Иммуноферментный анализ (ELISA). Антивидовые антитела


Антитела антивидовые - Справочник химика 21

    Для определения специфичности гибридом используют, как правило, непрямой метод ИФА с использованием антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой. В нашем случае используются [c.320]

    АГ — иммобилизованный антиген АТ — определяемые антитела АЛТ—Е — конъюгат антивидовых антител с ферментной меткой [c.320]

    Антивидовое антитело Антиген —( 1Ь  [c.86]

    Метод является усложненным вариантом обычного двухцентрового или сэндвич -анализа, в котором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в него меченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную метку антивидовых антител. В качестве антивидовых (или вторичных) используют антитела, специфичные к глобулинам тех видов животных или птиц, которых иммунизировали антигеном для получения антисыворотки. Примером наиболее распространенных антивидовых конъюгатов являются меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека, меченые антитела козы (осла, барана и т. д.) против иммуноглобулинов кролика и т. д. [c.89]

    Для того чтобы меченые антивидовые антитела не связывались с иммобилизованными на поверхности, необходимо использовать при образовании сэндвич -комплекса антитела, полученные от разных видов животных (на схеме такие антитела обозначены каК [c.90]

    Данная схема является одной из наиболее распространенных-в ИФА антител, так как обладает всеми достоинствами сэндвич -метода, но отличается универсальностью меченого реагента, что дает возможность выявлять антитела к разным антигенам. Данный подход позволяет решать проблемы серодиагностики заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, используя ограниченный набор антивидовых иммуноферментных конъюгатов, что значительно облегчает задачу производства реагентов для ИФА. [c.91]

    Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антивидовых антиТел. Схема метода  [c.91]

    В связи с этим применение в анализе меченых антивидовых антител упрощает процедуру получения реагентов для анализа, так как позволяет, используя одни и те же конъюгаты, осуществлять определение разных антигенов и антител различной специфичности. Кроме того, чувствительность анализа ряда антигенов в этом случае может быть выше, чем при применении меченых специфических антител, вследствие возможности связывания не одной, а нескольких меченых молекул. Однако такой подход методически усложняет проведение анализа из-за введения дополнительных стадий инкубации и промывки носителя. [c.101]

    Для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммунопероксидазный комплекс (пероксидаза—антитела [c.190]

    В качестве примера приведем схему определения кроличьих антител против какого-либо антигена ПАП-методом. К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую пробу. После инкубации и отмывки несвязавшихся компонентов к носителю добавляют антивидовые антитела (например, сыворотку крови осла, иммунизированного IgG кролика). Проводят повторную инкубацию, отмывку и вводят в систему антитела кролика против пероксидазы. Смесь инкубируют, носитель отмывают и на последней стадии добавляют пероксидазу, образующую специфический комплекс с соответствующими антителами, который выявляют обычными методами. Одним из вариантов схемы является добавление на стадии 5) не антител против пероксидазы, а заранее приготовленного ПАП-комп-лекса. Схема метода  [c.103]

    Одним из подходов является проведение стадии узнавания определяемого соединения специфическими антителами в растворе и дальнейшее разделение компонентов путем перевода образовавшегося специфического комплекса в нерастворимое состояние. По приведенной выше классификации такие методы относятся к гомогенно-гетерогенным. Разделение компонентов чаще всего достигается с помощью образующих преципитат антивидовых антител. Возможно использование в качестве осадителя полиэтиленгликоля и других соединений. Недостатком метода является длительность процесса разделения, в ряде случаев лимитирующего время всего анализа, и необходимость тщательного подбора условий осаждения. [c.112]

    Конкурентный метод с использованием меченых антивидовых антител [c.251]

    Иммобилизованный антиген инкубируют с пробой, содержащей антитела, отмывают и добавляют антивидовые антитела, ковалентно связанные с биотином. Затем вносят авидин, образующий прочный комплекс с биотином, отмывают избыток белка и добавляют фермент с ковалентно пришитым биотином, который взаимодействует с другим центром связывания авидина. (Другим путе1 (1 является использование антивидовых антител, ковалентно связанных с авилином, что упрощает анализ и сокращает его длительность. [c.105]

