Способ определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа. Антитела к прогестерону


АФС, антитела к прогестерону и др

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЧИНЫ ПРИВЫЧНОГО НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

В настоящее время известно, что около 80% всех ранее необъяснимых случаев повторных потерь беременности (после исключения генетических, анатомических, гормональных причин) связано с иммунологическими нарушениями.

Выделяют аутоиммунные и аллоиммунные нарушения, ведущие к привычному невынашиванию беременности.

· При аутоиммунных процессах развивается агрессия иммунной системы к собственным тканям матери, т.е. иммунный ответ направлен против собственных Аг. В этой ситуации плод страдает вторично в результате повреждения материнских тканей.

· При аллоиммунных нарушениях иммунный ответ беременной направлен против Аг эмбриона (плода), полученных от отца и потенциально чужеродных для организма матери.

К аутоиммунным нарушениям, наиболее часто обнаруживаемым у больных с привычным выкидышем, относят наличие в крови беременной антифосфолипидных, антитиреоидных, антинуклеарных аутоантител. Установлено, что у 31% женщин с привычным невынашиванием вне беременности выявляют аутоантитела к тироглобулину, пероксидазе щитовидной железы. В этих случаях риск самопроизвольного выкидыша в I триместре беременности возрастает до 20%. При привычном невынашивании беременности в случае наличия антинуклеарных и антитиреоидных АТ показано дальнейшее обследование для выявления аутоиммунного процесса и верификации диагноза.

Общепризнанным аутоиммунным состоянием, ведущим к гибели эмбриона/плода, в настоящее время служит АФС.

АНТИФОСФОЛИПИДНЫЙ СИНДРОМ

Эпидемиология

По данным американских авторов, частота АФС в популяции достигает 5%, а среди пациенток с привычным невынашиванием беременности она составляет 27–42%, причём без проведения лечения гибель эмбриона (плода) происходит у 85–90% женщин, имеющих аутоантитела к фосфолипидам.

Основным осложнением АФС бывают тромбозы: у 22% женщин с АФС в анамнезе отмечают тромбоз, в том числе у 6,9% — тромбоз мозговых сосудов. Опасность тромботических осложнений возрастает с течением беременности и в послеродовом периоде. Их доля среди всех тромботических осложнений, обусловленных повышением коагуляционного потенциала крови на фоне гиперволемии, достигает 24%.

Классификация, клинические проявления и методы диагностике АФС подробно представлены в главе «Антифосфолипидный синдром».

У больных с АФС обследование и медикаментозную подготовку необходимо проводить до наступления беременности. При положительной пробе на волчаночный антикоагулянт и наличии антифосфолипидных АТ исследование необходимо повторить с через 6–8 нед. В течение этого времени проводят комплексноеобследование и лечение других возможных осложнений при привычной потере беременности. При повторных позитивных тестах на волчаночный антикоагулянт и изменений в параметрах гемостазиограммы лечение необходимо начинать вне беременности.

Лечение АФС

Терапию АФС подбирают индивидуально в зависимости от выраженности активности аутоиммунного процесса.

Назначают антиагреганты, антикоагулянты, небольшие дозы глюкокортикоидов, при необходимости — плазмаферез.

Без проведения терапии рождение жизнеспособных детей отмечают лишь в 6% случаев.

В последние годы зарубежными авторами предприняты попытки разделения больных с АФС на группы на основании анамнестических данных с последующим назначением различных схем лечения.

· У женщин с «классическим» АФС с тромбозами в анамнезе обязательно назначают гепаринотерапию, с ранних сроков беременности (с момента визуализации плодного яйца) под контролем коагуляционных тестов, а также ацетилсалициловую кислоту в дозе 81–100 мг/сут, препараты кальций и витамина D.

· При наличии в анамнезе преэклампсии в дополнение к антикоагулянтной, антиагрегантной терапии показан иммуноглобулин в дозе 400 мг/кг массы тела в течение 5 сут каждого месяца.

· В случае потерь плода без сосудистых тромбозов назначают антикоагулянтные и антиагрегантные лекартсвенные средства в низких, поддерживающих дозах (ацетилсалициловая кислота в дозе до 100 мг/сут, гепарин по 10 000 МЕ в сутки, низкомолекулярные гепарины в профилактических дозах).

· При циркуляции b2-гликопротеин-зависимых АТ к кардиолипину даже в высоких титрах без тромбозов и невынашивания беременности в анамнезе не рекомендована медикаментозная терапия, а показано только наблюдение.

Основные антикоагулянтные препараты, используемые в акушерской практике, приведены ниже.

· Эноксапарин натрий в профилактической дозе 20–40 мг/сут, в лечебной дозе 1 мг/кг массы тела (с распределениемсуточной дозы на 1 или 2 подкожных введения).

· Далтепарин натрий по 2500–5000 МЕ 1–2 раза в сутки или по 50 МЕ/кг массы тела.

· Надропарин кальций в дозе 0,3–0,6 мл (2850–5700 ME) 1–2 раза в сутки, в лечебной дозе 0,01 мл (95 МЕ)/кг массы тела 2 раза в сутки.

Вместе с тем необходимо отметить, что назначение антикоагулянтов с целью антитромботической профилактики досрочного прерывания беременности у женщин с тромбофилиями и осложнённой беременностью не находит единодушного признания ведущих специалистов мира (S. Middeldorp. Antitrombotic prophylaxis for women with thrombophilia and pre- nancy complications-No // Journal of tombosis and haemostasis. — 2003. — Vol. 1(10). — P. 2073– 2074.). Отсутствие единой точки зрения на возможность профилактики осложнений беременности у женщин с приобретёнными тромбофилиями не позволяет однозначно рекомендовать их длительное введение.

Благодаря ряду специфических эффектов (детоксикация, реокоррекция, иммунокоррекция, повышение чувствительности к эндогенным и медикаментозным веществам) плазмафереза при его проведении вне беременности можно снизить активность аутоиммунного процесса, нормализовать гемостазиологические нарушения перед периодом гестации.

Показания к проведению плазмафереза во время беременности приведены ниже.

· Высокая активность аутоиммунного процесса.

· Гиперкоагуляция как проявление хронического ДВС-синдрома, не соответствующая сроку беременности и не поддающаяся коррекции медикаментозными средствами.

· Аллергические реакции на введение антикоагулянтов и антиагрегантов.

· Активация инфекции (хориоамнионит) во время беременности при назначении глюкокортикоидов.

· Обострение хронического гастрита и/или язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки, при котором необходимо снизить дозу глюкокортикоидов или прекратить иммуносупрессивную терапию.

Методика проведения плазмафереза включает эксфузию за 1 сеанс 30% объёма циркулирующей плазмы (600– 900 мл). Плазмозамещение проводят коллоидными и кристаллоидными растворами. Вне беременности объём удаляемой плазмы равен объёму плазмозамещающих растворов, а во время беременности последний больше объёма удаляемой плазмы в 1,2 раза (с использованием 10% раствора альбумина в количестве 100 мл).

