Иммуногенность новой гриппозной вакцины. Антитела к вирусу гриппа


Грипп - Статьи - Доктор Комаровский

Грипп — самая знаменитая, самая известная причина ОРЗ вообще и ОРВИ в частности. Самая известная — вовсе не означает, что самая распространенная, встречающаяся чаще всех. В списке вызывающих ОРВИ вирусов, построенном с учетом частоты возникновения болезней, грипп окажется лишь на пятом месте.

Самая известная — вовсе не означает, что самая тяжелая: есть и пострашнее, потяжелее, поопаснее.

Известность гриппа связана, прежде всего, с его способностью вызывать эпидемии. Когда каждый третий житель конкретного городка оказывается в постели, когда половина класса не приходит в школу — понятно, что такая ситуация у всех на устах, и виноватым почти всегда считают грипп, это, разумеется, славу данного вируса поддерживает.

Грипп известен человечеству с глубокой древности. Описания болезни, чрезвычайно похожей на грипп, плюс указания на факт одновременного заболевания множества людей встречаются в трудах самого Гиппократа. Следует, тем не менее, признать, что медицинская наука очень долго шла по тупиковому пути и была уверена в том, что возбудителем гриппа является не вирус, а бактерия. И только в 1933 году была доказана вирусная природа заболевания.

Незаслуженно обвиненным микробом оказалась бактерия по имени «палочка Пфайффера». Первые и весьма обоснованные сомнения в ее причастности к гриппу возникли во время знаменитой эпидемии «испанки» в 1918—1919 гг. Но, как известно, дыма без огня не бывает. По отношению к гриппу палочку Пфайффера реабилитировали, однако доказали ее причастность ко многим другим болезням — отитам, синуситам, эпиглоттитам и даже менингитам1.

Но вернемся к гриппу. В чем же состоят особенности гриппа?

Главная — способность к изменчивости. Т. е. вирус может самым принципиальным образом изменять свой антигенный состав. И это приводит к тому, что у очень большого количества людей полностью отсутствует какой-либо иммунитет, но не иммунитет «вообще», а именно иммунитет к данному, новому, не известному ранее варианту вируса гриппа.

Ученые выделяют три основных разновидности вируса гриппа — А, В и С. Наиболее принципиальные различия как раз и состоят в способности изменяться.

Так, вирус гриппа С практически стабилен. И один раз переболев, человек почти на всю жизнь имеет иммунитет, т. е. заболеть гриппом С можно лишь при первой с ним встрече. Ну а поскольку вирус широко распространен, становится понятным, что взрослые гриппом С почти никогда не болеют. Это удел именно детей.

Вирус гриппа В изменяется, но умеренно. Если грипп С — болезнь исключительно детей, то грипп В — преимущественно детей.

Грипп А — самый коварный, именно он, постоянно меняясь, вызывает эпидемии.

Принципиальный момент: тяжесть самого заболевания мало связана с тем, как этот вирус называется: грипп А или грипп В, хотя грипп С протекает, как правило, легче.

Средства массовой информации эпизодически рассказывают о приближении «страшной эпидемии гриппа», но это вовсе не свидетельствует о том, что данный вирус вызывает заболевание более тяжелое или более опасное. «Страшная эпидемия» — значит, приближается существенно изменившийся вирус, вирус, к которому у большинства населения нет иммунитета. Значит, число заболевших будет очень большим. В этом, еще раз подчеркиваю, суть страшных эпидемий — именно в количестве больных, а не в тяжести конкретной болезни2.

***

Для того чтобы разобраться как в понятии «изменчивость», так и в причинах возникновения эпидемий, нам имеет смысл поговорить о более тонких и сложных материях — о строении самого вируса.

Начнем с того, что вирус гриппа относится к так называемым «одетым», или оболочечным, вирусам — это означает, что вирус имеет в своем составе структуру, далеко не всем вирусам присущую, —оболочку. Внутри оболочки присутствует основной белок вируса — М-протеин. Разновидности этого белка, собственно, и определяют: как данный вирус называется — А, В или С.

М-протеин стабилен. Говоря другими словами, у всех вирусов А М-протеин одинаковый. Всегда одинаковый. И у всех вирусов В М-протеин одинаковый. Всегда одинаковый.

Но внутренними, стабильными, одинаковыми белками список антигенных опасностей, к сожалению, не заканчивается.

От поверхности оболочки отходят особые отростки, похожие на шипы. Каждый шип — конкретный белок, конкретный антиген. Организм человека вырабатывает соответствующие антитела, антитела разрушают белки-шипы, разрушают оболочку вируса, разрушают сам вирус. Если в крови антитела присутствуют — болезнь не возникает.

Есть два главных белка-шипа. И каждый имеет свое название. Название, уж простите, сложное, но человек, который его придумывал, явно не рассчитывал на то, что подобные термины будут использоваться в популярной литературе. Автор с удовольствием бы и не использовал, но жизнь заставляет.

Итак, два главных белка-шипа.

Первый называется гемагглютинин и обозначается буквой H.

Второй называется нейраминидаза и обозначается, соответственно, буквой N.

На сегодняшний день медицинской науке известно 16 типов гемагглютинина и 9 типов нейраминидазы3. Каждому типу гемагглютинина присвоен персональный номер: Н1, Н2, Н3, Н4 и т. д. Аналогично с нейраминидазой: N1, N2, N3 и т. д.

gripp-11

Каждый вирус гриппа обладает конкретным М-протеином и совершенно определенной комбинацией гемагглютинина и нейраминидазы. В результате вирус гриппа получает имя.

Как это имя получается?

  • От М-протеина приходит конкретный вид вируса — А, В, С.
  • Комбинация гемагглютинина и нейраминидазы записывается так: Н1N1 или h4N2.
  • Еще добавляют географическое место, где этот вирус был обнаружен впервые.
  • И год, когда это произошло.

В итоге имеем красивое и теперь уже вполне понятное имя:

А/Нью-Джерси/76/(h2N1) или А/Сидней/97/(h4N2)4.

***

Теперь вернемся к изменчивости.

Итак, вирус имеет поверхностные белки — гемагглютинин и нейраминидазу. Молекулы этих белков в результате так называемых «точечных мутаций» незначительно, но постоянно меняют свою структуру. Этот процесс получил названиеантигенный дрейф.

В результате антигенного дрейфа структура вируса меняется очень незначительно, но даже этих мелких, несущественных, ничтожных, на первый взгляд, изменений достаточно для того, чтобы человеческие антитела потеряли свою специфичность.

— «… потеряли свою специфичность» — это как?

— Перевожу: человек переболел гриппом. В крови остались антитела: к М-протеину, к нейраминидазе, к гемагглютинину. Через год «пришел» грипп опять. Казалось бы, тот же самый грипп, но и нейраминидаза, и гемагглютинин за год подверглись мутациям (т. е. произошел антигенный дрейф), и присутствующие антитела не могут в полной мере проявить свою активность. Нет, они не то чтоб совсем не работают, но далеко не так быстро, не так энергично, как хотелось бы. Раньше (в прошлом году) было строгое соответствие, строгая специфичность: конкретный антиген — конкретное антитело. Чуть-чуть изменился антиген, специфичность потеряна… Т. е. нельзя сказать, что ключик совсем не подходит к замочку. Но пока вставишь — замучаешься, и поворачивается с трудом, и скрипит, и заедает.

gripp-2

Вот и получается в результате: переболев гриппом, имеем все условия к тому, чтобы через год заболеть еще раз. Но есть реальные шансы на то, что болезнь будет протекать несколько легче — ведь какие-никакие, пусть не совсем специфичные, но все-таки антитела есть.

Изменчивость вируса гриппа не ограничивается антигенным дрейфом. Достаточно редко, но возникает ситуация, когда разные вирусы гриппа обмениваются между собой антигенами и тогда появляется принципиально новая комбинация Н и N, комбинация, к которой ни у кого на Земле нет иммунитета.

Этот уникальный вид изменчивости, обуславливающий появление нового, неведомого ранее варианта вируса гриппа, получил название антигенный шифт.

В настоящее время принято считать, что способностью к антигенному шифту обладает только вирус гриппа А5.

Теперь мы имеем возможность объяснить определенные закономерности, демонстрирующие отличия в заболеваемости различными видами вируса гриппа.

Грипп С. Как уже говорилось, вирус практически не подвержен изменениям. Постоянно и активно циркулирует среди населения. Однократно переболев, можно получить иммунитет на всю жизнь. Поэтому гриппом С болеют исключительно дети. Понятно, что эпидемии невозможны, встречаются как единичные случаи заболевания, так и небольшие вспышки в детских коллективах.

Грипп В. Поскольку вирус подвержен антигенному дрейфу (а мы уже знаем, что это такое), ежегодно появляется новый умеренно изменившийся вариант. Этот измененный вирус может вызвать заболевание у большого числа людей. Заболеют, прежде всего, дети — они ведь с этим вирусом еще не встречались. Заболеют взрослые. Те, которые ранее гриппом болели, т. е. имеют в организме пусть и недостаточно специфичные, но хоть какие-то антитела, — те перенесут болезнь легко. Те же, кто болел давно, или не болел, или утратил иммунитет из-за пожилого возраста или других болезней, — те заболеют тяжело.

Грипп А. Ежегодное развитие событий проходит практически по тому же сценарию, что написан для вируса гриппа В. Т. е. появляются новые варианты, обусловленные все тем же антигенным дрейфом, и заболеваемость протекает с теми же закономерностями: дети — часто, взрослые — реже и легче, старики и больные — тяжело.

Иногда будет происходить то, о чем мы уже писали, но еще раз повторим — в силу крайней важности:

возникает ситуация, когда разные вирусы гриппа обмениваются между собой антигенами (антигенный шифт), и тогда появляется принципиально новая комбинация Н и N, комбинация, к которой ни у кого на Земле нет иммунитета.

Именно антигенный шифт вируса гриппа А и является причиной возникновения не просто эпидемии гриппа, а пандемии гриппа.

Пандемия гриппа — это эпидемия, охватывающая множество стран и континентов, фактически — весь мир.

История человечества знает несколько пандемий гриппа. Каждая такая пандемия — огромное число заболевших и умерших, огромные экономические потери.

Самая известная, самая печально знаменитая пандемия — это знаменитая «испанка», или испанский грипп— А(h2N1). «Испанка» — самая страшная, самая трагичная пандемия гриппа. Абсолютно достоверных сведений нет, но, по результатам некоторых исследований, в 1918—1919 гг. человечество заплатило гриппу А цену в 40—50 миллионов (!!!) жизней.

Азиатский грипп. Вирус А(h3N2). Пандемия 1957—1958 гг. Два миллиона погибших.

Гонконгский грипп — А(h4N2). 1968—1969. Один миллион.

Однажды появившаяся на Земле новая разновидность вируса гриппа А распространяется среди людей и вызывает пандемию. Но после этого вирус никуда не исчезает. Продолжает циркулировать в человеческом обществе и является причиной эпизодических случаев болезни. Но, поскольку у большинства людей к данному типу вируса антитела есть уже, эпидемия становится невозможной.

Тем не менее, чем дальше во времени отходит человечество от пандемии, тем меньше среди нас людей с антителами к конкретному варианту вируса. Понятно ведь, что в 1959 году (по окончании пандемии азиатского гриппа) на Земле обитали миллиарды людей с иммунитетом к гриппу А(h3N2). Прошли годы… Количество лиц, обладающих антителами к А(h3N2), поубавилось. И можно опять ожидать от этого вируса эпидемии.

Утешает здесь лишь одно — если уж ожидать эпидемии от А(h3N2), то врачи и ученые знают именно про этот вариант вируса почти все: возрастные и эпидемиологические особенности заболевания, характерные симптомы, возможные осложнения. Т. е. ждать неприятно, но, по крайней мере, известно, чего ждать. А вот при появлении вируса принципиально нового повод для волнений более чем реален.

***

Коль скоро мы заговорили про симптомы, эпидемиологические особенности и т. п., рассмотрим все это поподробнее.

Итак, вирус гриппа распространен во всех странах и на всех континентах. Пик заболеваемости, как правило, приходится на холодные (зимние) месяцы. Во многом это объясняется более активным, более тесным общением людей (детей) в школах, детских садах, транспорте. Опять-таки, обмен воздуха в жилых помещениях несравним с таковым в теплое время года. Окна закрыты, все борются со сквозняками и берегут тепло настолько активно, что проветривание помещений рассматривается как стремление заморозить окружающих. Основной способ передачи вируса от человека к человеку —воздушно-капельный. Кашель и чихание, плюс транспорт и помещения с отсутствующим воздухообменом, плюс скопление людей — логичный и предсказуемый результат: быстрое распространение инфекции, эпидемии.

В воздухе вирус гриппа сохраняет свою активность до четырех часов. Кстати, и здесь есть определенные особенности — устойчивость гриппа А выше, чем у гриппа В. Но оба вируса «любят» низкие температуры — оптимальная цифра около 4 °С. Произнося слово «любят», мы имеем в виду, что именно при такой температуре вирус длительно сохраняется. В то же время идеальная температура для размножения — это температура человеческого тела.

Вирус, содержащийся в каплях слюны и мокроты, после того, как эти капли высохнут и осядут, например, на постельное белье, сохраняет свою активность около двух недель, а в комнатной пыли — до пяти недель!

Очень интересная иллюстрация касательно устойчивости вируса. Проведены исследования, доказывающие, что вирус гриппа может длительное время сохраняться на денежных купюрах. И описанное явление способно в немалой степени влиять на интенсивность эпидемиологического процесса.