    Вторая иммунохимическая стадия анализа включает взаимодействие меченых антивидовых антител со специфическим комплексом антиген — антитело, сформированном на носителе. Основные требования к этой реакции аналогичны рассмотренной ранее второй стадии сэндвич -метода анализа. Очевидно, что оптимальными являются условия, обеспечивающие линейную пропорциональность между концентрациями специфических антител в комплексе (которая изменяется от нуля до значения концентрации иммобилизованного антигена) и связавшихся с ними меченых антивидовых антител при минимальном фоновом сигнале. [c.254]

    Определение антител чаще всего проводят методом твердофазного ИФА, основанным на инкубации сыворотки с иммобилизованным антигеном, с последующим выявлением связавшихся специфических антител препаратом антивидовых антител, меченным ферментом. [c.262]

    Непрямой ИФА чаще всего применяют для количественного определения в сыворотке специфических антител, вырабатываемых против патогенов. В этом методе (рис. 2-13) лиганд или антиген, иммобилизованный на твердом носителе, инкубируют с анализируемым образцом, затем твердую фазу промывают и инкубируют с антивидовыми антителами к иммуноглобулинам, содержащими ферментную метку (Атг—Ф). После отделения твердой фазы измеряют активность связанного с ней фермента, которая прямо пропорциональна концентрации антител (Ат) в исследуемом образце. [c.27]

    Высокоспецифичным для диагностики ВИЧ-инфекции является метод иммунноблотинга (см. подразд. 1.4.5). При этом проводится электрофоретическое разделение вирусных белков с последующим перенесением их на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем мембрана обрабатывается исследуемой сывороткой. Заключительный этап исследования состоит в выявлении антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антивидовые меченые сыворотки. Индикацию образующихся иммунных комплексов проводят с использованием ИФА или РИА. Результаты иммуноблотинга считают положительными при обнаружении антител к определенным вирусным антигенам р24, рЪ1, а также к gpЛ или к gp]20. [c.308]

    В роли антигенов могут выступать и сами иммуноглобулины (антитела). В этом случае организм вырабатывает антитела, которые часто называют вторичными. Например, при иммунизации иммуноглобулинами другого вида животного вырабатываются вторичные (антивидовые) антитела. В иммуноферментном анализе существует большая группа методов (в том числе так iaзывaeмый метод двойных антител ), в которых используют ме-1енные ферментом вторичные антитела. [c.14]

    На первой стадии иммобилизованные антивидовые антитела связывают из раствора все антитела соответствующего вида. Наличие антител определенной специфичности в образовавшихся иммунохимических комплексах выявляют титрованием антигенсвязывающих центров конъюгатом соответствующего антигена с ферментом. Метод основан на выявлении из множества связавшихся с иммуносорбентом антител молекул только одной специфичности, поэтому возможность его эффективного применения снижается при способности меченого антигена к неспецифическому связыванию с иммобилизованными на носителе белками или адсорбировавшимися на них после первой инкубаций иммуноглобулинами. [c.92]

    Метод ОТНОСИТСЯ к гомогенно-гетерогенным, так как первая стадия взаимодействия антител с определяемым и меченым антигеном проходит в растворе. После установления в системе равновесия в раствор вносят носитель с иммобилизованными вторичными антителами, которые сорбируют образовавшиеся на первой стадии специфические иммунохимические комплексы. Часто отделение образовавшегося комплекса достигается за счет образования преципитата в присутствии растворимых антивидовых антител, необходимая для полноты осаждения концентрация которых предварительно должна быть точно подобрана. После проведения стадии отмывки несвязавшихся компонентов определяют ферментативную активность на носителе или в Преципитате. В литературе этот подход часто называют методом двойных антител (англ. double antibody assay). [c.98]