Ведение беременности у женщин с АФС представлено ниже.

· С ранних сроков гестации необходим контроль за активностью аутоиммунного процесса, включающий определение волчаночного антикоагулянта, титра антифосфолипидных, антикардиолипиновых АТ, гемостазиологический контроль с индивидуальным подбором антикоагулянтной, антиагрегантной и глюкокортикоидной терапии.

· При антикоагулянтной терапии в первые 3 нед еженедельно проводят мониторинг общего анализа крови с подсчётом уровней тромбоцитов для своевременной диагностики тромбоцитопении. В дальнейшем необходим мониторинг уровня тромбоцитов не реже 2 раз в месяц.

· По данным ультразвуковой фетометрии можно следить за адекватностью роста и развития плода. С 16 нед беременности фетометрию проводят с интервалом 3–4 нед для контроля темпов роста плода, количества ОВ.

· Во II и III триместрах показано исследование функций печени и почек: определение протеинурии, концентрации креатинина, мочевины, активности ферментов (АЛТ, АСТ) в крови.

· УЗИ в допплеровском режиме для своевременной диагностики и лечения плацентарной недостаточности, а также для оценки эффективности проводимой терапии.

· КТГ с 33–34 нед беременности для оценки состояния плода и выбора сроков и метода родоразрешения.

· В родах необходим тщательный кардиомониторный контроль в связи с наличием хронической гипоксии плода различной степени выраженности, а также повышенного риска ПОНРП, развития острой гипоксии плода на фоне хронической.

· Необходим контроль гемостазиограммы непосредственно перед родами и в родах.

· Показано наблюдение за состоянием родильниц, поскольку именно в послеродовом периоде возрастает риск тромбоэмболических осложнений. Глюкокортикоидную терапию продолжают в течение 2 нед после родоразрешения с постепенной отменой лекарственных средств.

· Контроль системы гемостаза показан через 3 и 5 сут после родов. При выраженной гиперкоагуляции необходимо назначение короткого курса низкомолекулярных гепаринов или нефракционированного гепарина в течение 10 сут по 10 000–15 000 ЕД/сут подкожно, ацетилсалициловой кислоты в дозе до 100 мг/сут в течение 1 мес. У пациенток, получающих антиагреганты и антикоагулянты (для профилактики тромбоза при выраженной и длительной гиперкоагуляции), лактацию подавляют. При кратковременных изменениях в системе гемостаза после родов, поддающихся медикаментозной терапии, кормление грудью может быть отсрочено на время лечения при сохранении лактации.

Информация для пациентки

Если у пациентки диагностирован АФС, то она должна быть проинформирована о необходимости лечения во время беременности и мониторинга состояния плода, а также срочного обращения к врачу при появлении признаков венозного тромбоза сосудов ног (покраснения, отёк, болезненность по ходу вен).

Дальнейшее ведение больной

При АФС, сопровождающемся сосудистыми тромбозами, после завершения беременности необходим гемостазиологический контроль и наблюдение у гематологов, сосудистых хирургов и ревматологов.

АНТИТЕЛА К ПРОГЕСТЕРОНУ

У 10% женщин с привычным невынашиванием вне беременности в крови выявляют аутоантитела к прогестерону.

При наличии аутоантител к прогестерону, как правило, определяют недостаточность лютеиновой фазы, концентрация прогестерона бывает равна нижней границе нормы, отмечают «тонкий» эндометрий в сроки «окна имплантации». При беременности нередко формируется первичная плацентарная недостаточность.

При выявлении АТ к прогестерону в лечение включают микронизированный прогестерон или дидрогестерон, а при высоком уровне аутоантител целесообразно назначение преднизолона в дозе 5–10 мг/сут со 2-й фазы менструального цикла.

СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ К ХОРИОНИЧЕСКОМУ ГОНАДОТРОПИНУ

К аллоиммунным факторам привычного выкидыша относят наличие АТ к ХГЧ.

В крови 26,7% женщин, страдающих привычным невынашиванием беременности, обнаруживают АТ к ХГЧ, которые, обладая высокой аффинностью, блокируют биологический эффект, и в некоторых случаях приводят к снижению концентрации ХГЧ. Механизм действия АТ, вероятно, состоит не только в предупреждении связывания ХГЧ с рецепторами жёлтого тела яичников, но и в прямом повреждающем влиянии на клетки эмбриональной трофэктодермы. У 95% женщин с высокими титрами АТ к ХГЧ отмечают угрозу прерывания беременности в I триместре. АТ к ХГЧ при проведении ИФА перекрестно реагируют с ЛГ и ФСГ, что связано с наличием общих антигенных детерминант. Подобные гормональные и аллоиммунные нарушения ведут к раннему развитию ДВС- синдрома (с 3–8 нед беременности) и, как следствие, к угнетению гормонопродуцирующей и трофической функции трофобласта.

Лечение пациенток с сенсибилизацией к ХГЧ состоит в коррекции тромбофилии с помощью низкомолекулярных гепаринов под контролем гемостазиограммы и назначения глюкокортикоидов в дозе 5–15 мг/сут в расчёте на преднизолон. Лечение следует начинать в I триместре беременности, так как пик выработки ХГЧ и, как следствие, АТ развивается в первые недели беременности.

ДРУГИЕ АУТОИММУННЫЕ ПРОЦЕССЫ

К другим аллоиммунным процессам, ведущим к отторжению плода, относят наличие у супругов повышенного количества (более 3) общих Аг системы главного комплекса гистосовместимости (часто бывает при родственных браках), низкий уровень блокирующих факторов в крови матери, повышенное содержание NK-клеток (CD56+16+) в эндометрии и крови матери как вне, так и во время беременности, высокие уровни в эндометрии и крови беременной ряда цитокинов, в частности - -интерферона, фактора некроза опухолиa, ИЛ-1, ИЛ-2. В настоящее время данные аллоиммунные факторы, ведущие к ранним потерям беременности, и пути коррекции вышеуказанных состояний находятся в стадии изучения. Нет единого мнения о методах терапии. По данным одних исследователей активная иммунизация лимфоцитами донора не даёт значимого эффекта, другие авторы описывают значимый положительный эффект при использовании лимфоцитоиммунотерапии и терапии иммуноглобулинами.

В настоящее время одним из иммуномодулирующих средств на ранних этапах беременности служит прогестерон. В исследованиях доказана роль дидрогестерона в суточной дозе 20 мг у женщин с привычным выкидышем в I триместре беременности при повышенном уровне CD56+16+ клеток в эндометрии.

ПРОФИЛАКТИКА

Женщинам, в анамнезе у которых были 2 и более выкидышей или преждевременные роды, необходимо рекомендовать обследование до наступления следующей беременности для выявления причин, коррекции нарушений и предупреждения последующих осложнений. Методы профилактики зависят от причин, лежащих в основе привычного невынашивания беременности.