Наиболее стойким в этом отношении является штамм h4N2: в высохших на бумаге носовых выделениях он сохраняет активность до 17 дней!

В то же время практически все дезинфицирующие средства вирус гриппа легко убивают и стандартная влажная уборка с использованием этих средств — прекрасный способ обеззараживания помещений. А если добавить проветривание помещений и стирку белья — так локальная победа над вирусом более чем реальна.

Инкубационный период при гриппе — от одного до трех дней. Больной заразен за 24 часа до появления первых симптомов. Это, кстати, один из факторов, делающих невозможным предотвращение распространения инфекции различными ограничениями на поездки и карантинными мероприятиями.

Начало заболевания почти всегда острое: т. е. практически не бывает такого, чтоб сегодня 37,5 °С, завтра 38 °С, послезавтра 39 °С. Как правило, все быстрее: час назад вроде как все было в порядке — и вдруг 39 °С, озноб и голова раскалывается.

Средняя продолжительность лихорадочного периода6— 3—5 дней, но надо учитывать тот факт, что больной остается заразным 1—2 дня и после нормализации температуры тела.

Симптомы гриппа не специфичны: т. е. нет при гриппе ничего такого, что не может наблюдаться при других ОРВИ. Если сравнивать с основной массой других вирусов, то есть тенденция к тому, что повышение температуры более выражено, чаще возникают мышечные и головные боли, менее выражен насморк. Говоря другими словами, главный и наиболее характерный симптом гриппа — это не заложенный нос, кашель и 37,5 °С, это состояние, выраженное словами «плохо вообще».

Здесь имеет смысл отметить, что принципиальной особенностью, теперь уже не вируса гриппа, а собственно болезни под названием «грипп», является доминирование общетоксического синдрома над синдромом поражения респираторного тракта. Тем не менее, эта принципиальная особенность обращает на себя внимание именно в первые дни болезни, а по мере нормализации температуры и улучшения общего состояния на первый план выходят катаральные явления (кашель, заложенный нос и т. п.).

***

Чтобы закончить рассмотрение темы гриппа, нам осталось, собственно, обратить внимание на четыре вопроса:

  • осложнения;
  • профилактика;
  • лабораторная диагностика;
  • лечение.

Автор прекрасно понимает, что именно перечисленные вопросы волнуют читателей больше всего. Между тем,подавляющее большинство способов диагностики, профилактики и лечения являются одинаковыми для всех ОРВИ. И нет таких осложнений, которые могут наблюдаться при гриппе, но принципиально невозможны при других ОРВИ.Именно поэтому мы вернемся к указанным темам позже, более того, рассмотрим их очень подробно и посвятим каждому из четырех указанных вопросов отдельную часть нашей книги.

1Менингит — воспаление оболочек головного или спинного мозга.

2Еще раз фиксирую внимание: о том, что именно этой зимой эпидемия гриппа будет особенной, страшной и опасной, вы можете ежегодно услышать по телевизору. Тем не менее, по-настоящему опасные и по-настоящему страшные эпидемии гриппа, к сожалению, бывают. Но это особенный грипп. По-особому изменившийся. Уникальный. Непредсказуемый. Подробно об этом — в следующей главе.

3Подчеркиваю: 16 и 9 — это количество типов, известное именно на сегодняшний день. Т. е. на тот день, когда автор пишет эти строки. Вполне возможно, что в завтрашней газете напишут про 17 и 10…

4Имя вирусу дает конкретная вирусологическая лаборатория, где вирус, собственно, и обнаруживается. Поэтому в имени может присутствовать еще одна цифра — порядковый номер исследования или номер вируса, выделенного в данном году в данной лаборатории. И тогда имя выглядит так: А/Сидней/5/97/(h4N2).

5Кстати, поскольку вирус гриппа В не обладает способностью к шифту, то в имени вируса все эти Н и N не указываются. И выглядит имя скромнее: В/Янамаши/166/98, В/Пекин/184/93, В/Сичуань/37/99.

6Лихораочный период — период болезни, при котором температура тела превышает нормальные показатели.

автор Комаровский Е.О.опубликовано 24/09/2008 15:05обновлено 06/02/2017— Болезни и лечение

articles.komarovskiy.net

Антитела к вирусу гриппа А и Б в Москве

Вирус гриппа (Myxovirus influenzae) — РНК-содержащий вирус, принадлежит к семейству ортомиксовирусов (Orthomyxoviridae). В настоящее время выявлено более 2000 вариантов вируса гриппа, различающихся между собой антигенными свойствами внутренних белков, что определяет принадлежность вируса гриппа к типу А, В или С. Вирус гриппа А открыт в 1933 г. Смитом, Эндрюсом

Вирус гриппа А в основном вызывает заболевание средней или сильной степени тяжести. Поражает как человека, так и некоторых животных (лошадь, свинья, хорек, птицы). Именно вирусы гриппа А ответственны за появление пандемий и тяжелых эпидемий. Самая жестокая из известных пандемий гриппа случилась в 1918 году, болезнь получила название «Испанской лихорадки». Потери были ужасающие: по самым оптимистичным прогнозам от испанки за 1,5 года умерло 50 млн. человек.

Вирус гриппа B не вызывает пандемий и обычно являются причиной локальных вспышек, более ограниченных эпидемий, по сравнению с гриппом типа А. Вспышки гриппа типа В могут совпадать с таковыми гриппа типа А или предшествовать ему. Вирусы гриппа В циркулируют только в человеческой популяции (чаще вызывая заболевание у детей).

Вирус гриппа C мало изучен. Известно, что в отличие от вирусов А и В, он не вызывает эпидемий и не приводит к серьезным последствиям. Является причиной спорадических заболеваний, в основном у детей. Инфицирует только человека.

Строение и функции

Вирус гриппа имеет близкую к сферической форму и диаметр частиц 80-120 нм. Некоторые штаммы вирусов имеют форму палочек, а иногда и нитей различной длины (филаментозная форма). Вирусные частицы состоят из 0,8-1,1% РНК, 70-75% белка, 20-24% липидов и 5-8% углеводов. Вирион состоит из белковой оболочки, которая образована ворсинками длиной 10-12 нм, внутри которой находится генетическая информация: молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК), кодирующие 7 структурных белков. Из них четыре основных вирус-специфичных антигена: нуклеопротеид (RNP), матриксный белок (М1, М2), гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N) (рис. 1)

Структура вируса гриппа

Рис. 1. Структура вируса гриппа.

Нуклеопротеид, тесно связанный с РНК-геномом, и матриксный белок, выстилающий изнутри липидную мембрану, — внутренние стабильные и типоспецифичные (S) антигены. Нуклеопротеиды типов А, B и C отличаются, что позволяет их детектировать. Гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N) — поверхностные антигены оболочки (V-антигены) — подвержены значительным изменениям.

Гемагглютинин осуществляет адсорбцию (связывание) вириона на сиалосодержащих рецепторах клетки-хозяина и обладает способностью агглютинировать эритроциты (реакция гемагглютинации). Отвечает за штаммовую специфичность вируса гриппа. Нейраминидаза заключена в грибообразных «шипах». Она осуществляет разнообразные функции, одной из которых является отщепление нейраминовой или сиаловой кислоты от мукопротеидных субстанций (муцинов) клетки хозяина, покрывающих ее поверхность, тем самым позволяет размножившемуся вирусу покинуть клетку после ее заражения. Наиболее изучены на сегодняшний день 16 подтипов гемагглютинина и 10 подтипов нейраминидазы.

Вирус репродуцируется в ядре и цитоплазме: нуклеопротеид формируется в ядре, нуклеокапсид собирается в цитоплазме, вирусная частица формируется полностью в процессе отпочкования и отделения от цитоплазматической мембраны клетки-хозяина.

Вирус гриппа малоустойчив во внешней среде. В воздухе помещений он погибает в течение нескольких часов, при 60°С — через 4–5 мин. Однако месяцами сохраняется в высушенном состоянии при —20° и —70°С. Чувствителен к хлорамину, формалину, эфиру, действию ультрафиолетовых лучей, ультразвуку и нагреванию.

Диагностика вирусов гриппа на сегодняшний день включает в себя иммунохимические методы и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Широко применяется прямой и непрямой метод иммунофлюоресценции (выявление антигенов возбудителя в биологическом материале). Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет выявить антигены вирусов гриппа А и В с помощью моноклинальных антител к белкам соответствующих возбудителей в сэндвич-варианте. ПЦР применяется для экспресс-диагностики гриппа.

Серологическая диагностика гриппа базируется на выявлении возрастания титра противогриппозных антител в динамике заболевания или на определении специфичных иммуноглобулинов класса М. Для данного вида диагностики гриппа чаще применяют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА-тест позволяет определить тип и подтип вируса ввиду различия между V-антигенами вирусов гриппа. Реакция основана на том, что вирус гриппа способен агглютинировать человеческие или куриные эритроциты, а специфичные антитела ингибируют этот процесс. Реакция связывания комплемента (РСК) служит выявлению различия между S-антигенами и позволяет узнать тип вируса, вызвавшего инфекцию (А или В).

Среди других рекомендованных для ретроспективной диагностики методов можно отметить реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), метод дифференцированного определения антител с помощью редуцирующих веществ, реакцию определения антител к нейраминидазе (РИНА) и другие (иммунодиффузные, иммуноэнзимные и радиоиммунные методы).

Моноклональные антитела к белкам вируса гриппа A и B 

www.bialexa.ru

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Выявление антител к вирусам гриппа A(H5N1) в сыворотках

людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном

процессе в реакции микронейтрализации

Методические рекомендации

Издание официальное

Москва 2009

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Выявление антител к вирусам гриппа A(H5N1) в сыворотках

людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном

процессе в реакции микронейтрализации

Методические рекомендации

1. Разработаны: ГУ НИИ гриппа РАМН (профессором, д.м.н. А.А. Сомининой, к.б.н. В.З. Кривицкой, аспиранткой Н.В. Третьяковой, Е.В. Сорокиным, Т.Р. Царевой).

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко «___»________ 2009 г.

3. Введены впервые.

Содержание

1. Область применения …………………………………………………
2. Введение ……………………………………………………
3. Описание метода ………………………………………….. ………….
3.1. Формула метода …………...
3.2. Показания и противопоказания к применению метода …………...
3.3. Материально-техническое обеспечение ……………………..
3.4. Описание метода ………………………………….
4. Эффективность метода …………...

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

«03» 06 2009 года

01/7752-9-34

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Выявление антител к вирусам гриппа A(H5N1) в сыворотках

людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном

процессе в реакции микронейтрализации

Методические рекомендации.

____________________________________________________________________

1.Область применения.

1.1. Метод предназначен для специфического выявления вируснейтрализующих антител в сыворотках людей и животных, формирующихся в результате естественной инфекции или вакцинации. Наибольшую значимость имеет выявление антител к вирусу гриппа А(H5N1), поскольку по чувствительности и специфичности метод превосходит традиционный агглютинационный тест – реакцию торможения гемагглютинации, мало эффективный при выявлении антител к этому возбудителю. Суть метода заключается в заражении клеточной культуры MDCK, выращенной в 96-луночных планшетах, смесями двукратных разведений исследуемой сыворотки с вирусом гриппа А(H5N1), взятым в дозе 100 ТИД50, с последующей инкубацией инфицированных культур в термостате с подачей СО2 в течение 2 суток. При этом сыворотки, содержащие антитела, нейтрализуют вирус и препятствуют его размножению в клеточной культуре, тогда как в отсутствие антител вирус активно размножается, что определяется количественно при проведении иммуноферментного анализа непосредственно на фиксированном монослое. За титр антител принимается последнее разведение сыворотки, при котором отмечается отчетливая ингибиция вирусной репродукции, определяемая по соответствующей формуле.

1.2. При подготовке настоящих МР были использованы инструкции, полученные из Influenza Division, Cеntres for Disease Control and Prevention (Atlanta, USA), предназначенные, однако, для определения антител к современным возбудителям гриппозных эпидемий – вирусам гриппа A(h2N1), A(Н3N2) и В, которые были модифицированы в ЛБ применительно к задачам выявления антител к вирусам гриппа птиц – вероятным возбудителям предстоящей пандемии, а также в целях повышения чувствительности теста, безопасности работ и воспроизводимости получаемых результатов. В работе использовали вакцинный вирус гриппа A(H5N1), штамм NIBRG-14, полученный методом обратной генетики в лаборатории д-ра J. Wood (National Institute for Biological Standardization and Control, United Kingdom), за что авторы выражают свою благодарность.

2. Введение

Вирусы гриппа А(H5N1) все шире распространяются по планете с формированием эндемичных очагов в ряде районов мира, откуда он периодически разносится перелетными птицами в определенных направлениях, вызывая опустошительные эпизоотии. К настоящему времени в процесс уже было вовлечено более 50 стран мира, включая Россию.

В странах Юго-Восточной Азии, Южной Европы и Африки, по данным ВОЗ, по состоянию на 8 декабря 2008 г. среди людей зарегистрировано 387 случаев тяжелых респираторных заболеваний, вызванных вирусом гриппа А(H5N1) протекающих с явлениями нарастающего дистресс-синдрома, диареи и мультиорганных поражений, развивающихся, как правило, на фоне «цитокинового шторма», и закончившихся для 245 больных летальным исходом.