    Отметим, что ПАП-метод может быть формально отнесен к слассифицированным ранее методам с использованием меченых 1НТИВИД0ВЫХ антител, только в данном случае используется не ко- алентный конъюгат антивидовое антитело — фермент, а последо- ательно получаемый комплекс антивидовое антитело — антитело с пероксидазе — пероксидаза. Недостатком ЦАП-метода является длинение схемы анализа, частичное ингибирование пероксидаз- ой активности при образовании комплекса с антителами, возмож-юсть диссоциации комплекса антитело—фермент при разведениях, тромывках, изменениях pH и ионной силы среды. [c.104]

    Исследуемые антитела взаимодействуют с иммобилизованным штигеном. После промывки добавляют конъюгат антивидовых ан- ител с лектином в присутствий избытка специфического для лекти-[а углевода (например, метил-р-О-маннозида в случае конканава-[ина А) для предотвращения связывания лектина с углеводным сомпонентом антител и иммобилизованного антигену. [c.108]

    Данный подход находит широкое применение на практике, так как позволяет определять разные антигены (как MOHO-, так и полидетерминантные) с использованием одних и тех же меченых антител. Анализ проводят следующим образом. К иммобилизованному на носителе антигену добавляют определяемый антиген и специфические антитела. В процессе инкубации иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. В результате на носителе образуется комплекс антиген — антитело, концентрация антител в котором пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена. После удаления избытка несвязавшихся компонентов к носителю добавляют меченые ферментом антивидовые антитела, образующие комплекс со специфическими антителами. После удаления избытка меченых антител регистрируют концентрацию метки на носителе (см. схему гл. 4, 2). [c.251]

    Физический смысл третьего условия состоит в том, что иммобилизованный антиген может значительно смещать равновесие зеакций, проходящих в растворе (и тем самым существенно ухудшать калибровочную кривую по сравнению с кривой титрования), голько в случае, если он способен связывать значительную часть антител, за которые идет конкуренция. С другой стороны, теоретически выгодное значительное снижение концентрации комплекса на носителе (В,помощью меченых антивидовых антигел, что лимитируется чувствительностью регистрации метки. [c.252]

    Ротавирусный антиген, специфические антитела против ротавируса (АТ), конъюгат специфических антител с пероксидазой Ат-ПХ), антивидовые антитела против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой (АтрПХ), положительные и отрицательные стандарты для выявления ротавируса и специфических антител, компоненты для приготовления субстратов на основе 5-АС (см. 1 этой главы), полистирольные планшеты, микропнпеткн, спектрофотометр. [c.273]

    В данном разделе, рассмотрён конкурентный метод ИФА, включающий конкуренцию адсорбированного на полистироле и определяемого тестостерона за центры связывания специфических антител, С последующим выявлением специфического комплекса иа твердой фазе меченными пероксидазой антивидовыми антителами (А. В. Захарычев. и др., 1987). [c.281]

chem21.info

Что такое Иммуноферментный анализ (ELISA), основные виды и отличия

Иммуноферментный анализ: виды и основные отличия

Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа — непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализа детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой (Рис. 1В). Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.

Рис. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)

Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)

Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.

I. Сорбция антигена

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Раститровка специфичных антител

Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение.

При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител — в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфичными антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.

IV. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой

В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфичных антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000). Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД.

Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратный буфер, рН 4,5) добавить 0,01 мл 30% перекиси водорода и 0,2 мл 50х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при –20°С).

Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

V. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М h3SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

VI. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)

Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.

Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)

Иммунноанализ сэндвич-типа.png

Рис. 2. Схематическое изображение иммуноанализа «сэндвич»-типа. АТп — антитело подложки, АТд — детекторное антитело, АГ — антиген, М — метка, ковалентно связанная с детекторным антителом, П — подложка, на которую сорбируется антитело подложки.

В данном варианте иммуноанализа (Рис.2) используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

I. Сорбция антител подложки

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0,1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифичного связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Инкубация с антигеном

В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.

IV. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

V. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта

В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

VI. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М h3SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

VII. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Версия для печати

www.bialexa.ru

Иммунохроматографический анализ - это... Что такое Иммунохроматографический анализ?