ПРОГНОЗ

По данным многоцентровых рандомизированных исследований в соответствии в принципами доказательной медицины, в настоящее время нет достоверных данных о повышении числа рождённых детей у женщин с привычным невынашиванием при назначении предгравидарной подготовки, длительного постельного режима, прогестерона и его аналогов, дексаметазона, низкомолекулярного гепарина и др. Даже без лечения частота рождения ребенка достигает 86%. Однако отказывться от широко распространённой методики лечения нецелесообразно. При выявлении причин, коррекции нарушений вне беременности, мониторинге во время беременности рождение жизнеспособных детей у пар с привычным невынашиванием беременности достигает 95–97%.

www.medsecret.net

Иммунное невынашивание беременности и способы его лечения

Во время беременности в организме женщины существует плод, который отличается ровно на половину от всех клеток, генетического кода и других элементов организма матери. Мирное взаимодействие разных тел обеспечивают белки тканевой совместимости – они не дают иммунной системе женщины атаковать плод. Однако в случае иммунного невынашивания беременности эти «маркеры» дают сбой, и иммунитет начинает атаковать плод, приводя к выкидышу.

Действие иммунных клеток

Когда женский организм не находится в режиме беременности, иммунные клетки «разыскивают» на поверхности клеток белковый код совместимости. Если им попадаются измененные клетки (микробы, вирусы, измененные клетки, которые могут превратиться в опухоль), то правильные иммунные агенты уничтожают их. Происходит это за счет выработки антител.

Во время беременности происходит процесс, который рушит всю логику работы иммунитета, так как структура плода становится «своей» для клеток-агентов. Особый барьер не дает иммунитету атаковать плод, поэтому беременность оканчивается положительно.

Однако последние исследования ученых приходят к выводу, что подобный барьер – это лишь верхушка айсберга. Гуморальный иммунитет действует по другому принципу и может включаться по неизвестным причинам, атакуя плод. Точно так же работает клеточный иммунитет, негативно реагируя на «пришельца» в форме плода, в этом случае происходит практически мгновенный выкидыш.

Ученые считают, что во время беременности запускаются процессы толерантности иммунитета, и трансплантат (плод) успешно развивается в течение 9 месяцев, не подвергаясь атаке. Однако некоторые сбои в иммунитете и приводят к невынашиваемости.

Живот беременной женщиныНовая наука для лечения аутоиммунного невынашивания

В 80-х годах прошлого века возникла новая отрасль медицины на стыке перинатологии и гинекологии – иммунология репродукции. Однако в России подобные центры пока что снабжаются мало, за счет чего существует некоторый тормозящий фактор.

Наука накопила важной ценной информации, но ее применение требует особых затрат, техники, которая может закупаться только из Европы, а также специального образования. Но это не мешает оказывать успешную практическую помощь многим пациенткам, столкнувшимся с проблемой невынашивания беременности аутоиммунного характера:

  • успешно выявляются и лечатся аутоиммунные нарушения, которые могут привести к проблемам во время беременности, — забоелвания почек, ревматизм, нарушения мышечной системы, аллергия и красная волчанка;
  • существует специальный анализ крови, который может определить сбой и помочь начать лечение уже на первых стадиях, не допуская нарушений в плаценте женщины;
  • анализ на выявление антифосфолипидов – антител, которые в высокой концентрации приводят к выкидышу.

Если лечение будет начато вовремя, то успех вынашивания беременности достигнет 80%. Отличие аутоиммунных заболеваний, которые поражают кровь и сосуды, заключается в том, что для беременности лечат их симптомы, а не причины. Так используют аспирин в небольших количествах для улучшения кровообращения, что приводит к нормальному развитию плода и полноценному вынашиванию. В результате актуального лечения улучшается состояние и кровоснабжение плаценты, которая не пропускает некоторые клетки иммунитета для атаки плода.

Но существуют и другие аутоиммунные причины невынашивания:Доктор успокаивает женщину

  1. Выработка антител, которые легко проникают через плаценту и воздействуют на клеточные ядра. Однако нарушения могут быстро выявляться и успешно лечатся.
  2. Аллоиммунные нарушения – самая сложная для диагностики и лечения патология. Они предполагают неадекватную реакцию иммунитета на клетки плода, полученные от отцовского организма. Для нормального течения беременности эти клетки должны признаваться иммунитетом «своими».

В случае аллоиммунных нарушений проводится терапия матери клетками отца. Происходит это после соответствующих анализов и нередко – уже после 1 или 2 выкидыша.

Привычное иммунное невынашивание – ситуация, когда происходит подряд 3 выкидыша или больше. В этом случае иммунные причины составляют больше 50%, тогда как дефекты плода или недостаточность лютеиновой фазы – не более 20%.

После 3 выкидышей без актуальной терапии шанс выносить беременность снижается до 30%, а после 5 выкидышей – всего лишь 5%. Однако терапия увеличивает показатель до 85% в большинстве случаев. Антифосфолипидный синдром АФС – общепризнанная распространенная патология, которая ведет к гибели плода.

Особенности антифосфолипидного синдрома

Американские авторы считают, что АФС встречается у 5% женщин в популяции, тогда как при привычном невынашивании эта причина может достигать показателя в 42%. У женщин вырабатываются особые аутоантитела к фосфолипидам.

Осложнение АФС – тромбоз: встречается в 22% случаев, в том числе тромбоз мозговых сосудов. Опасность осложнений растет в соответствии с увеличением срока беременности, а также в послеродовой период.

Изображение активных клеток и беременностиВажно проводить диагностику и обследование перед планированием беременности, и если выявлен АФС, то лечение начинают до беременности.

Лечение АФС

Лечение АФС назначается в индивидуальном порядке и требует применения специальных лекарств: антикоагулянтов, антиагрегантов, глюкокортикоидов, а также плазмаферез в некоторых случаях. Без применения соответствующих препаратов жизнеспособные дети не рождаются в 94% случаев.

Больные женщины делятся на группы, в соответствии с чем назначается лечение:

  1. Классический АФС с тромбозами в анамнезе – лечат гепаринотерапией, ацетилсалициловой кислотой и кальцием с витамином D. Все строго под наблюдением врача и с регулярными коагуляционными тестами.
  2. АФС с преэклампсией – добавляют к терапии иммуноглобулин.
  3. Если потеря плода происходит без тромбозов, назначают низкую дозировку антикоагулянтных и антиагрегантных препаратов.
  4. Если отмечена только циркуляция b2-гликопротеин-зависимых АТ, то медикаментозная терапия не применяется, осуществляется лишь наблюдение врача.

Среди антикоагулянтных препаратов чаще всего используют эноксапарин натрий, далтепарин натрий, надропарин кальций.

Проведение плазмафереза

Методика помогает вывести токсины, скорректировать иммунитет и повысить чувствительность к медикаментам. Вне беременности процедура показана в следующих случаях:

  • повышенная активность аутоиммунных клеток;
  • гиперкоагуляция на фоне ДВС, не поддающаяся коррекции;
  • аллергии на антиагреганты и антикоагулянты;
  • активация во время беременности инфекций;
  • обострение болезней желудка.