В анамнезе заболевших обычно регистрируются контакты с пораженной вирусом гриппа A(H5N1) птицей, но в некоторых случаях выявить источник заражения так и не удалось. Это определяет необходимость проведения расширенных серологических исследований в целях регистрации факта и установления цепи передачи инфекции от человека к человеку. Кроме того, рекомендуется проводить серологическое обследование лиц, задействованных в процесс уничтожения пораженного вирусом поголовья птиц.

С точки зрения подготовки к возможной пандемии существенную важность представляет расширение исследований по разработке и обновлению гриппозных вакцин A(H5N1) для людей, а также по обновлению «банка» соответствующих резервных штаммов, отличных в антигеном отношении от уже имеющихся штаммов (в связи с появлением все новых генетических кластеров возбудителя).

В целом, это привело к пониманию необходимости разработки чувствительных и специфичных тестов, которые были бы способны наиболее точно отражать защитную роль сформировавшегося после вакцинации гуморального иммунитета по отношению к новым дрейф-вариантам вируса.

Традиционные агглютинационные тесты, широко используемые при оценке иммуногенности «сезонных» гриппозных вакцин, такие как РТГА, оказались слабо чувствительными и плохо поддающимися стандартизации при выявлении антител к вирусам гриппа A(H5N1). Результаты реакции, как оказалось, зависят не только от вида эритроцитов (лошади, индюки, гуси), но и от выбора особи донора, что не позволяет получать результаты, сопоставимые в разных лабораториях.

Использование реакции нейтрализации вируса специфическими антителами с определением их конечных титров дает наиболее точное представление о защитных свойствах гуморального иммунитета. Применение современных микропланшетных технологий с учетом результатов ингибиции вирусной репродукции антителами в ИФА позволяет дать количественную оценку содержания антител и их нейтрализующего действия в отношении вновь появляющихся вирусов Н5, что, в конечном счете, дает основание для выбора оптимальной штаммовой композиции вакцин. По современным представлениям (Nolan Т.М. et al., 2008; Ehrlich H.J. et al., 2008) МН получила всеобщее признание и является обязательным тестом при оценке иммуногенности новых Н5-вакцин.

3. Описание метода

3.1. Формула метода

В основу разработанного варианта реакции микронейтрализации (МН-ИФА) в отличие от ранее описанных положено:

  • использование апатогенного вакцинного штамма вируса гриппа A(H5N1), полученного методом обратной генетики, что позволяет проводить определение антител в условиях, разрешенных для работы с возбудителями III группы патогенности
  • количественный учёт результатов реакции в ИФА
  • применение моноклональных антител к консервативным сайтам в составе молекулы NP вируса гриппа А, разработанных в ГУ НИИ гриппа
  • использование не канцерогенного субстрата - 3,3’ 5,5’ тетраметилбензидина при учёте результатов МН-ИФА, что обеспечивает безвредность проведения анализа.

3.2. Показания и противопоказания к применению метода

Показания к применению метода:

  • обследований лиц из групп высокого риска инфицирования вирусом гриппа A(H5N1), а также больных с тяжелыми формами респираторных инфекций и контактных лиц,
  • изучение иммуногенности гриппозных вакцин из вируса A(H5N1).
Противопоказания:
  • – отсутствие условий для работы с возбудителями третьей группы патогенности

3.3. Материально-техническое обеспечение

3.3.1. Материалы

  • Перевиваемая культура клеток MDCK,
  • Планшеты для работы с культурами клеток, плоскодонные, 96-луночные («Nunc» или «Sarstedt»),
  • Чашки Петри, одноразовые, стерильные,
  • Пробирки с пробками, объемом до 5 мл, стерильные, одноразовые (для разведения сывороток и вируса),
  • Пробирки с пробками, объемом до 2 мл, стерильные, одноразовые (для приготовления ТPCК-трипсина).

Растворы, среды и реактивы:

  • Среда Игла, стерильная
  • Фосфатно-солевой буфер, рН 7,2-7,4, стерильный
  • Трипсин ТPCК, «Sigma», Кат. № T1426, стерильный
  • Пероксидазный конъюгат моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа типа А
  • 3,3´, 5, 5´ тетраметилбензидин, «Sigma», Кат. № T2885
  • Ацетон
  • Перекись водорода
  • Серная кислота
  • Диметилсульфоксид (для приготовления концентрированного раствора тетраметилбензидина)
  • Сухое молоко

3.3.2. Оборудование

  • Ламинарный бокс 2 класса защиты,
  • Инкубатор (36 ± 0,5)С с регулируемой подачей СО2 (5-6%),
  • Термостат (37º С),
  • Мультискан для учета результатов ИФА, фильтр - 450 нм (пик поглощения тетраметилбензидина),
  • Инвертированный микроскоп,
  • Центрифуга до 6 тыс. об/мин,
  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 100-1000 мкл, одноканальная,
  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 20-200 мкл, одноканальная,
  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 2-20 мкл, одноканальная,
  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 50-300 мкл, восьмиканальная,
  • Наконечники к пипеткам, одноразовые, стерильные,
  • Рефрижератор с морозильной камерой,
  • Водяная баня с регуляцией температуры нагрева (56º С).

3.4. Описание метода

Стадия 1. Определение инфекционной активности вируса гриппа A(H5N1) в клеточной культуре MDCK.

Клеточную культуру MDCK в концентрации 200 тысяч клеток / мл засевают в 96 –луночные культуральные планшеты и выращивают в течение 1-2 суток до 75% -95% состояния монослоя в СО2- инкубаторе при температуре (36 ± 0,5)С. Не допускают перерастания и старения культуры. Перед постановкой опыта титрования вируса клетки отмывают 2 раза средой Игла без сыворотки, после чего во все лунки планшета вносят по 100 мкл среды Игла, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 2 мкг/ мл.

Готовят 10-кратные разведения вируса на среде Игла без сыворотки, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 2 мкг в мл, в ряду из 6 пробирок, содержащих по 450 мкл среды с TPCK-трипсином каждая. Вирус вносят в первую пробирку в объеме 50 мкл и после тщательного перемешивания, меняя каждый раз наконечники, переносят по 50 мкл в следующие пробирки.

Подготовленные разведения вируса, начиная с последнего, вносят по 50 мкл в 4 ряда лунок культурального планшета с монослоем клеток MDCK.

Для контроля состояния клеточной культуры (КК) в 4 лунки планшета вносят по 50 мкл среды Игла, содержащей TPCK-трипсин (2 мкг/ мл).

Планшеты помещают в СО2 инкубатор с температурой (36 ± 0,5)С.

Титр вируса оценивают в ИФА через 48ч. С этой целью культуральную жидкость из всех лунок удаляют, клетки дважды отмывают фосфатно-солевым буфером, рН 7,2-7,4 (ФСБ) и фиксируют 80% холодным ацетоном (15 -20 мин при 0С). После фиксации в лунки вносят по 200 мкл 5% обезжиренного молока в ФСБ (ФСБ-М)* для блокировки свободных мест на планшете. После часовой инкубации при температуре 37С молоко удаляют и в лунки вносят по 100 мкл пероксидазного конъюгата моноклональных антител 4Н1 к NP вируса гриппа А, разведенного 1/4000 на ФСБ-М. После часовой инкубации при 37С и 4-х кратного отмывания ФСБ пероксидазную реакцию проявляют добавлением в каждую лунку по 100 мкл субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% Н2О2 в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0*. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. После остановки реакции (добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2N h3SO4) оптическую плотность измеряют спектрофотометрически при длине волны 450 нм (ОП450).

За титр вируса принимают его последнее разведение, при котором значения ОП450 в 2 раза превышают значения КК.

Вычисляют титр вируса по методу Reed and Muench.

Определяют разведение вируса, при котором в 50 мкл будет содержаться 100 ТЦД50 вируса по данным ИФА.

_________________________________________________________________________

*Примечание.

Рабочий раствор ТМБ готовят из концентрата, который можно длительно хранить в замороженном состоянии. Концентрат готовят следующим образом: 10 мг ТМБ растворяют в 2 мл диметилсульфоксида, раствор разливают по 0,2 мл в криопробирки и хранят при температуре -20ºС. Перед проведением заключительной стадии ИФА нужное количество концентрата размораживают, разводят ацетат-цитратным буфером ( рН 5,0) в 50 раз (до конечной концентрации 0,1 мг/мл), непосредственно перед употреблением добавляют перекись водорода до концентрации 0,02%, после чего рабочий раствор используют в качестве субстратной смеси для проявления пероксидазной реакции.

Приготовление 5% обезжиренного молока.

К навеске порошка сухого молока весом 5 г добавляют 100 мл ФСБ, смесь тщательно размешивают, после чего центрифугируют в течение 1 часа при 5 000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают и фильтруют через марлевый тампон, вложенный в воронку (для удаления жира с поверхности молока) и используют для ИФА. Раствор молока готовят не ранее, чем за день до постановки опыта, хранят при 4 ºС, не замораживают.

Стадия 2. Постановка реакции нейтрализации (РН).

Клеточную культуру MDCK в концентрации 200 тысяч клеток / мл засевают в 96 –луночные культуральные планшеты фирмы Nunc или Sarstedt и выращивают в течение 1-2 суток до 75% -95% состояния монослоя в СО2- инкубаторе при температуре (36 ± 0,5)С. Перед постановкой опыта клетки отмывают 2 раза средой Игла без сыворотки, после чего в лунки планшета вносят по 50 мкл среды Игла, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 2 мкг/ мл.

Исследуемые сыворотки, взятые в объеме 50 мкл, разводят в 10 раз средой Игла без трипсина и прогревают при 56С в течение 30 минут.

Каждую пробу сыворотки разводят в круглодонных планшетах в двух параллельных рядах. В первые лунки ряда А вносят по 120 мкл прогретых сывороток из расчета по две лунки на каждую сыворотку (разведение 1/10). В остальные ряды вносят по 60 мкл среды Игла. Далее готовят последовательные 2-кратные разведения прогретых сывороток в объеме 60 мкл в вертикальных рядах планшета (от 1/20 до 1/1280). Из последнего разведения 60 мкл сыворотки удаляют.

Рабочее разведение вируса (РРВ), содержащего 100 ТЦД50/50 мкл, готовят на среде Игла, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 4 мкг в мл. В каждую из лунок планшета с разведенными сыворотками вносят по 60 мкл РРВ. Пробы осторожно перемешивают круговыми движениями планшета по столу, следя за тем, чтобы не было их разбрызгивания. Смеси инкубируют в течение 2 часов при (36 ± 0,5)С в СО2-инкубаторе, после чего их вносят по 100 мкл в лунки подготовленных планшет с отмытым монослоем клеток MDCK, содержащих по 50 мкл среды Игла с TPCK-трипсином (2 мкг/ мл). Внесение начинают со смесей, содержащих наименьшее разведение сыворотки (1/10). Исследование каждой сыворотки дублируют.

Два ряда лунок в каждом планшете оставляют для внесения контрольных проб.

В каждом планшете проставляют три контрольные пробы:

  1. Контроль состояния клеточной культуры (КК) - в 2 лунки с монослоем клеток вносят 150 мкл среды Игла с TPCK-трипсином (2 мкг в мл) без вируса;
  2. Контроль дозы вируса (КДВ). Определяют путем повторного титрования РРВ, взятого в исходном состоянии и в разведениях 10 –1, 10-2, 10-3. Разведения РРВ вносят по 50 мкл в 2 ряда лунок с добавлением 100 мкл среды Игла с TPCK-трипсином (2 мкг в мл).
  3. Контроль РРВ. РРВ вносят в неразведенном виде в 3 лунки с клетками MDCK.
  4. Контроль сыворотки (КС). Каждую из тестируемых сывороток в разведении 1/10 (50 мкл) вносят в 1 лунку с монослоем клеток с добавлением 100 мкл среды Игла (без вируса).

Планшеты инкубируют в СО2 инкубаторе при температуре (36 ± 0,5)С в течение 48ч. По окончании инкубации среду полностью удаляют, монослой фиксируют холодным 80% ацетоном в течение 15-20 мин, после чего проводят ИФА, как описано на стадии 1.

Стадия 3. Учет результатов

Нейтрализующим титром сыворотки считают ее последнее разведение, при котором показатель ОП450 ниже порогового показателя (ПП), определенного по формуле:

ПП = ОП450 РРВ - ОП450 КК + ОП450 КК , где

2

ОП450 РРВ – среднее значение ОП450 в контрольных лунках, содержа-

щих рабочее разведение вируса,

ОП450 КК - среднее значение ОП450 в контрольных лунках с незара-

женной клеточной культурой

Диагностически достоверным считают четырехкратное и более увеличение титров антител в сыворотке реконвалесцента при сравнении с сывороткой, полученной в острой фазе заболевания.

Примечание:

Анализ контрольных показателей

1.КК

Клеточный монослой в контрольных лунках должен быть сохранен полностью. Показания ОП450 КК не должны превышать 0,2, различия между контрольными лунками не должны быть более 15%.

2.РРВ

Значения ОП450 РРВ не должны быть ниже 1,0.

3.КДВ

При правильном определении дозы вируса позитивный сигнал, превышающий в 2 раза КК, должен регистрироваться в лунках с клетками, инфицированными вирусом в РРВ 10 –1 и 10 – 2 и отсутствовать в разведении 10 – 3. В случае, если при контроле дозы вируса оказывается, что она не соответствует 100 ТЦД50, опыт повторяют.

4.КС

Показания в лунках с КС не должны отличаться от КК более чем на 10%.