Иммунохроматографический анализ (ИХА) — иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест полосок, панелей или тест кассет.

Сущность метода

Принцип действия состоит в том, что при погружении тест полоски в биологическую жидкость (или другой жидкий образец), она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом.

Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод.

1. В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата.

На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.

Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.

2. Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где на иммобилизован конъгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста. При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг:белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота его и легкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в т.ч. "полевых". Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.

Метки, используемые в ИХА

В качестве меток в ИХА используются различные частицы, обладающие следующими свойствами:

1. Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мильтианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота.

2. Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.

3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.

4. Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.

5. Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.).

Литература

Raphael C. Wong l Harley Y. Tse (Editors) Lateral Flow Immunoassay. Springer, USA, 2009.

Ссылки

Иммунохроматографический анализ  (рус.) (doc). Архивировано из первоисточника 14 апреля 2012. Проверено 1 января 2010.

dic.academic.ru

Иммунохроматографический анализ

Биология - Иммунохроматографический анализ

09 февраля 2011

Оглавление:1. Иммунохроматографический анализ2. Метки, используемые в ИХА

иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест полосок, панелей или тест кассет.

Сущность метода

Принцип действия состоит в том, что при погружении тест полоски в биологическую жидкость, она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом.

Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод.

1. В схеме прямого ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.

Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов, возбудителей инфекционных заболеваний.

2. Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где на иммобилизован конъгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста. При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг:белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий является отрицательным результатом анализа.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота его и легкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в т.ч. "полевых". Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.

Просмотров: 8440

www.muldyr.ru

Анти антитела - Справочник химика 21

    Идиотипом называют антигенную детерминанту в области активного центра антитела (см. разд. 4.1.1). Как и всякая белковая молекула, антитело, являющееся белком-иммуноглобулином, может служить мишенью для другого антитела, т.е. выступать в роли антигена. На поверхности молекулы иммуноглобулина находится несколько участков (детерминант), против которых преимущественно вырабатываются анти-антитела. [c.100]     Радиоиммуноэлектрофорез. Если антиген или антитело пометить радиоактивным изотопом, то с помощью иммуноэлектрофореза можно анализировать чрезвычайно малые количества материала. Известно, что антигенные свойства IgQ не меняются, если молекула IgQ как антитело входит в иммунный комплекс. Если мы располагаем соответствующей иммунной сывороткой анти-IgQ, меченной радиоактивным изотопом, то с ее помощью мы можем выявлять IgQ в иммунных комплексах (например, в преципитатах). Радиоиммуноэлектрофорез состоит из следующих стадий  [c.148]
Таблица 6.2 Использование анти-ДНФ-антител для выделения пептидов Таблица 6.2 Использование анти-ДНФ-антител для выделения пептидов
    Другой способ узнавания определенных клеток-мишеней регуляторными Т-лимфоцитами состоит в использовании взаимодействий идиотип-анти-идиотип. В случае иммунных ответов, при которых ббльшая часть вырабатываемых антител имеет один и тот же идиотип, были обнаружены два типа Т-хелперов один из них распознает чужеродный антиген на поверхности В-клеток, а второй узнает идиотип мембраносвязанных антител, функционирующих как поверхностные рецепторы на тех же В-клетках (рис. 17-60). Неясно, участвуют ли такие реагирующие на идиотип Т-хелперы в тех имунных ответах, при которых вырабатываются антитела, имеющие много разных идиотипов. [c.56]

    Ряд выполненных к настоящему времени исследований свидетельствуют в пользу того, что антиидиотипические и антивариотипические антитела реагируют со структурами в активных центрах рецепторов, не имеющих иммуноглобулиновой природы. С использованием в качестве антигена антител против инсулина были получены антиидиотипические анти-антитела, способные реагировать не только с активным центром антител против инсулина, но и активным центром рецептора инсулина на клетках бурого жира (адипоциты). Инкубация адипоцитов с указанными антиидиотипическими антителами приводила к утрате клетками [c.50]

