле, содержащем антитела. На втором этапе пластину поворачивают на 90° и подвергают повторной разгонке в направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно охарактеризовать каждый из антигенов смеси. Этот метод, в частности, применяют для оценки степени конверсии C3 в инактивированную форму C3с в сыворотке крови больных СКВ или синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом.Методы, основанные на реакции агглютинации. Взаимодействие антител с клетками или другими крупными частицами приводит к склеиванию (агглютинации) в хорошо различимые агломераты. Прямая агг-лютинация чаще используется для определения серотипов бактерий или для определения групп крови. Приме-няется также метод непрямой (пассивной) агглютинации, когда на основе эритроцитов готовят диагностикум. С этой целью, как правило, используют эритроциты, нагруженные антигеном после модификации их поверхности танином или хлорным хромом. Существуют и другие методы связывания поверхности эритроцитов с антиге-ном.Реакцию обычно проводят в пластиковых планшетах, требующих сравнительно небольших количеств реагентов. Реакцию гемагглютинации часто используют для определения в сыворотке крови титров противо-микробных антител и различных аутоантител.Методы, основанные на использовании меченых реагентов. В настоящее время разработано много методов, предусматривающих применение меченых антител и антигенов. Чаще с этой целью используют ра-диоактивную или ферментную метку.Радиоиммунологические методы. В качестве метки чаще применяют радионуклиды йода (131I или 125I). Для определения антигенов обычно используют классический радиоиммунологический анализ (РИА). Ме-тод основан на уменьшении связывания антителами радиоактивно меченного антигена за счет добавления не-меченого антигена. Содержание последнего определяют по степени уменьшения такого связывания. Метод по-зволяет выявлять очень низкие концентрации антигена (до 10—12 г/мл).Метод часто используют для определения антигенов вируса гепатита, а также таких низкомолекуляр-ных белков, как, например, гормоны. Применяют также так называемые твердофазные методы. Для определе-ния антител антиген сорбируют на пластике (обычно в пробирках или лунках микропанели), затем, после свя-зывания с антителами, избыток последних удаляют и добавляют радиоактивно меченные антииммуноглобули-ны, полученные от животного другого вида. Этот метод весьма эффективен при диагностике аллергии. Аллер-ген, иммобилизованный на сорбенте, инкубируют с сывороткой крови больного, после чего добавляют радио-активно меченные анти-IgЕ-антитела.Метод иммунного окрашивания после переноса на нитроцеллюлозные мембраны (иммуноблот-тинг по Вестерну). Этот метод применяется для количественного определения белков и гликопротеинов, кото-рые после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле переносят на микропористую нитроцел-люлозную мембрану. Неспецифически связанные с мембраной антигены обрабатывают моноклональными ан-тителами, связывание которых проявляют с помощью радиоактивно меченных анти-Ig-антител. Визуализацию реакции осуществляют с помощью радиоавтографических отпечатков.Иммуноферментные методы. Иммуноферментные методы в силу своей безопасности и высокой чув-ствительности постепенно вытесняют радиоиммунологические методы. Кроме того, реагенты, к которым при-соединен фермент, обычно весьма стабильны и допускают более длительное хранение (радиоактивную метку приходится возобновлять из-за распада радионуклида).Чаще используют пероксидазу и фосфатазу, которые при добавлении к реагирующим компонентам со-ответствующего субстрата образуют окрашенные продукты. В случае определения антител антигены иммоби-лизуют на поверхности лунок пластиковых панелей. К ним добавляют исследуемую сыворотку. Связывание антител с антигеном определяют на втором этапе, инкубируя образовавшийся комплекс с меченными фермен-том анти-Ig-антителами (так называ емые вторые антитела). Далее, после промывки, добавляют раствор суб-страта, который, вступая в реакцию с ферментом, дает окрашивание. Интенсивность окрашивания будет зави-сеть от количества ферментной метки (чем больше свяжется меченых антител, тем ярче окрашивание). Резуль-таты учитывают фотометрически,В настоящее время выпускается большое количество разнообразных иммуноферментных диагностиче-ских наборов как для определения антител в сыворотке или других биологических жидкостях, так и для опре-деления антигенов. В качестве последних могут выступать возбудители различных заболеваний (микробы, ви-русы), а также различные белки, определение содержания которых в крови или секретах представляет диагно-стический интерес (аутоантитела, факторы неспецифической защиты, гормоны, цитокины, белки острой фазы и др.).

promedinfo.ru


Смотрите также