При подозрении на заболевание у людей оптимальным является одновременное исследование парных сывороток, взятых в острый период заболевания и не ранее 14-ого дня после начала заболевания.

С учетом Рекомендаций ВОЗ (2007) и имеющихся ретроспективных эпидемиологических данных (контакт с больными людьми или животными) заболевание гриппом А(Н5N1) считается лабораторно установленным в следующих случаях:

- 4-х кратный и более прирост титра антител к вирусу гриппа А(Н5N1) во второй сыворотке (титр не ниже 1:80), взятой на стадии реконвалесценции, по отношению к первой, взятой в острой стадии заболевания;

- титр антител 1:80 и выше при исследовании одиночной сыворотки, взятой не ранее 14 суток от начала заболевания.

4. Эффективность метода

Предложенный вариант постановки реакции МН для детекции антител к вирусу гриппа А(Н5N1) по сравнению с вариантами, предложенными зарубежными исследователями, позволяет сократить сроки проведения, упростить и сделать более безопасной процедуру анализа.

Сокращение длительности анализа достигается прямой детекцией внутриклеточных вирусных антигенов за счет использования пероксидазного конъюгата моноклональных антител (МКА) 4Н1 к консервативному сайту в составе нуклеопротеина вируса гриппа А, общему для вирусов гриппа человека и птиц, что полностью исключает необходимость проведения второго этапа ИФА - внесения конъюгата антител к IgG мыши.

Важным усовершенствованием реакции является использование вакцинного штамма вируса гриппа А(Н5N1), что позволяет проводить исследование сывороток в условиях работы с вирусами, отнесенными к третьей группе патогенности.

Безопасность проведения иммуноферментного анализа этапе внесения субстратной смеси (для оценки результатов реакции) повышается за счет введения неканцерогенного реактива 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина вместо рекомендованного ранее канцерогенного ортофенилендиамина.

Применение МН при оценке иммуногенности инактивированной Н5-вакцины, привитой волонтерам, показало большую чувствительность и специфичность метода по сравнению с РТГА, мало чувствительной при детекции антител к вирусам гриппа А(Н5N1).

Показатели средних геометрических титров антител после вакцинации, определенные в реакции МН, были на 16 - 29% выше (в зависимости от состава вакцины), чем по результатам наиболее чувствительного варианта РТГА с использованием лошадиных эритроцитов. Частота выявления сероконверсий и количества сывороток с защитным титром антител (1:40 и выше) также была выше в МН, чем в РТГА (на 11-20% и 9%, соответственно).

Специфичность реакции, оцененная при исследовании сывороток волонтеров, взятых до вакцинации, также была выше в МН, чем в РТГА.

cow-leech.ru

Анализ на грипп, где сдать?

Острые респираторные инфекции являются наиболее распространенными заболеваниями в современном мире. Ежегодно люди сталкиваются с эпидемиями гриппа, которые поражают до 15% населения. А учитывая высокую изменчивость вирусов, приходится постоянно совершенствовать методы лабораторной диагностики. Поэтому анализы при гриппе представляют собой актуальный вопрос, требующий подробного рассмотрения.

Общие сведения

Грипп – это высоко заразное инфекционное заболевание вирусной природы. Он поражает преимущественно верхние отделы респираторного тракта, но могут вовлекаться также бронхи и легкие. Возбудителем выступают вирусы нескольких серотипов: A, B, C. Первый обладает наибольшей изменчивостью, поскольку содержит на своей поверхности 3 вида гемагглютинина (H) и 2 варианта нейраминидазы (N). Это ферменты, которые отвечают за цитопатическое действие возбудителя. На самом деле таких модификаций гораздо больше, просто остальные преимущественно вызывают болезнь у животных. В настоящее время причиной инфекции становятся два вируса гриппа A: h2N1 (калифорнийский) h4N2 (гонконгский).

Вирус передается человеку воздушно-капельным путем и поселяется на эпителии дыхательных путей. Инкубационный период гриппа короткий – от нескольких часов до пары дней. Как правило, болезнь протекает в легкой форме, с момента контакта с заболевшим до выздоровления проходит до 7 суток. Основными симптомами респираторной инфекции становятся:

  • Высокая лихорадка.
  • Сухой кашель.
  • Боли в горле.
  • Заложенность носа.
  • Головные боли.
  • Ломота в теле, мышцах и суставах.
  • Одутловатость и покраснение лица.
  • Инъекция сосудов склеры.

Но у ряда пациентов болезнь протекает в тяжелой форме. В основном это касается детей, беременных и лиц с сопутствующей патологией. У них вероятна сильная интоксикация и осложнения: пневмонии, гломерулонефрит, нейропатии, шок, отек легких и головного мозга. Поэтому крайне важное значение отводится своевременной лабораторной диагностике гриппа.

Показания

Безусловно, анализ на грипп необходим тем, у кого после клинического обследования врач предполагает указанную инфекцию. Это могут быть различные ОРВИ с синдромом интоксикации. Схожие черты с гриппом есть у таких инфекций:

  • Аденовирусная.
  • Респираторно-синцитиальная.
  • Риновирусная.
  • Парагрипп.
  • Корь.

В дифференциальной диагностике могут нуждаться также случаи микоплазменной пневмонии, а также других заболеваний с продромальным периодом: брюшной и сыпной тиф, лептоспироз, вирусные гепатиты. Но основная сфера назначения анализов – гриппоподобные состояния. Это позволяет не только выявить возбудителя, но и установить его серотипы.

Анализы на вирус гриппа показаны пациентам, у которых есть соответствующие клинические симптомы.

Проведение

Перед проведением анализа врач детально оценивает клинические данные и состояние пациента. По результатам осмотра выдается направление в лабораторию (например, Инвитро). Существует несколько видов лабораторных исследований, необходимых при подозрении на грипп. К ним относятся:

  • Общий анализ крови.
  • Экспресс-тесты.
  • Посев на культуру клеток.
  • Серологический анализ.
  • Молекулярно-генетический метод.

Каждое исследование имеет свои особенности, преимущества и недостатки. Но решение о том, какие анализы проводить, принимается врачом. Он также скажет, как следует подготовиться к взятию биоматериала. Пациенту лишь следует выполнять рекомендации специалиста.

Общий анализ крови

 

Изменения в организме, происходящие при инфицировании вирусом, можно определить по общему (клиническому) анализу крови. Он не позволяет идентифицировать возбудителя, но дает косвенные подсказки о его воздействии на организм и позволяет установить степень тяжести болезни. Исследование проводится натощак. Берется кровь из пальца путем прокалывания стерильным скарификатором и набирания в стеклянный капилляр. Далее подсчитываются форменные элементы (лейко-, эритро- и тромбоциты), содержание гемоглобина, определяется СОЭ и цветной показатель.

Экспресс-тесты

Относительно новым и развивающимся направлением диагностики гриппа считаются экспресс-тесты. Они основаны на иммунохроматографическом определении антигенов (вирусных частиц). На тест-полоску нанесены стандартные антитела к вирусам гриппа A и B, меченые специальным красителем. Он становится виден только при наличии в образце антигенов возбудителя, то есть образовании специфических иммунных комплексов.

Сначала необходимо взять биоматериал – мазок слизи из носа. Пациента просят запрокинуть голову назад. Стерильный тупфер вводят в ноздрю и, оборачивая его там, касаются стенок ходов. Это не очень приятно, из-за щекотания в носу могут слезиться глаза. Поэтому у детей чаще используют назальные смывы – физиологический раствор вводят в ноздрю со шприца и отсасывают слизь. Затем материал помещают в специальный флакон с жидкостью-реагентом, взбалтывая его для хорошего перемешивания. Несколько капель наносят на тест-полоску в специальное окошко. Так делается и экспресс-анализ на свиной грипп (калифорнийский).

Посев на культуру клеток

Материал, полученный от пациента (мазки или смывы), для идентификации вируса засевается на клеточную культуру: слой фибробластов куриного эмбриона (чаще всего), почек обезьян, собак или крупного рогатого скота. Образцы инкубируют в термостатах при температуре человеческого тела. Вирус вызывает цитопатическое действие, проявляющееся в разрушении клеточного слоя. Если такая реакция произошла, то материал переносят на другую среду для определения гемагглютинирующих свойств. Для дальнейшего изучения антигенной структуры и типирования вируса выполняют реакцию с гриппозными диагностикумами.

Средой для культивирования вирусов гриппа выступает клеточная культура. При посеве можно выявить признаки повреждающего действия возбудителя, а дальнейший анализ позволит его идентифицировать.

Серологические анализы

Наиболее распространено серологическое исследование при гриппе. Оно основано на определении антител к вирусу в организме пациента. Это можно сделать в любой современной лаборатории (Инвитро, Синэво и пр.). Для анализа следует сдавать венозную кровь по общепринятым правилам с 5–7 дня болезни. Затем ее центрифугируют, отделяя форменные элементы от сыворотки. Последнюю используют в различных реакциях:

  • Торможения гемагглютинации (РТГА).
  • Связывания комплемента (РСК).
  • Нейтрализации (РН).
  • Иммуноферментного анализа (ИФА).

Чаще всего приходится анализировать кровь, взятую двукратно с интервалом 7–10 суток. Это позволяет оценить титр антител в динамике. Каждый из методов имеет определенную методику выполнения, но принцип один и тот же: иммуноглобулины сыворотки связываются со стандартными антигенами, образуя комплекс. Последний идентифицируется при помощи других реагентов (красителей, ферментов). Но учитывая образование антител в организме лишь со второй недели болезни, серологический анализ крови при гриппе имеет в основном ретроспективное значение.

Молекулярно-генетический метод

С помощью метода полимеразной цепной реакции можно не только выявить вирус гриппа, но и произвести его типирование, т. е. идентификацию. Для этого сначала берут мазок (смывы) из носа. Затем материал смешивают со специальным реагентом, содержащим праймер и ферменты, помещая его в аппарат для амплификации. В нем происходит многократное копирование вирусной РНК и фотохроматографическая детекция. Молекулярно-генетическое исследование позволяет выявить очень малые количества возбудителя и провести дифференциальную диагностику. А благодаря усовершенствованной методике – ПЦР в реальном времени – удается минимизировать сроки выполнения анализа.

Результаты

Сроки проведения исследований различны – от 10 минут (экспресс-тест) до 48 часов (культуральный метод, ПЦР). Иногда при гриппе анализы требуют дальнейшего подтверждения более специфичными и чувствительными методиками, что приводит к замедлению диагностики. А полученные результаты должны интерпретироваться лишь специалистом.

Общий анализ крови

В первые сутки болезни в крови отмечается лейкоцитоз со сдвигом формулы влево. Увеличивается число палочкоядерных нейтрофилов и юных. Далее уровень лейкоцитов при гриппе заметно снижается, что сохраняется в течение всего периода, вплоть до выздоровления. Отмечается относительный лимфоцитоз, СОЭ остается в пределах нормальных значений. Любая лаборатория может сделать такой анализ, а не только Инвитро.

Экспресс-тест

Наиболее быстрый анализ может дать лишь качественный результат в отношении вирусов A или B. После нанесения материала на тест-системе появляется две полоски: одна контрольная, а другая говорит о выявлении возбудителя. Цвет красителя может отличаться, в зависимости от производителя. Если же выявлена лишь контрольная линия, то тест считается отрицательным. При положительном результате необходимо обязательное дообследование, поэтому пациенту придется еще сдать анализ на свиной (или другой) грипп.

Результат экспресс-теста оценивается уже спустя 10 минут после нанесения в него материала. Как его интерпретировать, указано в инструкции по применению.

Посев на культуру клеток

Когда после заражения культуры клеток в ней выявляются признаки цитопатического действия, это свидетельствует о наличии вируса в исследуемом материале. Возбудитель гриппа вызывает разрушение биологического слоя. А при пересевании на другую среду наблюдается гемагглютинация – слипание эритроцитов под воздействием ферментов вируса.

Серологические анализы

Серологическая диагностика производится так называемым методом парных сывороток. Антитела к вирусу, независимо от технологии их идентификации, должны не просто присутствовать у больного гриппом, но и нарастать в динамике. Диагностическим титром считается увеличение уровня иммуноглобулинов в 4 и более раз с интервалом в 7–10 дней.

Молекулярно-генетический метод

Результат полимеразной цепной реакции может быть представлен в качественном, полуколичественном или количественном виде. Последний вариант наиболее предпочтителен, поскольку указывает на степень вирусной нагрузки и вполне годится для оценки тяжести состояния пациента. Но и простое указание на выявление в образце биоматериала РНК возбудителя несомненно подтверждает диагноз. Это наиболее точный и чувствительный метод диагностики гриппа.

Выбор лаборатории

Каждый пациент хочет, чтобы результаты его исследований были достоверными. Поэтому вопрос о том, где сдать анализ, является очень актуальным. Следует отметить, что качество диагностики зависит от многих моментов: подготовки персонала, наличия оборудования и материалов, соблюдения правил взятия биоматериала, его транспортировки и хранения. В крупных лабораториях с развитой сетью (например, таких, как Инвитро) соблюдены и контролируются все ключевые аспекты. В выборе места, где можно сдать мазок из носа или кровь, однозначно поможет врач с учетом собственного опыта.