    Влияние антиидиотипических и антивариотипических антител на лигандсвязывающие свойства рецепторов испытывали также на рецепторах одного из компонентов системы комплемента — lq. Рецепторы к этому белку продуцируют в том числе перитонеальные макрофаги, способные по этой причине связывать на холоду меченный радиоактивным иодом lq Fab-фрагменты анти-антител к lq, предварительно добавленные к макрофагам, в значительной степени подавляют связывание lq этими клетками. Аналогичные фрагменты антител против вариотипических детерминант У-района тяжелой цепи полностью отменяли связывание указанными клетками lq (А. Я. Кульберг и др., 1986). [c.51]

    Как в гетерологичной, так и в изологичной антиидио-типической сыворотках содержатся антитела к детерминантам, находящимся непосредственно в активном центре антитела, а также детерминантам, удаленным от него. Первые из указанных анти-антител не взаимодействуют с антителом после блокирования его активного центра гаптеном. Используя этот методический прием, удалось показать, что в гетерологичной антисыворотке свыше 90% антител направлено к детерминантам, удаленным от активного центра, в то время как в изологичной антисыворотке содержатся преимущественно анти-антитела к детерминантам, непосредственно примыкающим к активному центру. Следовательно, гетерологичные и изо-логпчные антиидиотипические антитела направлены к различным, хотя и близко расположенным детерминантам. [c.89]

    АНТИГЕНЫ (от греч. anti--приставка, означающая противодействие, и -genes-рождающий, рожденный), орг. в-ва, способные реагировать с рецепторами лимфоцитов иммунной системы и стимулировать тем самым иммунный ответ организма. Характер такого ответа (напр., синтез антител, с к-рыми соответствующий А. способен образовывать комплекс, клеточный иммунитет, аллергия) зависит от хим. природы А., генетич. особенностей организма и мн. др. факторов. Иногда способность А. вызывать иммунные реакции в организме называется иммуногенностью, а вступать в р-цию с соответствующим антителом-анти-генностью. [c.174]

    На иммунизацию организм отвечает синтезом очень неоднородной популяции антител, молекулы к-рых могут сильно отличаться друг от друга по сродству к антигену. Такая неоднородность объясняется участием в иммунном ответе очень большой популяции В-лимфоцитов, каждый из к-рых синтезирует лишь одну разновидность молекул антител. С помощью техники гибридом (гибридные клетки, получаемые слиянием злокачественных и нормальных анти-телобразующих клеток лимфоцитов) удается получить в больших кол-вах однородные моноклональные антитела, к-рые широко используют в качестве высокоспецифич. реагентов для обнаружения, локализации и выделения разл. в-в, а также для диагностики и лечения нек-рых заболеваний. Гомог. И. накапливаются в больших кол-вах в крови и моче больных при ряде злокачеств. поражений лимфоцитов (т. наз. миеломные И.). [c.217]

    Молекула антитела (иммуноглобулин) состоит из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) белковых цепей, которые соединены водородными связями и расположенными в строго определенных местах дисульфидными мостиками. N-концевые участки L- и Н-цепей образуют анти-генсвязывающий сайт. Отдельные домены [c.211]

    Сначала кроликов иммунизируют по Мильгрому. Для этого из ушной вены животного берут 2 мл крови, смешивают с 0,5 мл 3,8%-ного раствора лимоннокислого натрия, осаждают эритроциты и трижды отмывают их пятью объемами физиологического раствора хлористого натрия. К осадку отмытых эритроцитов прибавляют два объема инактивированной сыворотки человека группы АВ и, периодически помешивая, инкубируют смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем эритроциты вновь трижды отмывают, доводят объем суспензии физиологическим раствором до 2 мл и вводят в вену тому же самому кролику. Эти инъекции повторяют каждые 3 дня, пока титр антиглобулиновых антител не достигнет 1 1000—2000 в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами НЬ (О) +, сенсибилизированными неполными анти-О-антите-лами с титром 1 32. [c.117]