Дозировки лекарств во время плазмафереза назначает ведущий врач.

Ведение беременности при АФС

С ранних сроков необходимо контролировать процесс аутоиммунного характера. Обязательно регулярно определяют волчаночный антикоагулянт, антифосфолипидные тела, контролируют употребление антикоагулянтов и других медикаментов.

В первые 3 недели каждый день мониторят анализ крови, считают уровень тромбоцитов. После срока контроль осуществляется 2 раза в месяц. Параллельно необходимо проходить ультразвуковую фетометрию с 16 недели каждые 3-4 недели. После 1 триместра исследуют функции почек и печени.

Необходимо вовремя проводить УЗИ для диагностики и восстановления плацентарной недостаточности. Эта же методика позволит оценить эффективность лечения. С 33-34 недели назначают срок и метод родов.

Во время родов особое внимание уделяется кардио показателям с целью выявления хронической гипоксии разной степени. В это же время контролируют гемостазиограмму. После родов в течение 2 недель осуществляется особый контроль женщин ввиду высокого риска тромбоэмболических осложнений. Дополнительно назначают препараты, оказывающие профилактику подобного состояния.

После родов на 3 и 5 сутки проводят контроль системы гемостаза. Если есть выраженная гиперкоагуляция, то назначают короткий Беременная держит снимок УЗИкурс гепаринов в течение 10 дней, а также ацетилсалициловую кислоту в течение месяца. При использовании антиагрегантов и антикоагулянтов необходимо подавление лактации. При небольших изменениях в системе гемостаза лактацию могут отстрочить на время.

Если у женщины диагностируется АФС, то ее необходимо проинформировать о безоговорочной важности лечения во время беременности и повышенного внимания к мониторингу состояния плода. При возникновении признаков венозного тромбоза необходимо срочно обратиться к врачу (болезненность вен, отек, покраснение).

Антитела к прогестерону

Еще один встречающийся тип аутоиммунного невынашивания беременности – это наличие антител к прогестерону. Патология встречается в 10% случаев. Обычно определяют недостаточность лютеиновой фазы. Концентрация прогестерона в этом случае может приравниваться к нижней границе нормы, также наблюдают тонкий эндометрий. Возможно формирование первичной недостаточности плаценты.

Лечение патологии проводится с помощью медикаментов – микронизированного прогестерона и дидрогестерона. Если аутоантител слишком много, то возможно назначение преднизолона. Концентрации подбираются индивидуально лечащим врачом.

Иммунное невынашивание первой и последующих беременностей – сложная патология, которая отличается невероятно тонким механизмом подхода в лечении. Некоторым женщинам так и не удается родить самостоятельно, однако при своевременном обращении к доктору подобная патология, правильно диагностированная, может легко и быстро подавляться.

immunoprofi.ru

Иммунограмма репродуктивная. - BabyPlan.ru

Репродуктивный иммунофенотип (иммунограмма).

Этот анализ проводят для определения уровня есественных киллеров. В большинстве случаев наличие естественных киллерных клеток – хороший признак, поскольку они защищают организм от раковых опухолей. Однако бывают ситуации, когда их количество резко возрастает и убивает эмбрион или нарушает работу эндокринной системы, делая невозможным вынашивание беерменности. При высоких уровнях естественных киллеров назначается внутривенное введение иммуноглобулина. Наоборот, при низких уровнях естественных киллеров доктора назначают стероидные гормоны, в частности, преднизолон.

При этом анализе определяют следующие типы клеток:

CD3 (норма 63-86)

CD4 (норма 31-53)

CD8 (норма 17-35)

CD19 (норма 3-8)

CD56 (норма 3-12) (натуральные киллеры)

CD3/IL2-R (норма 0-5)

CD19/CD5 (норма 0-10). высокий уровень нарушает выработку необходимых для беременности гормонов.

CD19+/CD5+ Чем выше их уровень, тем больше продукция антител к таким гормонам, как эстрадиол, прогестерон, ХГЧ, а также к серотонину и эндорфинам. Нужно определить уровень антител к гормонам, чтобы доктор мог назначить нужное количество недостающих гормонов. Тест на определение антител к прогестерону Вы можете проделать самостоятельно. Возьмите ампулу с прогестероном, разбейте и нанесите каплю на внутреннюю поверхность предплечья. Сверху закройте пластырем. Первая реакция (покраснение, опухание и уртикарные высыпания вокруг), вызванная антителами, появляется через 15 мин. Затем кожа бледнеет и возвращается в нормальное сстояние, пока не наступит вторая реакция (обычно через 24 часа), вызванная рaботой CD19+/5+ клеток. Доложите о результатах своему доктору.

Антинуклеарные антитела

Эти антитела играют роль в патогенезе таких заболеваний, как ревматоидный артрит и системная красная волчанка а также могут приводить к невынашиванию беременности и бесплодию. Чаcто при этом обнаруживается титр антител 1:40 и выше при неоднородном паттерне. Такой паттерн нехарактерен для СКВ и РА.

Антитела к ДНК и гистонам

Если у женщины обнаруживаются антитела к гистонам, имеющие неоднородный паттерн, значит ее организм отторгает эмбрион.

Антитела к фосфолипидам

При положительных результатах этого анализа нарушается свертываемость крови у матери, образуются микротромбы, которые нарушают снабжение кровью ребенка. Также эти антитела являются причиной плохого прикрепления эмбрина в матке. Лечение – аспирин и гепарин. Эти препараты назначают еще до беременности, в течение цикла зачатия. Это лечение хорошо известно и широко применяется врачами, иногда ои его назначают без проведения необходимых исследваний, и выкидыш все равно происходит, поскольку причиной невынашивания могли быть другие иммунологические нарушения, требующие проведения иммуноцитотерапии лимфоцитами мужа, внутривенного введения иммуноглобулина или назначения преднизолона.

Определение количества естественных киллеров.

С помощью этого анализа определяют цитотоксическую активность естественных киллеров in vitro. Естественные киллерные клетки помещаются в пробирку с клетками эмбриона. Высчитывается процент погибших эмбриональных клеток. Затем в пробирку добавляют гамма-глобулин, чтобы определить, остановит ли он активность киллеров, и какое его количество потребуется для прекращения цитотоксической реакции. Затем гамма-глобулин назначают женщинам перед зачатием, чтоб убедиться, что в их организме он работает с таким же эффектом, что и in vitro.

У 12% женщин с привычным невынашиванием беременности и у 25% с тремя и более неудачами ЭКО отмечен повышенный уровень натуральных киллеров высокая их цитотоксичность относительно клеток плаценты in vitro. Методика этого анализа проста. Натуральные киллеры выделяют из образца крови и инкубируют с возможными клетками-мишенями (клетки плаценты или эмбриона). Вычисляют исходное соотношение киллеров к клеткам-мишеням (50:1, 25:1, 12:1). Затем в культуру клеток добавляют иммуноглобулин в дозе 6,25 мг/мл (соответствует in vivo введению в дозе 25 г однократно) или 12,5 мг/мл (соответствует in vivo введению в дозе 25 г в течение трех дней последовательно). Затем высчитвается процент убитых клеток-мишеней в обоих образцах (с добавлением иммуноглобулина и без).