Важную роль при гриппе играют лабораторные методы исследования. Для постановки диагноза необходимо выявить сам вирус и определить его вид, в чем помогут различные анализы. Одни из них идентифицируют возбудителя, а другие указывают на косвенные признаки его присутствия. Но что именно сдавать в конкретном случае, подскажет лишь врач.

elaxsir.ru

Иммунология гриппа | Помощь врача. Советы и рекомендации доктора

Профессор В. Д. СОЛОВЬЕВ и кандидат мед. наук М. П. СОКОЛОВ,«Проблемы иммунитета и гриппа»,Труды пятой сессии АМН СССР, 1950 г.

В проблеме восприимчивости и иммунитета к гриппу к настоящему времени накоплены обстоятельные материалы по изучению специфических изменений, происходящих в организме при его иммунологической перестройке, наступающей либо в результате перенесенной инфекции, либо в результате искусственной иммунизации.Однако еще ощущается недостаток твердо определившихся понятий, подкрепленных достаточным количеством экспериментально установленных фактов.Я не буду останавливаться ни на обзоре литературы, ни на тех обширных данных, которые имеются у нас по изучению экспериментального иммунитета к гриппу у лабораторных животных, и представлю лишь итоги исследований, проведенных нами за последнее время. В основном мы вели наблюдения над состоянием противогриппозного иммунитета у человека.Накопленный опыт эпидемиологических наблюдений позволяет считать, что при гриппе у человека не существует естественного видового иммунитета.Есть все основания полагать, что при вирусном гриппе, как и при некоторых других инфекциях, например, при кори, восприимчивость к болезни определяется и лимитируется главным образом приобретенным послеинфекционным иммунитетом.Принимая такое положение, необходимо сделать и вытекающий отсюда вывод о том, что среди людей различного возраста наиболее ранимой, наиболее чувствительной к гриппозной инфекции категорией населения должны быть дети и именно дети в раннем возрасте. Отсутствие активно приобретенного иммунитета, наступающего в результате контакта человека с вирусом, должно сказаться прежде всего и главным образом среди детских контингентов населения.В какой мере дети страдают от гриппозной инфекции? Каковы закономерности эпидемического процесса среди детей и каковы иммунологические особенности в детском возрасте? Напрасно мы стали бы искать ответа на эти вопросы в той, поистине громадной литературе, посвященной изучению разнообразных участков обширной и трудной гриппозной проблемы, которая накопилась к настоящему времени. В этой литературе вопросы гриппа у детей нашли весьма скудное отражение, и за имеющиеся сведения мы обязаны, в основном, клиницистам-педиатрам, а не эпидемиологам и микробиологам.Статистические материалы, накопленные за последние четыре года, подтверждают высказанное предположение о наибольшей восприимчивости к гриппу детей. Именно среди детских групп населения чаще всего регистрируются гриппозные заболевания, при этом их максимум падает на возраст от 0 до 3 лет. Если взять уровень заболеваемости в 1945 г, мы видим, что с возрастом показатели постепенно снижаются. Для сравнения взяты аналогичные данные за 1946 г. Принципиальное различие между этими двумя годами заключается в том, что 1946 год был годом эпидемической заболеваемости, когда наблюдалась значительная вспышка вирусного гриппа среди населения, в то время как в 1945 г. эпидемическая заболеваемость отсутствовала. Следует заметить, что, если в эти два года отмечен в равной мере высокий уровень заболеваемости в возрасте от 0 до 3 лет, то, начиная с четырех лет, выявляется различие между эпидемическим и неэпидемическим годом. Это различие возрастает в группах более старших детей и надо сказать, что особенно резко оно выражено у взрослых. Необходимо упомянуть о том, что регистрация гриппа у детей, как впрочем и у взрослых, проводилась до сего времени на основании клинических диагнозов, что не позволяет выделить заболеваемость вирусной этиологии, аналогичную гриппу у взрослых. Изложенное выше послужило предпосылкой к тому, что в нашей лаборатории были предприняты систематические исследования с целью изучения особенностей иммунитета при гриппе в детском возрасте. В этих исследованиях принимали весьма активное участие научные сотрудники Ритова, Дудкина и Пилле.Существует ли пассивный иммунитет к гриппу, приобретенный ребенком от матери, и может ли он защитить ребенка от гриппозной инфекции? С целью выяснения, в какой мере противогриппозные антитела способны передаваться новорожденному от матери, трансплацентарным путем проводились постоянные наблюдения над группой матерей и их новорожденными.Необходимо указать, что твердо установлен тот факт, что у большинства взрослых людей имеются в значительном проценте противогриппозные антитела в крови вследствие перенесенной в прошлом инфекции.Исследование 200 матерей и их новорожденных показало, что у 63% матерей в крови имелись противогриппозные антитела. При определении антител у новорожденных было установлено, что их количество точно совпадает с количеством антител в крови матери, т. е. соответственно антитела были обнаружены в крови у 63% новорожденных. Так, из 200 обследованных матерей и такого же числа новорожденных 126 имели в крови противогриппозные антитела, а у 74 они отсутствовали. У 40 человек антитела были найдены к вирусу типа А, а у 42 к вирусу типа Б и у 44 к вирусам типа А и Б одновременно.Кровь для серологического исследования извлекалась у новорожденного из пупочных сосудов до периода его кормления молоком матери и это служит доказательством того, что полученные ребенком противогриппозные антитела беспрепятственно передаются трансплацентарным путем.Новорожденные, как имевшие пассивно приобретенный иммунитет, так и не имевшие его, находились под постоянным наблюдением в течение 7 месяцев после рождения. За этот период времени было проведено двукратное серологическое исследование для выявления сохранения антител по мере возрастного развития: один раз к 3-му месяцу жизни и вторично в конце 6-го месяца.Так, если при рождении антитела имелись в крови у 63% детей, то к 3-му месяцу жизни последние были обнаружены у 41%, а к концу 6-го и началу 7-го месяца лишь — у 4,7 % обследованных детей.Одновременно с серологическими исследованиями проводились наблюдения над заболеваемостью гриппом среди детей, как имевших антитела, полученные при рождении, так и среди детей, не имевших антител.За период первых двух месяцев жизни среди детей, имевших антитела к вирусам А и Б, не было отмечено ни одного заболевания. Также не зарегистрировано случаев гриппа и в группе детей, имевших антитела к вирусу Б. У 42 детей, не имевших пассивно приобретенного иммунитета, зарегистрировано 4 заболевания. Отмечены также 2 заболевания в группе детей, имевших антитела к вирусу А. Однако у обоих заболевших детей в период реконвалесценции выявилось нарастание антител к вирусу Б; это показывает, что они перенесли гриппозное заболевание, вызванное серологически отличным вирусом гриппа.В тех же группах детей за период наблюдений от 2 до 6 месяцев их жизни снова было отмечено отсутствие заболеваемости у детей, имевших антитела к вирусам А и Б. Заболевания наблюдались в группе детей, имевших антитела или против вируса А или против вируса Б. Одна-ко и в группе детей, имевших антитела, заболеваемость была обусловлена серологически не совпадающими типами вируса. Всего было зарегистрировано 17 случаев заболевания вирусным гриппом. Учет заболеваемости детей производился на основании клинического’ диагноза и тщательного серологического исследования. Вирусный грипп констатировался в случае совпадения положительных результатов обоих методов исследования.В итоге описанных систематических наблюдений, проводившихся в течение 7 месяцев над одной и той же группой детей с момента рождения, можно считать, что, во-первых, противогриппозные антитела передаются трансплацентарным путем и обнаруживаются у новорожденного в том же количестве, как и у матери; во-вторых, количество противо-гоиппозных антител снижается по мере возрастного развития детей и к первому полугодию жизни падает до минимума. Создается впечатление, что антитела, переданные от матери, выполняют функцию пассивно приобретенного иммунитета и защищают детей раннего возраста от гриппозной инфекции. Последнее подтверждается наблюдениями ряда педиатров, считающих, что частота заболеваний гриппом неодинакова в возрасте от 0 до 1 года. Грипп значительно реже встречается у детей до третьего месяца жизни, т. е. именно в тот период, когда, по нашим данным, более всего выражено состояние пассивно приобретенного иммунитета.Важно отметить также, что полученные данные о заболеваемости в раннем возрасте отнюдь не противоречат высказанному взгляду относительно отсутствия естественного иммунитета к вирусному гриппу, ибо проведенные исследования служат доказательством выраженной восприимчивости к гриппу детей, не имевших активно или пассивно приобретенного иммунитета.В самом деле, отмеченная нами частота заболеваемости вирусным гриппом в первое полугодие жизни детей служит в этом отношении достаточно объективным показателем. Необходимо подчеркнуть при этом, что данные наблюдения были проведены с конца марта по сентябрь текущего года, т. е. в весенний и летний сезоны, когда среди взрослого населения имели место лишь очень редкие случаи вирусного гриппа.Следует отметить еще одно весьма важное обстоятельстве. Дети, переболевшие гриппом уже в конце первого месяца жизни, показали отчетливо выраженную способность к активной продукции антител в результате перенесенного заболевания, что определено по появлению и нарастанию специфических антител, ранее отсутствовавших у заболевшего гриппом ребенка. При этом активно приобретаемый иммунитет отмечается наиболее часто в тот период, когда пассивно приобретенный иммунитет находятся на низком уровне, т. е. к седьмому месяцу жизни детей.Изучение вопроса о формировании активного иммунитета в возрастном аспекте проведено нами в экспериментальных условиях в опытах на животных. Этот вопрос представляет интерес не только с теоретической точки зрения — он имеет большое значение и для практики, ибо установление связи между возрастом и образованием антител необходимо для обоснования применения специфических методов диагностики гриппа и для определения иммунологической эффективности прививочной профилактики.Экспериментальные данные, полученные в результате иммунизации новорожденных животных на разных этапах их возрастного развития, показали, что опыты с разными животными (мыши, крысы, кролики и поросята) дают в общем сходные результаты.Если посмотреть сравнительные данные по иммунизации вирусом гриппа животных в возрасте от первой до пятой недели после рождения. Как видно из наблюдений, иммунологическая чувствительность животных выражена отчетливо на первой неделе постнатального развития. В определенных условиях опыта, при равной дозе вводимого антигена у мышей максимум нарастания антител наблюдался на 5-й неделе, у крыс — на 2-й педеле, у кроликов — на 4-й неделе. У поросят, в опытах с которыми положительные результаты были получены на 1 и 3-й день после рождения, максимум накопления антител отмечался на 38-й день, т. е. немногим позднее 5-й недели. Таким образом, все без исключения перечисленные виды млекопитающих показали способность вырабатывать антитела к вирусу гриппа уже на первой неделе после рождения. Эта способность увеличивается с возрастом и достигает значительной степени в период от второй до пятой недели. Несколько иные результаты были получены при иммунизации морских свинок. Новорожденные животные этого вида в первый же день после рождения дают иммунологическую реакцию, тождественную реакции взрослых животных при равных условиях иммунизации. Здесь уместно отметить, что морские свинки отличаются от других видов животных, участвовавших в опытах, как известно, тем, что они уже с момента рождения способны осуществлять ряд движений, типичных для взрослых. Своеобразие животных этого вида заключается, очевидно, также и в том, что они обладают высоко развитой способностью к активной выработке антител сразу же после рождения. В итоге изложенные наблюдения позволяют считать, что иммунологическая чувствительность организма при гриппе отчетливо выражена уже на первых этапах его развития. Это противоречит широко распространенной теории о серонегативности, иммунологической ареактивности в начале постэмбрионального периода жизни. Вместе с тем, наши данные находятся в соответствии с наблюдениями Бермана и его сотрудников, изучавших возрастной иммунитет при некоторых бактериальных инфекциях.Исследуя способность организма подростков отвечать на противогриппозную вакцинацию, мы не выявили каких-либо заметных различий в отношении иммунологической чувствительности. Более того у животных на этом этапе развития чаще наблюдалось более высокое накопление антител по сравнению со взрослыми животными, при равных условиях иммунизации.Отчетливые данные относительно возрастной иммунологической чувствительности были получены при иммунизации подростков в возрасте от 14 до 16 лет противогриппозной вакциной, приготовленной из концентрированных аллантоисных культур вирусов А и Б.В иммунологии гриппа серьезное практическое значение имеет доказанный факт возможности создания прививочного иммунитета. Его образование зависит как от реактивности прививаемого организма, так и от качества препарата, предназначенного для вакцинации. Важными условиями для успеха прививочной профилактики являются: состояние и концентрация вируса, содержащегося в вакцине, выбор метода введения антигена в организм прививаемого, выяснение роли кратности прививок и значения интервалов для ревакцинации. Какими же данными мы располагаем для суждения о ценности метода специфической профилактики гриппа? Не останавливаясь на литературных материалах по этому вопросу, укажу лишь, что наш собственный опыт основан, в значительной мере, на результатах, полученных при применении подкожной вакцинации против гриппа. Широкие исследования по противогриппозным прививкам концентрированной политипажной подкожной вакциной, при однократном введении, показали ее достаточно выраженную антигенную активность. Метод подкожной противогриппозной вакцинации, имеющий свои достоинства — точная дозировка вводимого антигена и вытекающая отсюда возможность учета прививочного иммунитета, принят нами для сравнения с другими методами иммунизации против гриппа.