    На стеклянную пластинку обычным способом наносят 1 %-ный гель агарозы, содержащий 2,5%-ную иммунную сыворотку анти-IgG. В затвердевшем геле агарозы вырезают нужное число круглых лунок для исследуемой сыворотки и IgG и заливают в них по несколько капель агарозного раствора. Препараты IgG известной концентрации в соответствующем разведении вносят в несколько лунок в остальные лунки заливают образцы исследуемых сывороток и проводят электрофорез, как описано выше. В зависимости от соотношения концентрации антигена и антител продолжительность электрофореза может варьировать от 2 до 10 ч. Электрофорезг следует закончить, когда прекратится увеличение преципитационных пиков, т. е. когда избыток антигена будет нивелирован электро- [c.156]

    Более чувствительны и чаще дают положительные результаты другие методы РНГА с эритроцитарными групповыми (А, В, С, Д Е) и монорецепторными диагностикумами, а также ИФА, которые ставят с парными сыворотками в динамике заболевания. Антитела к 0-антигенам выявляют начиная со второй недели болезни, а к к/ -антигенам — в более позднем периоде. Р7-антите-ла чаще обнаруживаются у бактерионосителей сальмонелл брюшного тифа (ввиду того что Иг -антиген способствует длительной персистенции возбудителя в организме). Для предварительного отбора лиц, подозрительных на носительство тифозных палочек, используют РНГА с эритроцитарным Г/ -диагностикумом (имеет значение не только обнаружение антител, но и их принадлежность к классу IgG). [c.150]

    Исходным материалом для получения анти-1Шо(.0)-1д является сыворотка или плазма крови, содержащая неполные анти-НЬо(О)-антителав вы,соком>титре сыворотка ИЬ(-)лиЦ, сенсибилизированных К D-изоантигену во время предшествующих беременностей. Rh( + ) пл"одом или в резу тате переливания iUi( + ) крови. Однако более стабильные и высококачественные препараты получают в случае использования сыворотки или плазмы крови рт специально иммунизирование доноров (например, Rh-отрицательных женщин нёдеторрдйо р зраста)./ j Г [c.596]

    Особый интерес представляет общий метод выделения триптофансодержащих пептидов, разработанный на примере сывороточного альбумина человека и цитохрома с лошади [50]. Остатки триптофана в белках количественно модифицировали с использованием высокоспецифичного реагента, 2,4-динитрофенил-сульфинилхлорида, проводили триптический гидролиз, после чего соответствующие пептиды избирательно извлекали на колонке с фиксированными анти-ДНФ-антителами. Получение сор- [c.416]

    Антитело анти-А Вещество А Сефароза 2В, сшитая 2,3-дибром- 655 [c.283]

    Антитела к ферменту И.ммуиоглобулиновая фракция анти-сыворотки к ферменту [c.314]

    Агглютинины анти-1 Фитогемагглютинин Vi ia сгасса. Антитела против мозговых специфических белков [c.334]

    Кроличью антисыворотку против БСА и человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) вводили анестезированным собакам одновременно, при разбавлениях, при которых антисыворотка связывает 957о соответствующих ей антигенов. Для анти-БСА — это разбавление 1 520, а для анти-ЧСА— 1 270. После уравновешивания в течение 12 мин. микросферы БСА вводили в экстракорпоральное кровообращение. Специфическое уменьшение количества БСА-сзязываю-щих антител у четырех собак обнаружено в течение первых 15 мин после введения микрокапсул БСА, в последующие 60 мин содержание антител уменьшалось значительно меньше. За те же интервалы времени количество анти-ЧСА оставалось постоянным. Для доказательства того, что наблюдаемое снижение связывающей способности БСА не является следствием отщепления БСА от микрокапсул в ходе эксперимента, жизненно важные органы и сыворотку крови собак анализировали на присутствие g конце экспериментов. Никакой суше- [c.384]