TJ6 протеин

Естественные киллерные клетки образуются из стволовой клетки костного мозга. Существуют другие клетки в эндометрии, продуцирующие протеин ТJ6. Продукция этого белка стимулируется прогестероном; белок блокирует ДНК киллерных клеток, останавливая их развитие. Однако данный протеин не может остановить развитие стволовых клеток, из которых образуются новые киллеры. Данная проблема имеется у 2% пациентов с иммунологической патологией. Естественные киллерные клетки в эндометрии блокируются ТJ6 протеином при его присоединении к их мембране. У женщин с повторными неудачными попытками ЭКО и с привычным невынашиванием, получавших терапию иммуноцитотерапию, лечение аспирином, гепарином, преднизолоном и иммуноглобулином, находили в крови киллерные клетки с фиксированным на их поверхности ТJ6 протеином. Это означает, что они не были активированы в эндометрии, скорее всего потому что являлись пока стволовыми клетками плода, ждущими своей дифференцировки, и потому избегнувшими инактивации.

Если ТJ6 протеин не может контролировать уровень натуральных киллеров (или стволовых клеток на этапе дифференцировки), те начинают разрушать децидуа, которая является вторым слоем слизистой оболочки матки, питающим эндометрий. Поскольку обычное УЗИ способно измерить только толщину эндрметрия, с его помощью невозможно установить процесс уничтожения эндометрия естественными киллерами децидуальной оболочки. Применение допплеровского исследования позволяет обнаружить эту проблему при проверке зоны 3. Обратите внимание! Использование гормона Прототропина для стимуляции овуляции обостряет данное нарушение. Считается, что он стимулирует костный мозг, способствуя образованию большего числа естественных киллеров.

Другие исследования

К ним относится определение волчаночного аникоагулянта, антител к гормонам, антител к щитовидной железе. Перед введением иммуноглобулина нужно проведение аллергического теста на иммуноглобулины.

www.babyplan.ru

Обзор по иммунологии репродукции - Кемма

Обзор по иммунологии репродукции1. Показания к определению иммунного статуса:

а. Два выкидыша или две неудачные попытки ЭКО

б. Недостаточный ответ яичников на стимуляцию овуляции (менее 6 яйцеклеток).

в. Гибель зиготы

г. Бесплодие неясного генеза

д. Диагностированные иммунологические проблемы (антиядерные антитела, ревматоидный артрит и/или системная красная волчанка)

е. Осложненный акушерский анамнез – задержка развития плода во время предыдущих беременностей.

ж. Один живой ребенок и повторные выкидыши при попытке вынашивания следующих беременностей

2. Иммунологические анализы.

HLA-типирование на примере II класса HLA DQA1.

Этот анализ позволяет определить, насколько совпадают последовательности ДНК в супружеской паре. При нормальной беременности отцовские гены эмбриона, чужие для материнского организма, заставляют его вырабатывать защитную реакцию в отношении эмбриона. Если ДНК отца очень сильно совпадает с материнской, эмбрион может оказаться генетически почти одинаковым с материнским, и тогда материнский организм не распознает его как ребенка, и произойдет реакция отторжения.

DQA1*20:1

В 2% случаев мужчина, имеющий DQ альфа 201, имеет и DQ бета 201. При оплодотворении яйцеклетки сперматозоидом с таким генотипом происходит гибель зиготы в 50%. Если только один DQ антиген (альфа или бета) является 201, вероятность образования такой зиготы в два раза меньше. Ни у одного мужчины, даже если имеется два DQ альфа 2-гена, не могут все сперматозоиды нести DQ бета 201 ген.

Когда гены DQ альфа 201 и бета 201 к эмбриону попадают от матери, эмбрион развивается нормально. Однако если эти гены (оба) приходят от отца, зигота гибнет. Поэтому на Земле не существует человека, имеющего оба DQ альфа 201 и бета 201 гена.

DQА1* 40: 1

У 89% людей с антителами к фосфолипидам либо имеется DQ А 4, либо близко совпадают значения DQ А у партнеров. Совпадение матери и ребенка по DQ альфа наблюдается при невынашивании беременности (наступившей или как неудачи ЭКО). При благополучном завершении беременности чаще наблюдается несоответствие по DQ между матерью и ребенком. Если у обоих родителей имеется DQ 4, у ребенка получается генотип DQ 4, 4. Некоторые из этих беременностей не ухудшают вероятность вынашивания второго ребенка, если только HLA G-молекулы у супругов не очень близки. Первый ребенок рождается после нормально протекавшей беременности, и единственная его проблема может заключаться в том, что он сам может быть родителем DQ 4, 4-ребенка и иметь проблемы с вынашиванием второго ребенка. К сожалению, первая DQ 4, 4 – беременность активирует киллерные клетки материнского организма и снижает уровень блокирующих антител. В результате вынашивание второй и последующих беременностей становится невозможным без применения лимфоцитоиммунотерапии для повышения уровня защитных антител и внутривенного введения гамма-глобулина для снижения уровня киллерных клеток.

При совпадении показателей DQ во время беременности назначают гепарин в качестве превентивной меры, даже если тест на антифосфолипидные антитела был отрицательным до беременности. Было показано, что при совпадении генов DQ у родителей, во время беременности может возникнуть резкий всплеск уровня антифосфолипидных антител. Если после 10 недель беременности уровень антител так и остается низким, гепаринотерапию отменяют.

Определение лейкоцитарных антител

С помощью этого анализа изучают выраженность иммунологической цепной реакции, вызванной совпадением DQ-антигенов. Низкие результаты этого анализа говорят доктору о необходимости назначить иммуноцитотерапию лимфоцитами мужа. Некоторые доктора назначают внутривенное введение гамма-глобулина. Другие предлагают просто подсаживать большее число эмбрионов, чтобы снизить вероятность сохранения именно того эмбриона, у которого произойдет полное совпадение DQ-антигенов. Обычно используют лимфоциты мужа. Однако если антигены DQ альфа у супругов очень близки, то используют лимфоциты донора. Эта терапия дает положительный результат, если уровень антител у женщины к Т- и В- лимфоцитам ее мужа превышает 30%, и положителен тест микроцитотоксичности.

Репродуктивный иммунофенотип (иммунограмма).

Этот анализ проводят для определения уровня естественных киллеров. В большинстве случаев наличие естественных киллерных клеток – хороший признак, поскольку они защищают организм от раковых опухолей. Однако бывают ситуации, когда их количество резко возрастает и убивает эмбрион или нарушает работу эндокринной системы, делая невозможным вынашивание беременности. При высоких уровнях естественных киллеров назначается внутривенное введение иммуноглобулина. Наоборот, при низких уровнях естественных киллеров доктора назначают стероидные гормоны, в частности, преднизолон.