Вопрос о том, как длительно сохраняется прививочный иммунитет у вакцинированных, составляет предмет наших текущих исследований. В этом отношении мы располагаем данными о сохраняемости послепрививочного титра антител через 6 месяцев после вакцинации.Через 6 месяцев после иммунизации уровень антител у привитых сократился более чем в два раза, однако он все же превышает уровень антител, определенный до иммунизации, не менее чем в три раза. Это показывает, что через полгода послепрививочные антитела сохраняются еще в достаточно выраженной мере.Вопросом большой важности является выбор пути введения антигена в организм. При сравнении подкожного метода вакцинации с внутрикож-ным мы не получили каких-либо доказательств преимущества последнего. Иные результаты получены при сравнении подкожной вакцинации с вакцинацией интраназальной.Как видно из результатов определения уровня антител в крови у привитых, подкожное введение вакцины дает высокие титры нарастания антител в крови после однократной прививки. Вдвое меньшая доза вакцины, введенной через нос, при равных условиях, вызывает нарастание антител в крови значительно менее выраженное. Однако следует подчеркнуть, что критерием большой важности для определения иммунологической эффективности противогриппозных прививок мы считаем увеличение количества послепрививочных антител не столько в крови, сколько в носовом секрете.Необходимо напомнить, что при гриппе входными воротами для вируса являются верхние дыхательные пути. Развитие инфекционного процесса в органах дыхания служит ведущим признаком в патогенезе гриппозной инфекции. В настоящее время можно считать доказанным тот факт, что одним из местных факторов специфической защиты про~ вируса гриппа являются антитела, находящиеся на поверхности верхних дыхательных путей.Ранее нами было показано, в соответствии с данными других исследователей, что количество противогриппозных антител увеличивается как в крови, так и на поверхности слизистых оболочек верхних дыхательных путей и в результате перенесенной инфекции и в результате искусственной иммунизации. Нужно подчеркнуть при этом, что механизм иммунитета невозможно рассматривать иначе, чем с точки зрения механизма инфекции, т. е. ее патогенеза. Если рассматривать антитела носового секрета как критерий эффективности прививочного иммунитета при гриппе, то, возвращаясь к тому же рисунку, мы видим следующее: если при подкожной вакцинации рост антител в носовом секрете увеличивается примерно в три раза, то при введении вакцины интраназально количество антител в носовом секрете не только не уступает количеству, обнаруженному при подкожной вакцинации, но и превосходит его.При применении живой гриппозной вакцины выявилось примерно аналогичное ее действие в отношении накопления антител в крови и в носовом секрете в сравнении с действием вируса, инактивированного слабым раствором формалина. Здесь следует подчеркнуть только то важное обстоятельство, что этот иммунизаторный эффект живой вакцины был достигнут при использовании меньших доз вводимого антигена, чем при введении инактивированного вируса.Лабораторные штаммы вируса гриппа, которыми мы пользовались дпя приготовления вакцин, при введении их человеку в необработанном формалином виде не вызывают никаких явлений болезни. Они оказываются не только полностью безвредными, но и не способны длительно фиксироваться на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, что свидетельствует против возможности их размножения в организме привитого человека.Ряд специальных исследований, проведенных в этом направлении, показал, что уже через 20 часов после интраназального введения живого вируса гриппа, изменившего свои свойства после длительных пассажей на куриных эмбрионах, его редко удается выявить в верхних дыхатель ных путях человека при применении разнообразных и тонких методов исследования. Однако можно с уверенностью сказать, что если ориентироваться на интраназальный метод вакцинации, как на метод, применяемый с целью вызвать бессимптомный инфекционный процесс, то при подборе соответствующих условий выращивания культур вируса гриппа можно приготовить эффективную вакцину.Важнейший вопрос о роли кратности прививок и значении периода ревакцинации в иммунологии бактериальных инфекций можно считать достаточно выясненным, чему в значительной мере способствовали исследования советских ученых. Однако в отношении гриппа остается еще много неясного. Результаты опытов на животных могут помочь практике прививочного дела лишь как ориентировочный метод исследования, ибо сложные условия возникновения и затухания эпидемического процесса при гриппе обусловлены как факторами внешней среды, так и приобретенным послеинфекционным иммунитетом. Последний имеется у большинства взрослого населения, особенно в крупных населенных пунктах. Этим обстоятельством и обусловливается возможность однократных противогриппозных прививок, которые для большинства людей служат по сути дела как бы ревакцинацией. Наши материалы по подкожной вакцинации свидетельствуют о том, что повторное введение вакцины, сделанное спустя 7—10 дней после первого, не оказывает заметного влияния на выработку антител у привитых. Однако мы получили иные результаты при интраназалыюм введении антигена.Если же концентрация антител в крови после ревакцинации увеличивается незначительно, то концентрация антител в отделяемом верхних дыхательных путей возрастает более чем в три раза. Отдаленная ревакцинация и в данном случае дает аналогичный и отчетливо выраженный результат, доказывающий ее несомненную эффективность.Заканчивая, я позволю себе резюмировать свое сообщение несколькими общими замечаниями.1. Метод активной иммунизации в достаточной мере оправдывает возлагаемые на него надежды и должен быть проверен в широких эпидемиологических испытаниях.2. Подкожный метод вакцинации, позволяющий проводить точно дозированные прививки, в отношении возможности практического его применения, уступает методу интраназального введения антигена. Интраназалышй метод вакцинации и по иммунологической эффективности является более перспективным методом для целей специфической профилактики.В этом отношении в качестве вакцины могут быть использованы культуры вируса гриппа, инактивированные слабыми концентрациями формалина, а также испытанные для этой цели вакцины из живого активного вируса. В последнем случае при меньших дозах вводимого антигена создается более выраженный иммунитет, который может быть усилен ревакцинацией, проводимой в надлежащие сроки.3. Противогриппозная вакцинация как метод массовой профилактики должна изучаться с обязательным учетом возрастного и других физиологических факторов.Из имеющихся материалов можно сделать следующие выводы: во-первых, должна проводиться иммунизация наиболее уязвимых контингентов населения — детей; во-вторых, для взрослого населения иммунизация показана более всего в предэпидемическое время. Достижения последнего времени, делающие вполне реальной возможность раннего распознавания приближающейся эпидемической вспышки, облегчают подобную задачу.4. Предметом ближайших исследований в области изучения противогриппозного иммунитета должно явиться получение новых вакцинных штаммов вируса, более пригодных для использования в качестве живой вакцины (для чего уже имеются необходимые экспериментальные предпосылки). Необходимо также дальнейшее изучение иммунореактивности организма, причем особое внимание должно быть обращено на физиологические методы исследования, выяснение роли центральной нервной системы и факторов внешней среды. Исключительную важность представляет дальнейшее изучение гриппа в детском возрасте, что должно быть выполнено при активном участии физиологов и клиницистов-педиатров.Возможно быстрейшая разработка основных вопросов по изысканию рациональных методов профилактики гриппа в детском возрасте в настоящее время является важнейшим этапом на трудном пути правильного решения проблемы гриппа в целом.

Если Вам требуется пройти курс лечения или реабилитации какого-либо заболевания в зарубежных клиниках, Вы всегда можете обратиться за подробной и бесплатной консультацией по лечению за границей на нашем сайте.

www.medznanie.ru

Иммуногенность новой гриппозной вакцины | #10/09

Грипп и гриппоподобные заболевания занимают первое место по частоте и количеству случаев в мире. Эпидемия гриппа ежегодно приходит с наступлением осенне-зимнего сезона, и каждый раз иммунная система не готова к встрече с ним. Почему? Грипп является чемпионом среди вирусов по способности к генетической изменчивости, которая позволяет ему уходить от иммунного надзора. Вирус с изменившимися поверхностными белками уже не распознается специфическими противогриппозными антителами к штаммам-предшественникам.

Наиболее эффективным, безопасным и экономически оправданным средством профилактики гриппа является вакцинация. Чтобы вакцина защищала от гриппа, должно быть четкое соответствие вакцинных штаммов эпидемическим. В отличие от большинства других вакцинных препаратов, существует необходимость ежегодного обновления штаммового состава противогриппозных вакцин и, следовательно, необходимость ежегодной иммунизации. Проблема гриппа давно вышла за пределы одной страны. Центрами по гриппу ВОЗ, организованными по всему миру, проводится регулярный мониторинг и сбор информации по сезонным циркулирующим штаммам вируса гриппа и вспышкам заболеваемости. На основании анализа присланного материала эксперты делают прогнозы относительно разновидностей гриппа, которые будут циркулировать в следующем эпидсезоне, а также предлагают вирусы-кандидаты в вакцинные штаммы для производителей.

С учетом того, что дифференциальная диагностика гриппа от других ОРВИ затруднена, показатели иммуногенности вакцин принято оценивать по уровню специфических антител к гемагглютинину (ГА). Защитный эффект ГА-специфических антител неоднократно был продемонстрирован как у животных, так и у людей. Антитела нейтрализуют вирус гриппа, предотвращая его связывание с рецепторами, при этом уровень антител к гемагглютинину напрямую коррелирует с уровнем защищенности. При оценке потенциальной эффективности вакцины титр антител не менее чем 1:40 считают защитным. Антитела к другому изменчивому поверхностному белку вируса гриппа — нейраминидазе — не могут предотвратить инфекцию, однако играют важную роль в защите от тяжелых форм гриппа, препятствуя выходу вирусных частиц из инфицированных клеток и дальнейшему распространению вируса в организме. Гемагглютинин и нейраминидаза названы протективными белками, а вакцины, содержащие только эти очищенные белки, — субъединичными.

Современные достижения вирусологии, развитие технологий фармацевтической индустрии, интеграция исследователей разных стран в сфере контроля и борьбы с гриппом позволили вывести на новый уровень разработку и производство гриппозных вакцин. Вакцина Гриппол® Нео — результат международного сотрудничества двух компаний («Солвей Биолоджикалз Б. В.» и ФК «ПЕТРОВАКС»). Эта субъединичная вакцина содержит иммуноадъювант Полиоксидоний® и антигены (гемагглютинин и нейраминидазу) европейского качества, полученные из вируса, выращенного на культуре клеток. Рост вируса для вакцины осуществляется по современной технологии с использованием клеточной линии MDCK (Madine-Darbin Canine Kidney) в бессывороточной среде и является стандартизированным закрытым процессом, исключающим возможность контаминации любыми, в том числе неизвестными агентами. Применение культур клеток для наработки вирусного материала стало уже традиционным для целого ряда вакцинных препаратов. Но только благодаря разработкам специалистов компании «Солвей Биолоджикалз» технология стала доступной и для гриппозных вакцин. В 2001 году была зарегистрирована вакцина Инфлювак ТС (Нидерланды), в 2009 году в России — Гриппол® Нео.

Снижение антигенной нагрузки в вакцинирующей дозе обеспечивает максимальный профиль безопасности препарата. Антигены с адъювантом образуют комплекс, который стимулирует гуморальное и клеточное звенья иммунитета. Это приводит к образованию специфических к протективным белкам антител, отвечающих за защиту от гриппа, и повышает общую резистентность организма к инфекции.

Клинические исследования безопасности и иммуногенности Гриппол® Нео проводились с участием добровольцев в высокоспециализированных исследовательских центрах по изучению вакцинных препаратов и поствакцинальных реакций.

Изучение частоты местных и общих реакций, а также соматической и инфекционной заболеваемости во всех группах наблюдения, проведенное в рамках данного исследования, показало, что препараты хорошо переносятся и обладают низкой реактогенностью. Целью данной публикации является анализ результатов иммуногенности вакцины Гриппол® Нео в сравнении с коммерческим препаратом — вакциной Гриппол®.

Материалы и методы

Вакцины

В клиническом испытании были использованы три инактивированные субъединичные вакцины, содержащие иммуноадъювант Полиоксидоний® и антигены (гемагглютинин и нейраминидазу) актуальных для эпидемического сезона 2008/2009 штаммов вируса гриппа: h2N1 A/Brisbane/59/2007; h4 N2 A/Uruguay/716/2007; B/Florida/4/2006. Два тестируемых препарата представляли собой две серии вакцины Гриппол® Нео производства ООО «ФК «ПЕТРОВАКС», содержащие по 5 либо по 10 мкг гемагглютинина каждого из трех штаммов и 500 мкг Полиоксидония®. В качестве препарата сравнения использовали коммерческую вакцину Гриппол® производства ФГУП «НПО «Микроген», содержащую по 5 мкг ГА штаммов вирусов гриппа типа А (h2N1 и h4N2), 11 мкг гемагглютинина вируса гриппа типа В, 500 мкг Полиоксидония®. Препараты, используемые в исследовании, были контролированы в ГИСК им. Л. А. Тарасевича на соответствие нормативной документации; испытуемые серии Гриппол® Нео и препарат сравнения зашифрованы специалистами ГИСКа, не принимающими участия в данном исследовании. Дешифровка была проведена после завершения клинического исследования и представления всех результатов в ГИСК.

Дизайн исследования

Исследования проведены в соответствии с утвержденными протоколами и согласно разрешению МЗ РФ на клинических базах ФГУ НИИ ДИ Росздрава и ГОУ ВПО СПбГМУ им. ак. И. П. Павлова в соответствии с требованиями Надлежащей клинической практики (GCP).

Дизайн исследования: рандомизированное, двойное слепое, контролируемое сравнительное в параллельных группах. Вакцинация добровольцев проведена после подписания информированного согласия.

Участники были отобраны в соответствии с критериями включения/исключения, определенными протоколом клинического испытания. Всего было вакцинировано 300 здоровых добровольцев в возрасте 18–55 лет (средний возраст — 24,5 ± 0,5 года). Перед прививкой все добровольцы были осмотрены врачом, было проведено измерение температуры тела, артериального давления, женщинам — тест на беременность.

Методом случайного выборочного распределения было сформировано три группы по 100 человек. Вакцинацию проводили однократно в дельтовидную мышцу в объеме 0,5 мл.