    Непрямые данные были получены прн изучении антиидиотипнческнх антител. Как уже говорилось, можно получить антитела, которые узнают антигенные детерминанты антиген-связывающих участков других антител такие детерминанты называются идиотипами. Антиидиотипические антитела, способные реагаровать с антиген-связывающим участком растворимого антитела к некоторому антигену X, будут связываться не только с анти-Х-антитела-ми в растворе, но также и с В-клетками, имеющими на своей поверхности те же самые антитела (как рецепторы для антигена X). Неудивительно, что присоединение антиидиотипических антител к этим рецепторам на поверхности В-клеток может ингибировать способность В-клеток узнавать антиген X н отвечать на него. Было показано, что в некоторых случаях антиидиотипические антитела связываются с Т-клвткамн н тоже ингибируют их способность отвечать на антиген X (рнс. 17-55). Генетические исследования позволяют предполагать, что идиотипы, общие для рецепторов В- н Т-клеток, могут кодироваться генными сегментами, определяющими вариабельные области Н-цепей иммуноглобулинов. Антиидиотипические антитела были использованы для выделения малых количеств рецепторов нз плазматических мембран Т-клеток. Хотя эти рецепторы состоят нз полипептидов, сходных по размерам с обычными Н-цепями, они не реагируют с антителами к константным областям каких-либо известных Н- или L-цепей иммуноглобулинов. Эти данные наводят на мысль, что рецепторы Т-клеток могут представлять собой какой-то новый класс Н-цепей, кодируемый специальным набором генов константной области н, возможно, некоторыми генными сегментами, кодирующими Ун-области обычных антител Этой гипотезе противоречит то, что в экспериментах с нспользованнем техники рекомбинантной ДНК не удалось [c.51]

Рис. 17-58. Схема эксперимента, который впервые показал, что Т-клепи, реагирующие с какой-то антигенной детерминантой макромолекулы, необходимы для того, чтобы помогать В-клеткам вырабатывать антитела к другой антигенной детерминанте той же макромолекулы. В этом эксперименте смесь Т- и В-лимфоцитов животного, иммунизированного комплексом ДНФ с белком X (ДНФ-Х), ие вырабатывала антител к ДНФ после переноса в организм облученного животного, которому вводили ДНФ в комплексе с другим белком V (ДНФ-У). Одиако те же самые В-клетки начинали вырабатывать антитела к ДНФ, если облученному животному вводили также Т-мепеи от животного, предварительно иммунизированного одинм только белком У. В отличие от эксперимента, показанного иа рис. 17-57, условия здесь были тагами, что неиммунизированные (чистые) лимфоциты, введенные организм облученной мыши к впервые встретившиеся с анти- ном, не вырабатывали заметных количеств антител. Рис. 17-58. <a href="/info/122821">Схема эксперимента</a>, который впервые показал, что Т-клепи, реагирующие с какой-то <a href="/info/97310">антигенной детерминантой</a> макромолекулы, необходимы для того, чтобы помогать В-<a href="/info/1411976">клеткам вырабатывать</a> антитела к другой <a href="/info/97310">антигенной детерминанте</a> той же макромолекулы. В этом эксперименте смесь Т- и В-лимфоцитов животного, иммунизированного комплексом ДНФ с белком X (ДНФ-Х), ие вырабатывала антител к ДНФ <a href="/info/1896920">после переноса</a> в организм <a href="/info/1355604">облученного животного</a>, которому вводили ДНФ в комплексе с <a href="/info/915815">другим белком</a> V (ДНФ-У). Одиако те же самые В-клетки начинали вырабатывать антитела к ДНФ, если <a href="/info/1355604">облученному животному</a> вводили также Т-мепеи от животного, предварительно иммунизированного одинм <a href="/info/1663383">только белком</a> У. В отличие от эксперимента, показанного иа рис. 17-57, условия здесь были тагами, что неиммунизированные (чистые) лимфоциты, <a href="/info/1277836">введенные организм</a> <a href="/info/1355600">облученной мыши</a> к впервые встретившиеся с анти- ном, не вырабатывали заметных количеств антител.

chem21.info


Смотрите также