При этом анализе определяют следующие типы клеток:

  • CD3 (норма 63-86)
  • CD4 (норма 31-53)
  • CD8 (норма 17-35)
  • CD19 (норма 3-8)
  • CD56 (норма 3-12) (натуральные киллеры)

У 12% женщин с привычным невынашиванием беременности и у 25% с тремя и более неудачами ЭКО отмечен повышенный уровень натуральных киллеров высокая их цитотоксичность относительно клеток плаценты in vitro.

  • CD3/IL2-R (норма 0-5)
  • CD19/CD5 (норма 0-10). высокий уровень нарушает выработку необходимых для беременности гормонов.
  • CD19+/CD5+ Чем выше их уровень, тем больше продукция антител к таким гормонам, как эстрадиол, прогестерон, ХГЧ, а также к серотонину и эндорфинам. Нужно определить уровень антител к гормонам, чтобы доктор мог назначить нужное количество недостающих гормонов. Тест на определение антител к прогестерону Вы можете проделать самостоятельно. Возьмите ампулу с прогестероном, разбейте и нанесите каплю на внутреннюю поверхность предплечья. Сверху закройте пластырем. Первая реакция (покраснение, опухание и уртикарные высыпания вокруг), вызванная антителами, появляется через 15 мин. Затем кожа бледнеет и возвращается в нормальное сстояние, пока не наступит вторая реакция (обычно через 24 часа), вызванная рaботой CD19+/5+ клеток. Доложите о результатах своему доктору.

Антинуклеарные антитела

Эти антитела играют роль в патогенезе таких заболеваний, как ревматоидный артрит и системная красная волчанка а также могут приводить к невынашиванию беременности и бесплодию. Чаcто при этом обнаруживается титр антител 1:40 и выше при неоднородном паттерне. Такой паттерн нехарактерен для СКВ и РА.

Антитела к ДНК и гистонам

Если у женщины обнаруживаются антитела к гистонам, имеющие неоднородный паттерн, значит ее организм отторгает эмбрион.

Антитела к фосфолипидам

При положительных результатах этого анализа нарушается свертываемость крови у матери, образуются микротромбы, которые нарушают снабжение кровью ребенка. Также эти антитела являются причиной плохого прикрепления эмбрина в матке. Лечение – аспирин и гепарин. Эти препараты назначают еще до беременности, в течение цикла зачатия. Это лечение хорошо известно и широко применяется врачами, иногда ои его назначают без проведения необходимых исследваний, и выкидыш все равно происходит, поскольку причиной невынашивания могли быть другие иммунологические нарушения, требующие проведения иммуноцитотерапии лимфоцитами мужа, внутривенного введения иммуноглобулина или назначения преднизолона.

Другие исследования

К ним относится определение волчаночного аникоагулянта, антител к гормонам, антител к щитовидной железе. Перед введением иммуноглобулина нужно проведение аллергического теста на иммуноглобулины

Литература:

  1. Доброхотова Ю.Э., Джобава Э.М., Озерова Р.И. «Неразвивающаяся беременность: тромбоэмболические и клинико-иммунологические факторы:руководство.-М.:ГЭОТАР-Медиа,2010-144с.
  2. Кулаков, В.И. Лечение женского и мужского бесплодия / В.И. Кулаков // Вспомогательные репродуктивные технологии — настоящее и будущее / Под ред. В.И. Кулакова, Б.В. Леонова, Л.Н. Кузьмичева. -М.: МИА, 2005. - 591с.
  3. Сидельникова В.М. «Привычная потеря беременности», -М.: издательство «Триада-Х», 2005г.
  4. Определение наследственной предрасположенности к некоторым частым заболеваниям при беременности. Генетическая карта репродуктивного здоровья: методические рекомендации, под редакцией член-корреспондента РАМН,д.м.н. профессора Баранова В.С., академика РАМН,заслуженного деятеля науки РФ д.м.н. профессора Э.К. Айламазяна –СПб.: «Изд-во Н-Л», ООО, 2009г.-68с.
  5. Тетруашвили, Н.К. Соотношение цитокинов на ранних этапах гестации у больных с привычным выкидышем в анамнезе / Н.К. Тетруашвили, В.М. Сидельникова, В.Н. Верясов, Г.Т. Сухих // Мать и дитя: материалы IV Рос. науч. форума. – М., 2002. – С. 102
  6. Тетруашвили, Н.К. Привычное невынашивание беременности / Н.К. Тетруашвили // Клинические рекомендации. Акушерство и гинекология / Под ред. В.И. Кулакова. - М.: ГЭОТАР – Медиа, 2006. - Выпуск 2. – С. 35-71
  7. Тирская Ю.И., Е. Б. Рудакова И. А. Шакина М. А. Пилипенко Е. А. Полторака А. Е. Любавина «Синдром потери плода»; «Лечащий врач» №11 - 2009г, М.

kemmamed.ru

Роль сенсибилизации к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности

На правах рукописи ГЛАДКОВА КРИСТИНА АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К ПРОГЕСТЕРОНУ В КЛИНИКЕ ПРИВЫЧНОГО НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

14 00 01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2008

003449973

Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Вера Михайловна Сидельникова

доктор медицинских наук,

академик РАМН, профессор Геннадий Тихонович Сухих

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Людмила Евгеньевна Мурашко

(МОНИИАГ)

Ведущее учреждение: Российский Университет Дружбы Народов. Защита диссертации состоится «11» ноября 2008г в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208 125 01 при ФГУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им В И Кулакова Росмедтехнологий" по адресу 117997, г Москва, ул Академика Опарина, д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им В И Кулакова Росмедтехнологий"

Автореферат разослан «_»_2008г

Ученый секретарь диссертационного совета

(ФГУ "НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий")

доктор медицинских наук, профессор

Ольга Федоровна Серова

доктор медицинских наук

Е.А. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Согласно современным представлениям до 80% ранних репродуктивных потерь неясной этиологии обусловлено иммунологическими нарушениями, которые принято подразделять на аллоиммунные и аутоиммунные

Данное исследование посвящено изучению аутоиммунных механизмов прерывания беременности и в частности антителообразования к прогестерону Согласно данным американской школы акушеров, занимающихся иммунологией репродукции [Beer А Е , Kwak J Y Н, 1999], аутоантителл к прогестерону играют негативную роль в генезе привычного невынашивания беременности

Иммунологическая реакция во время беременности необходима для распознавания материнским организмом чужеродных ему антигенов плода В результате на системном и локальном уровнях развиваются механизмы иммуносупрессии, необходимые для иммунолоштеской защиты фстоплацентарного комплекса в течение беременности Одновременно с этим индуцируются механизмы плацентарного иммунотрофизма, способствующие развитию трофобласта и затем плаценты Причиной репродуктивных потерь иммунологического генеза может явиться нарушение в деятельности одного или нескольких перечисленных компонентов

В последние годы наибольшее внимание исследовагелей привлечено к аутоиммунным аспектам репродуктивных потерь