Постановка реакции и учет результатов

Парные сыворотки добровольцев, взятые до и через 21 день после вакцинации, исследовали с помощью стандартной методики в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как описано в МУ 3.3.2 1758–03. Постановка РТГА включала следующие этапы: подготовка сывороток, определение гемагглютинирующего титра в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции. Для удаления неспецифических ингибиторов сыворотку обрабатывали RDE по методу, описанному в инструкции к препарату. В качестве рабочей дозы антигена использовалась доза 4АЕ, приготовленная из диагностикумов «Диагностикумы гриппозные для реакции торможения гемагглютинации сухие» (ФСП 42–0321–4042–03) трех штаммов, соответствующих вакцинным. Сыворотки титровали начиная с разведения 1:10. При учете результатов титр < 1:10 принимали равным 1:5, а титр > 1:1280 — равным 1:1280.

Иммуногенность оценивали в соответствии с требованиями Европейского комитета к противогриппозным вакцинам (СPMP/BWP/214/96), согласно которым должен выполняться по крайней мере один из трех критериев:

  • сероконверсия (процент лиц с четырехкратным приростом титра антител после вакцинации) — не менее 40%;

  • серопротекция (процент лиц с защитным титром антител до и через 21–28 дней после вакцинации) не менее 70%;

  • кратность нарастания титров антител по сравнению с фоновой сывороткой — не менее 2,5.

Статистика

Результаты исследований статистически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента. Вариационный анализ полученных результатов проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Серологическое обследование с целью оценки иммунологической эффективности вакцинации проводили, сравнивая уровень антител в парных сыворотках, взятых до прививки и на 21-й день после вакцинации. Во всех экспериментальных группах в сыворотках привитых регистрировали статистически достоверное нарастание титров антител. По всем анализируемым критериям не наблюдалось статистически достоверной разницы в иммунном ответе на серии вакцины Гриппол® Нео с различными дозировками антигенов. В таблицах приведены данные, относящиеся к серии, содержащей по 5 мкг гемагглютинина каждого штамма.

Подсчеты числа лиц с серопротекциями (защитными титрами антител (≥ 1:40)) показали, что в каждой группе уровень этих антител соответствует критерию CPMP (табл. 1).

Уровень серопротекций после вакцинации препаратами Гриппол® и Гриппол® Нео

Наиболее иммуногенными оказались компоненты вакцин h2N1 и B. У привитых вакциной Гриппол® Нео по 5 мкг уровень серопротекций составил 96% и 97% соответственно, у привитых вакциной Гриппол® — 96% и 98%. Число людей с защитным титром антител (сероконверсий) против штамма A/h4N2 было несколько ниже — 93% для Гриппола® Нео и 88% для Гриппола®. Достоверных различий по данному показателю между исследуемыми вакцинами и препаратом сравнения вакциной Гриппол® (p > 0,05) не выявлено. Кратность нарастания антител и доля лиц с 4-кратным и более приростом титра антител являются важными характеристиками иммунного ответа на вакцинацию, особенно у людей, ранее не встречавшихся с данными разновидностями вируса гриппа. В табл. 2 показаны результаты вакцинации серонегативных добровольцев — людей с низким (< 1:20) исходным уровнем антител. Из результатов следует, что для всех подтипов вируса гриппа наблюдалось увеличение титров антител, значительно превышающее критерии CPMP.

Уровень сероконверсий и кратность нарастания титра антител у серонегативных лиц (с исходным титром не более 1:20)

Для вакцин Гриппол® Нео и Гриппол® число сероконверсий к подтипу А/h2N1 составило 89,4% и 92,6%; для подтипа А/h4N2 — 77,8% и 77,4%; для типа В — 91,2% и 76,0% соответственно. Кратность прироста титра антител у серонегативных лиц составила от 7,5 до 18,5 для Гриппола® Нео и от 8,5 до 13,9 — для препарата сравнения.

Известно, что человеческая популяция неоднородна по наличию антител к различным штаммам и подтипам вируса гриппа вследствие гриппозных эпидемий и предыдущих вакцинаций. Среди вакцинированных добровольцев выявлены как серонегативные, так и серопозитивные участники (исходно имевшие защитный титр). Представлялось интересным оценить эффективность иммунизации в общей популяции людей (табл. 3).

Уровень сероконверсий и кратность нарастания титра антител по группам

Уровень сероконверсий в целом по группам привитых для штаммов типа А составил 67–75% для вакцины Гриппол® Нео и 61–72% для вакцины сравнения. Уровень сероконверсий для штамма В составил 57% для вакцины Гриппол® Нео и 52% для Гриппола®. Отметим, что в препарате сравнения содержание антигена типа В вдвое выше (11 мкг), чем в тестируемой вакцине — Гриппол® Нео (5 мкг), однако статистически достоверных различий по иммуногенности к этому компоненту не выявлено.

Выводы и заключение

  • Проведены государственные клинические испытания вакцины Гриппол® Нео с уменьшенной антигенной нагрузкой, которые показали, что она обладает всеми качествами вакцинного препарата нового поколения: безвредностью, высокой иммуногенной активностью при введении.

  • Уровень серопротекций для вакцины Гриппол® Нео составил 93–98%; уровень сероконверсий (четырехкратный и более прирост антител) у серонегативных лиц — от 78% до 91%, кратность нарастания титра антител — от 7,5 до 18,5. Таким образом, препарат соответствует всем трем международным критериям иммуногенности, предъявляемым к инактивированным гриппозным вакцинам.

  • Не установлено статистически значимых различий в иммуногенности препаратов, содержащих антигены, полученные с применением «клеточной» (Гриппол® Нео) и традиционной «яичной» (Гриппол®) технологии.

В настоящее время вакцина Гриппол® Нео зарегистрирована (РУ № ЛСР-006029/09 от 23.07.2009 г.). Таким образом, семейство вакцин Гриппол® пополнилось новым полноправным членом, а профилактическая медицина обрела новый инструмент для контроля такого заболевания, как грипп. Гриппол® Нео стал первой в мире субъединичной адъювантной вакциной с клеточной технологией получения антигенов. При этом впервые вакцинация против гриппа разрешена людям с аллергией на белок куриного яйца. Исследования по расширению показаний к применению вакцины продолжаются.

Е. М. Войцеховская * В. С. Вакин *, кандидат медицинских наук А. А. Васильева * Е. В. Кузнецова *, кандидат биологических наук Н. И. Лонская **, кандидат медицинских наук Г. А. Ельшина **, кандидат медицинских наук М. А. Горбунов **, доктор медицинских наук А. А. Соминина *, доктор медицинских наук Ю. А. Зайцева *** * ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург ** ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора, Москва *** ООО ФК «ПЕТРОВАКС», Москва

Ключевые слова: вакцина, грипп, Гриппол® Нео, клеточная культура

www.lvrach.ru

Вирусы гриппа и грипп - Микробиология

ссылки

Вирусы гриппа

К семейству ортомиксовирусов (греч. orthos - правильный, туха - слизь) относятся вирусы гриппа типов А, В, С, которые так же, как и парамиксовирусы, обладают сродством к муцину. Вирусы гриппа А поражают человека и некоторые виды животных (лошади, свиньи и др.) и птиц. Вирусы гриппа типов В и С патогенны только для людей. Первый вирус гриппа человека был выделен от человека в 1933 г. В. Смитом, К. Эндрюсом и П. Лэйдоу (штамм WS) путем заражения белых хорьков. Позже этот вирус был отнесен к типу А. В 1940 г. Т. Френсис и Т. Меджилл открыли вирус гриппа типа В, а в 1949 г. Р. Тэйлор - вирус гриппа типа С.При классификации вирусов гриппа всегда испытывались определенные трудности, связанные с их антигенной изменчивостью. Вирусы гриппа подразделены на три типа А, В и С. К типу А отнесены несколько подтипов, отличающихся друг от друга своими антигенами - гемагглютинином и нейраминидазой. Согласно классификации ВОЗ (1980 г.), вирусы гриппа человека и животных типа А разделены на 13 антигенных подтипов по гемагглютинину (Н1-Н13) и на 10 - по нейраминидазе (N1-N10). Из них в состав вирусов гриппа человека типа А входит три гемагглютинина (HI, h3 и НЗ) и две нейраминидазы (N1 и N2).у вируса типа А в скобках указывается подтип гемагглютинина и нейраминидазы. Например, вирус гриппа А: Хабаровск/90/77 (h2N1).
Структура и химический состав
Вирус гриппа имеет сферическую форму, диаметром 80-120 нм. Реже встречаются нитевидные формы. Нуклеокапсид спиральной симметрии представляет собой рибонуклеопротеиновый (РНП) тяж, уложенный в виде двойной спирали, которая составляет сердцевину вириона. С ней связаны РНК-полимераза и эндонуклеазы (Р1 и РЗ). Сердцевина окружена мембраной, состоящей из белка М, который соединяет РНП с двойным липидным слоем внешней оболочки и шиловидными отростками, состоящими из гемагглютинина и нейраминидазы.Вирионы содержат около 1% РНК, 70% белка, 24% липидов и 5% углеводов. Липиды и углеводы входят в состав липопротеидов и гликопротеидов внешней оболочки и имеют клеточное происхождение. Геном вируса представлен минус-нитевой фрагментированной молекулой РНК. Вирусы гриппа типов А и В имеют 8 фрагментов РНК Из них 5 кодируют по одному белку, а 3 последних - по два белка каждый.
Антигены
Вирусы гриппа А, В и С отличаются друг от друга по типоспецифическому антигену, связанному с РНП (белок NP) и М-матриксным белком, стабилизирующим структуру вириона Этиантигены выявляются в РСК. Более узкую специфичность вируса типа А определяют два других поверхностных антигена - гемагглютинин Н и нейраминидаза N, обозначаемые порядковыми номерами.Гемагглютинин является сложным гликопротеином, обладающим протективными свойствами. Он индуцирует в организме образование вируснейтрализующих антител - антигемагглютининов, выявляемых в РТГА. Изменчивость гемагглютинина (Н-антигена) определяет антигенный дрейф и шифт вируса гриппа. Под антигенным дрейфом понимают незначительные изменения Н-антигена, вызванные точечными мутациями в гене, контролирующем его образование. Подобные изменения могут накапливаться в потомстве под влиянием таких селективных факторов, как антитела. Это в конечном итоге приводит к количественному сдвигу, выражающемуся в изменении антигенных свойств гемагглютинина. При антигенном шифте происходит полная замена гена, в основе которой, возможно, лежат рекомбинации между двумя вирусами. Это приводит к смене подтипа гемагглютинина или нейраминидазы, а иногда обоих антигенов, и появлению принципиально новых антигенных вариантов вируса, вызывающих крупные эпидемии и пандемии.Гемагглютинин является также рецептором, с помощью которого вирус адсорбируется на чувствительных клетках, в том числе эритроцитах, вызывая их склеивание, и участвует в гемолизе эритроцитов.Вирусная нейраминидаза - фермент, катализирующий отщепление сиаловой кислоты от субстрата. Она обладает антигенными свойствами и в то же время участвует в освобождении вирионов из клетки хозяина. Нейраминидаза, подобно гемагглютинину, изменяется в результате антигенного дрейфа и шифта.
Культивирование и репродукция
Вирусы гриппа культивируются в куриных эмбрионах и в культурах клеток. Оптимальной средой являются куриные эмбрионы, в амниотической и аллантоисной полостях которых вирус репродуцируется в течение 36-48 ч. Наиболее чувствительными к вирусу гриппа являются первичные культуры клеток почек эмбриона человека и некоторых животных. Репродукция вируса в этих культурах сопровождается слабовыраженным ЦПД, напоминающим спонтанную дегенерацию клеток. Вирусы гриппа адсорбируются на гликопротеиновых рецепторах эпителиальных клеток, в которые они проникают путем рецепторно-го эндоцитоза. В ядре клетки происходит транскрипция и репликация вирусного генома. При этом считываемые отдельные фрагменты РНК в виде м-РНК транслируются на рибосомы, где происходит синтез вирусоспецифических белков. После репликации вирусного генома формируется фонд вирусных РНК, который используется при сборке новых нуклеокапсидов.
Патогенез
Первичная репродукция вируса происходит в эпителиальных клетках дыхательных путей. Через эрозированную поверхность слизистой оболочки вирус попадает в кровь, вызывая вирусемию. Циркуляция вируса в крови сопровождается повреждением эндотелиальных клеток кровеносных капилляров, в результате чего повышается их проницаемость. В тяжелых случаях наблюдаются кровоизлияния в легкие, сердечную мышцу и другие внутренние органы. Вирусы гриппа, попадая в лимфатические узлы, повреждают лимфоциты, следствием чего является приобретенный иммунодефицит, который способствует возникновению вторичных бактериальных инфекций.При гриппе имеет место интоксикация организма различной степени тяжести.
Иммунитет
Механизм противогриппозного иммунитета связан с естественными факторами противовирусной неспецифической защиты, главным образом с продукцией интерферона и натуральными клетками-киллерами.Специфический иммунитет обеспечивается факторами клеточного и гуморального ответа. Первые представлены макрофагами и Т-киллерами. Вторые - иммуноглобулинами, прежде всего антигемагглютининами и антинейроминидазными антителами, обладающими вируснейтрализующими свойствами. Последние в отличие от антигемагглютининов только частично нейтрализуют вирус гриппа, препятствуя его распространению. Комплементсвязывающие антитела к вирусному нуклеопротеину не обладают протективными свойствами и через 1,5 мес. исчезают из крови реконвалесцентов.Антитела обнаруживаются в сыворотке крови через 3-4 суток после начала заболевания и достигают максимальных титров через 2-3 недели. Продолжительность специфического иммунитета, приобретенного после гриппозной инфекции, вопреки прежним представлениям, измеряется несколькими десятилетиями. К этому заключению пришли на основании изучения возрастной структуры заболеваемости гриппом, вызванным вирусом A (h2N1) в 1977 г. Было установлено, что данный вирус, отсутствовавший с 1957 г., поражал в 1977 г. только лиц не старше 20 лет.Таким образом, после перенесения гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа типа А, формируется напряженный иммунитет, строго специфический к тому подтипу вируса (по Н- и N-антигенам), который вызвал его образование.Кроме того, новорожденные обладают пассивным иммунитетом, обусловленным антителами класса IgG к соответствующему подтипу вируса А. Иммунитет сохраняется в течение 6-8 мес.
Эпидемиология
Источником инфекции являются больные люди и вирусоносители. Передача возбудителя происходит воздушно-капельным путем. Грипп относится к эпидемическим инфекциям, которыечаще возникают в зимние и зимне-весенние месяцы. Примерно через каждые десять лет эпидемии гриппа принимают характер пандемий, охватывающих население разных континентов. Это объясняется сменой Н- и N-антигенов вируса типа А, связанного с антигенным дрейфом и шифтом. Например, вирус гриппа А с гемагглютинином NSW1 вызвал в 1918 г. пандемию «испанки», унесшей 20 млн. человеческих жизней. В 1957 г. «азиатский» вирус гриппа (h3N2) вызвал пандемию, охватившую более 2 млрд. человек. В 1968 г. появился новый пандемический вариант - вирус гриппа A (h4N2), получивший название «гонконгский», который продолжает циркулировать до настоящего времени. В 1977 г. к нему присоединился вирус типа A (h2N1).Это оказалось неожиданным, поскольку идентичный вирус уже циркулировал в 1947-1957 гг., а затем был полностью вытеснен «азиатским» подтипом. В этой связи возникла гипотеза о том, что шифтовые варианты вируса не являются исторически новыми. Они представляют собой циркулирующие в прошедшие годы сероподтипы.Прекращение циркуляции вируса гриппа, вызвавшего очередную эпидемию, объясняется коллективным иммунитетом населения, сформировавшимся к данному антигенному варианту возбудителя. На этом фоне происходит селекция новых антигенных вариантов, коллективный иммунитет к которым еще не сформировался.Пока неясно, где сохраняются в течение длительного времени шифтовые антигенные варианты (сероподтипы) вируса гриппа типа А, вышедшие из активной циркуляции в тот или иной исторический период. Возможно, что резервуаром сохранения таких вирусов являются дикие и домашние животные, особенно птицы, которые инфицируются человеческими вариантами гриппозных вирусов типа А и поддерживают их циркуляцию в течение длительного времени. При этом в организме птиц происходят генетические рекомбинации между птичьими и человеческими вирусами, которые приводят к формированию новых антигенных вариантов.По другой гипотезе вирусы гриппа всех известных подтипов постоянно циркулируют среди населения, но становятся эпидемически актуальными лишь при снижении коллективного иммунитета.Вирусы гриппа типов В и С отличаются более высокой антигенной стабильностью. Вирусы гриппа типа В вызывают менее интенсивные эпидемии и локальные вспышки. Вирус гриппа типа С является причиной спорадических заболеваний.Вирус гриппа быстро разрушается под действием температуры выше 56°С, УФ-излучения, дезинфектантов, детергентов. Он сохраняет свою жизнеспособность в течение 1 сут. при комнатной температуре, на гладких металлических и пластмассовых поверхностях - до 2-х сут. Вирусы гриппа сохраняются при низких температурах (-70°С).
Специфическая профилактика
Для профилактики гриппа используют ремантадин, который подавляет репродукцию вируса гриппа типа А. Для пассивной профилактики применяют противогриппозный иммуноглобулин человека, полученный из сыворотки крови доноров, иммунизированных гриппозной вакциной. Определенный эффект оказывает человеческий лейкоцитарный интерферон.Для вакцинопрофилактики используют живые и инактивированные вакцины. При введении живых вакцин формируется как общий, так и местный иммунитет. Кроме того, отмечается индукция интерферона.В настоящее время получены инактивированные вакцины различных типов: вирионные, субъединичные, расщепленные и смешанные. Вирионные вакцины получают путем высококачественной очистки вирусов, выращенных в куриных эмбрионах. Субъединичные вакцины представляют собой очищенные поверхностные антигены вируса гриппа - гемагглютинины и нейраминидазу. Такие вакцинные препараты характеризуются пониженной реактогенностью и высокой иммуногенностью. Расщепленные или дезинтегрированные вакцины получают из очищенной суспензии вирионов путем обработки детергентами. Однако пока еще отсутствует единое мнение о преимуществе какой-либо одной из этих вакцин. Инактивированные вакцины индуцируют иммунный ответ в системе общего и местного гуморального иммунитета, но в меньшей степени по сравнению с живыми вакцинами индуцируют синтез интерферона.Многолетний опыт применения живых и инактивированных вакцин свидетельствует о том, что антигенное несоответствие вакцинных штаммов эпидемическим служит основной, но не единственной причиной низкой эффективности вакцинопрофилактики гриппа. В последние годы предпринимаются попытки создания генноинже--нерных и синтетических гриппозных вакцин.