С общепринятых позиций, под аутоиммунными состояниями понимают ряд симптомов и заболеваний, возникающих вследствие неконтролируемой активности иммунных реакций, направленных против собственных структур организма В нормальных условиях существует иммунологическая толерантность к собственным клеткам, тк в пре- и постнатальном периоде клеточные клоны, возникающие против собственных структур, блокируются

или разрушаются Однако при определенных условиях эта толерантность может нарушаться, что ведет к развитию патологического процесса

Наличие аутоантител является нормальным физиологическим и жизненно-необходимым компонентом, обеспечивающим существование организма Аутоиммунная катастрофа возникает в тех ситуациях, когда количество, эпитопная специфичность и аффинность аутоантител превышают допустимые границы

Аутоантитела обнаруживаются при многих заболеваниях скорее как реальность, чем как причина, тем не менее, при таких заболеваниях как антифосфолипидный синдром, аутоиммунный тиреоидит и др аутоантитела играют основную патогенетическую роль Вероятно, понимание механизмов иммунологического взаимодействия во время беременности позволит определить место и роль антителообразования к гормонам в генезе репродуктивных потерь Считается, что на долю аутоиммунизации приходится до 22% привычного невынашивания беременности иммунною генеза [Mahnowski А, Szpakowski М , Zeman К, 1997]

Научные исследования роли антител к. стероидам проводились с начала 30 годов XX века, когда была сформулирована концепция аллергии на гормоны яичников [Bosze Р, 1988] В дальнейшем, в 70-80 годы прошлого столетия разрабатывались контрацептивные средства на основе моноклональных антипрогестероновых антител [Dalgleish A G, Kennedy R С ,1988, Йен С С К, Джаффе РБ, 1998] Тем не менее, несмотря на многолетние исследования в этой области успехи создания вакцин на основе прогестерона нельзя признать обнадеживающими

Более того, появились публикации о роли аутоантител к прогестерону в генезе предменструального синдрома, дисменореи, аутоиммунного дерматита [Rasi А, Khatami А , 2004, Baptist А Р , Baldwin J L, 2004] Исследования роли патологической сенсибилизации к про1естерону при привычном невынашивании беременности стали проводиться только в последние годы [Beer АЕ, 1999] При высоком уровне антител к прогестерону могут

нарушаться механизмы, обеспечивающие процессы имплантации, формирования трофобласта, развития беременности

Н Оогеат и соавт (1997) впервые выделили антипрогестероновые антитела ^М и подробно исследовали их структуру II И. ЯоЬу и соавт (2006) определяя с помощью иммуноферментного анализа антитела к прогестерону и эстрадиолу 1цО, ^М и ^Е, установили высокую частоту наличия ауюантител у пациенток с астмой, мигренями, дерматитом и дисменореей

В работе АМ Шекэоп и соавт (2007) на основании трансдермальных тсстов, проведенных во II фазу менструального цикла, женщинам с самопроизвольными репродуктивными потерями в анамнезе выявлена сенсибилизация к прогестерону в 69% случаев По мнению авторов, причинами аутосенсибилизации явились предшествующие репродуктивные потери, а также прием препаратов гестагенового ряда в анамнезе

Таким образом, возможность как спонтанного, так и индуцированною появления аутоантител к прогестерону делает актуальной изучение проблемы влияния патологической аутосенсибилизации к этому гормону на репродуктивную функцию женщины

Цель исследования

Целью настоящею исследования является оптимизация тактики нредгестационной подготовки и ведения беременности у женщин с привычными репродуктивными потерями аутоиммунного генеза с учетом сенсибилизации к прогестерону

Задачи исследования

1 Определить частоту встречаемости аутосенсибилизации к прогестерону у пациенток с привычным невынашиванием беременности

2 Изучить предрасполагающие факторы, приводящие к развитию сенсибилизации к прогестерону

3 Провести анализ гинекологической заболеваемости, состояния репродуктивной системы, иммунного статуса у женщин с аутосенсибилизацией к прогестерону и привычным невынашиванием беременности

4 Разработать и оценить влияние комплексной предгестационной подготовки на иммунологические, ультразвуковые показатели у женщин с сенсибилизацией к прогестерону

5 Изучить особенности течения беременности у женщин с сенсибилизацией к прогестерону

6 На основании полученных результатов разработать тактику ведения беременности у женщин привычны невынашиванием беременности и сенсибилизацией к прогестерону

Новизна исследования

Впервые проведено комплексное обследование пациенток с привычным невынашиванием беременности на наличие аутоантител к прогестерону

Установлено, что развитию аутосенсибилизации к прогестерону у женщин с привычным невынашиванием беременности способствуют самопроизвольные и искусственные прерывания беременности в анамнезе, аутоиммунные заболевания, использование в лечении препаратов прогестеронового ряда при предыдущих беременностях

Выявлены клинические проявления аутосенсибилизации к прогестерону у женщин с привычным невынашиванием беременности Вне беременности синдром аутосенсибилизации к прогестерону характеризуется дисменореей, гипоплазиеи эндометрия, повышением относительного содержания лимфоцитов с фенотипом СБ 19+5+ в периферической крови

Наиболее частыми осложнениями течения беременности являются гипоплазия хориона (33%) и плацентарная недостаточность (19,2%)

Полученные данные позволяют более глубоко понять генез прерывания беременности у сенсибилизированных женщин и оптимизировать комплекс мероприятий по подготовке к беременности

Практическая значимость

Устинов тена целесообразность включения в алгоритм обследования у женщин с потерями беременности в анамнезе определения аутосенсибилизации к прогестерону

На основании тщательною иммунологического обследования оптимизированы схемы лечения с учетом выявленных нарушений у каждой конкретной больной

Разработана оптимальная предгестационная подготовка и тактика ведения беременности пациенток с аутосенсибшшзацией к прогестерону, включающая использование препаратов иммуноглобулина, метилпреднизолона и дидрогестерона

Определены критерии эффективности проведенного лечебного воздействия вне и вовремя беременности, включающие нормализацию иммунного, интерферонового статуса, состояния эндометрия, снижения активности аутоантител к прогестерону

Положения, выносимые на защиту:

1 Аутосенсибилизация к прогестерону выявлена у 42% женщин с привычными репродуктивными потерями и, возможно, является одним из факторов, приводящих к привычному невынашиванию беременности

2 Наличие антител к прогестерону клинически проявляется дисменореей, гипоплазией эндометрия во II фазе менструального цикла при нормальном уровне прогестерона в крови Отмечена эффективность проведения комплексного лечения с использованием препаратов иммуноглобулина, метилпреднизолона, дидрогестерона и иммуномодулирующей терапии в качестве подготовки к зачатию

3 У пациенток с аутосенеибилизацией к прогестерону отмечается развитие гипоплазии хориона в I триместре беременности и в ряде случаев плацентарной недостаточности с внутриутробной задержкой развития плода Адекватная терапия в процессе беременности, с использованием препаратов иммуноглобулина, метилпреднизолона и дидрогестерона, своевременные профилактика и лечение плацентарной недостаточности позволяют добиться рождения жизнеспособных детей в 92,1% случаев