Грипп

Грипп - острое респираторное заболевание человека, которое имеет тенденцию к эпидемическому распространению. Характеризуется катаральным воспалением верхних дыхательных путей, лихорадкой, выраженной общей интоксикацией. Часто грипп сопровождается возникновением тяжелых осложнений - вторичных бактериальных пневмоний, обострением хронических заболеваний легких.Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae. Она включает три рода вирусов - А, В, С.Вирус гриппа имеет сферическую форму, его размеры 80-120 нм. Порой образуются нитевидные вирионы. Геном образован однониточной минус-нитью РНК, которая состоит из восьми фрагментов, и окружен белковым капсидом. РНК ассоциированная с 4 внутренними белками: нуклеопротеидов (NP) ивысокомолекулярными белками PI, Р2, РЗ, участвующих в транскрипции генома и репликации вируса. Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии. Над капсидного оболочкой находится слой матриксного белка (М протеин). На внешней, суперкапсидний оболочке в виде шипиков расположены гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N). Оба гликопротеины (N и Н) имеют выраженные антигенные свойства. У вирусов гриппа найдено 13 различных антигенных типов гемагглютинина (НИ-13) и 10 вариантов нейраминидазы (N1-10).По внутреннему нуклеопротеидный антигеном различают три типа вирусов гриппа - А, В, С, которые можно определить в РСК. У вирусов типа А, которые поражают человека есть три вида гемагглютинина (HI, Н2, НЗ) и две - нейраминидазы (N1, N2). Зависимости от их комбинаций, выделяют варианты вирусов гриппа А - h2N1, h3N2, h4N2. их определяют в реакции торможения гемагглютинации с соответствующими сыворотками.Вирусы гриппа легко культивируются в куриных эмбрионах и различных культурах клеток. Максимальное накопление вирусов происходит через 2-3 дня. Во внешней среде вирус быстро теряет инфекционность через высушивания. При низкой температуре в холодильнике хранится в течение недели, при -70 ° С - значительно дольше. Нагрев приводит к его инактивации через несколько минут. Под влиянием эфира, фенола, формалина быстро разрушается.
Вирусологический метод диагностики
Материалом для исследования смывы из носоглотки, выделения из носа, которые принимают сухими или влажными стерильными ватными тампонами в первые дни заболевания, мокроты. Вирусы можно обнаружить в крови, спинномозговой жидкости. При летальных случаях забирают кусочки пораженных тканей верхних и нижних дыхательных путей, головного мозга и т.п..Носоглоточные смывы берут натощак. Больной должен трижды прополоскать горло стерильным физиологическим раствором хлорида натрия (10-15 мл), который собирают в стерильную банку с широким горлом. После этого кусочком стерильной ваты протирают заднюю стенку глотки, носовые ходы, затем ее окунают в банку со смывом.Можно взять материал стерильным, увлажненным в растворе хлорида натрия тампоном, которым тщательно протирают заднюю стенку глотки. После забора материала тампон погружают в пробирку с физиологическим раствором, к которому добавлено 5% инактивированной сыворотки животных. В лаборатории тампоны полощут в жидкости, отжимают у стенки пробирки и удаляют. Слив выдерживают в холодильнике для отстаивания, затем отбирают среднюю часть жидкости в стерильные пробирки. К материалу добавляют антибиотики пенициллин (200-1000 ЕД / мл), стрептомицин (200-500 мкг / мл), нистатин (100-1000 ЕД / мл) для уничтожения сопутствующей микрофлоры, выдерживают 30 мин при комнатной температуре и используют для выделения вирусов, предварительно проверив его на стерильность.Чувствительным методом выделения вирусов заражения 10-11-дневных куриных эмбрионов. Материал в объеме 0,1-0,2 мл вводят в амниотическую или аллантоиса полости. Заражают, как правило, 3-5 эмбрионов. Эмбрионы инкубируют при оптимальной температуре 33-34 ° С в течение 72 часов. С целью увеличения количества вирионов в исследуемом материале его предварительно концентрируют. Для этого используют методы адсорбции вирусов на куриных эритроцитах, обработку 0,2% раствором трипсина с целью усиления инфекционных свойств вирусов или осаждают их по специальным методикам.После инкубации куриные эмбрионы охлаждают при температуре 4 ° С в течение 2-4 ч, затем отсасывают стерильными пипетками или шприцем алантоисну или амниотическую жидкость. В этой с помощью РГА определяют наличие инфекционного вируса. Для этого смешивают равные объемы (0,2 мл) вирусмисткого материала и 1% взвеси эритроцитов кур. О положительной реакции (наличие вируса в материале) свидетельствует оседания эритроцитов в виде зонтика.При наличии в материале вируса, который имеет гемаглютинуючи свойства, его титруют с помощью развернутой РГА, определяя титр гемаглютинуючои активности.С помощью этой реакции определяют титр гемаглютинуючого вируса - наибольшее разведение материала, которое еще дает реакцию гемагглютинации. Это количество вируса принимают за одну гемаглютинуючу единицу (ГАО).
Идентифицируют вирусы гриппа с помощью РТГА
Для этого сначала готовят рабочее разведение вирусного материала, которое содержит 4 ГАО вируса в определенном объеме.Учет реакции проводят после образования осадка эритроцитов в контрольных лунках. О положительной реакции свидетельствует задержка гемагглютинации в исследуемых лунках.Выделять вирусы гриппа можно, используя различные линии культур клеток - эмбриона человека, почек обезьян, перевиваемой линии клеток почек собаки (MDCK) и другие. В клеточных культурах проявляется цитопатическое действие вирусов (появление клеток с фестончатыми краями, вакуолями, формирование внутриядерных и цитоплазматических включений), которая завершается дегенерацией монослоя клеток.Для идентификации выделенных вирусов используют РТГА (при условии, если тите гемагглютинина составляет в культу рал ьний жидкости не менее 1:8). Кроме этой реакции можно использовать РГГадс, однако она менее чувствительна и требует титра иммунной сыворотки не менее 1:160 а также РСК, РН, РЕМА подобное.
Серологическое исследование
Серологическое исследование используют для подтверждения диагноза гриппа. Оно основывается на определении четырехкратного роста титра антител в сыворотке больного.Первую сыворотку получают в начале болезни в остром периоде (2-5-1 день болезни), вторую - после 10-14-го дня заболевания. Поскольку сыворотки дослтн джують одновременно, первую из них хранят в холодильнике при температуре -20 ° С. Чаще всего используют РТГА, РСК, РНГА. Эти реакции ставят со специальными наборами стандартных вирусных диагностикумов (эталонные штаммы вируса гриппа различных серологических типов). Поскольку сыворотки больных могут содержать неспецифические ингибиторы гемагглютинации, их сначала прогревают при температуре 56 ° С, а также обрабатывают специальным ферментом (например, нейраминидая зой) или растворами перйодаты калия, риванола, хлорида Марганца, суспензиеы белой шины т.п. по специальным схемам. И
Реакция торможения гемагглютинации
Реакцию торможения гемагглютинации можно ставить в пробирках (макромш тод) или в специальных планшетах для иммунологических исследований.Реакция считается положительной при образовании компактного, плотного осадка эритроцитов с ровными краями.
Экспресс-диагностика
Метод основан на выявлении в исследуемом материале специфических вирусных антигенов с помощью иммунофлюоресценции в прямой или косвенной РИФ. Слизь получают из носовых ходов или задней стенки глотки, центрифугируют и из осадка клеток цилиндрического эпителия слизистой оболочки готовят мазки на предметных стеклах. их обрабатывают иммунофлуоресцентный сыворотками, конъюгированными с флуорохромами, например, ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат). При исследовании препаратов с помощью люминесцентного микроскопа наблюдают характерное зелено-желтое свечение вирусов гриппа, которые локализуются в начале болезни в ядрах эпителиальных клеток.В последнее время предлагается использовать для индикации специфических вирусных антигенов ИФА, РЗНГА, ПЦР.

Инфекционисты в Москве

Инфекционисты в Москве

vse-zabolevaniya.ru


Смотрите также