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции отделения профилактики и лечения невынашивания беременности совместно с лабораторией клинической иммунологии 17 12 2007г и на заседании апробационной комиссии ФГУ "НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий" 24 12 2007г

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования и основные рекомендации, вытекающие из них, используются в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности ФГУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им В И Кулакова Росмедтехнологий" при обследовании и лечении супружеских пар с привычными потерями беременности, использованы в подготовке образовательных программ для врачей, проходящих обучение на базе Центра, а также семинаров по вопросам привычного невынашивания беременности По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций, изложена на 117 страницах машинописного текста (включая список литературы), работа иллюстрирована 34 табтицами, 2 диаграммами и 3

рисунками Библиографический указатель включает 183 источников, из них 16 отечественных, 167 иностранных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Для реализации поставленных задач, с целью проведения скрининга на наличие аутосенсибилизации к прогестерону, нами было проведено обследование 260 женщин, обратившихся за консультацией в научно-поликлиническое отделение ФГУ "НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий" в течение 2004-2007 гг по поводу привычной потери беременности Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил 31,2+4,2 лет Проанализированы анамнестические данные у 205 (78,9%) женщин имело место привычное невынашивание беременности ранних сроков (2-7 самопроизвольных выкидыша и/или неразвивающихся беременностей в сроках 5-12 недель гестации), у 32 (12,3%) женщин - поздние гестационные потери при сроках 16-24 недель беременности, у 23 (8,8%) -антенатальная гибель плода в анамнезе в сроках 24-38 недель гестации

Результаты проведенного скрининга сенсибилизация к прогестерону выявлена у 42% (109) женщин В 58% (151) случаев аутоантитела к прогестерону не выявлялись

Таблица 1

Результаты скрининга на наличие аутосенсибилизации к прогестерону

Скрининг 260 пациенток

Отсутствие сенсибилизации к прогестерону 151 (58%)

Сенсибилизация к прогестерону 109 (42%)

52 (20%)

ш 41 (15,8%)

и Г§0 16(6,2%)

После проведенного обследования из 260 женщин были отобраны 89 пациенток в две группы исследования

Критериями отбора в группы исследования явились репродуктивный возраст, наличие или отсутствие аутоантител к прогестерону, отсутствие по данным клинико-лабораторного обследования активации бактериально-вирусной инфекции, отсутствие пороков развития матки, отсутствие аномалий кариотипа, возможность проведения обследования и ведения беременности в условиях ФГУ НЦ АГиП

В соответствии с критериями включения основную группу составили 52 женщины с наличием аутоантител к прогестерону Группу сравнения составили 37 женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе и отсутствием аутосенсибилизации к прогестерону

Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил в I группе 31,1+4,3 лет, во II группе - 31,3+4,2 лет

Все женщины прошли тщательное клиническое и лабораторно-инструментальное обследование, включающие генетические,

иммунологические, вирусологические, гемостазиологические,

микробиологические и биохимические методы исследования

Определение антител к прогестерону проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА), разработанным в лаборатории клинической иммунологии ФГУ "НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий "

На полистирольные микропланшеты (Nunc, Дания) иммобилизовали конъюгат прогестерон- lla-БСА (Michigan Diagnostics, LLC, США) из фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) при 20±2°С в течение 18±2 часов Перед проведением ИФА образцы сывороток крови разводили 1 100 раствором для разведения (ФСБР, содержащий 0,5% желатина и 0,5% твина-20) и вносили по 100 мкп в лунки планшета с иммобилизированным на поверхности полистирола прогестероном Инкубировали на встряхивателе при 20±2°С в течение 60 минут, отмывали 4 раза ФСБР, содержащим 0,5% твина-20

Затем вносили мышиные моноклональные антитела против иммуноглобулинов М и G человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) После инкубации при 20±2°С в течение 60 минут лунки отмывали и добавляли по 100 мкл субстратно-хромогенного раствора, содержащего тетраметилбензидин и перекись водорода Планшеты инкубировали в течение 15-20 минут, ферментативную реакцию останавливали внесением в лунки по 100 мкл 0,5М h3SO4 При постановке исследования использовались положительный и отрицательный контроли Учет результатов анализа проводили инструментально путем измерения оптической плотности на фотометре "Multiskan" (Labsystem, Финляндия) при длине волны 450 нм

Результаты исследования оценивали полуколичественным способом Пограничное значение (cut-off) определяли как сумму среднего значения оптической плотности отрицательного контроля и трех среднеквадратичных отклонений Проба считалась слабоположительной при средней оптической плотности, превышающей cut-off до 1,5-2 раз, положительной - при превышении cut-off в 2 раза, резкоположительной - в 3 и более раз

Антитела к хорионическому гонадотропину человека и антифосфолипидные антитела (к кардиолипину, фосфатидилсерину, фосфатидилхолину, фосфатидилэтаноламину) (IgM, IgG) определялись по методикам иммуноферментного анализа, разработанным в лаборатории клинической иммунологии НЦ АГиП

Исследование клеточного звена иммунитета проводилось выделением лейкоцитов из периферической крови методом градиентного центрифугирования, производилась характеристика субпопуляционно! о состава лейкоцитов периферической крови методом проточной цитофлуометрии и определение иммуноглобулинов класса G, М, А методом радиальной иммунодиффузии по Манчини Для определения интерферонового статуса биологическим методом (Григорян С С, Ершова Ф И 1989) использовали препараты цельной крови

Ультразвуковое исследование, допплерометрия выполнялись с использованием трансабдоминальных и трансвагинальных мультичастотных датчиков с частотой 8-6-4 МГц

Статистическая обработка полученных данных выполнена на компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладного программного обеспечения «Statistics for Windows», версия 7, StatSoft Inc (США)

Клиническая часть работы выполнена в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности (руководитель - профессор В M Сидельникова), научно-поликлиническом отделении Центра (руководитель -профессор В H Прилепская) Родоразрешение больных проводилось в I-акушерском отделении Центра (руководитель - профессор Е А Чернуха)

Лабораторные методы исследования осуществлялись в следующих подразде тениях ФГУ "НЦ АГиП им В И Кулакова Росмедтехнологий" лаборатория клинической иммунологии (руководитель - академик РАМН, профессор Г Т Сухих), лаборатория функциональной диагностики (руководитель - профессор В H Демидов), лаборатория генетики (руководитель - профессор В А Бахарев), лаборатория микробиологии (руководитель -профессор А С Анкирская)

Результаты исследования и их обсуждение

В соответствии с поставленными задачами нами был проведен анализ анамнестических данных, результатов клинического, лабораторно-инструментально1 о обследования, течения и исходов беременностей у 89 женщин с привычным невынашиванием беременности

На основании проведенного сравнительного анализа анамнестических данных нами выявлено, что предшествующие искусственные и самопроизвольные репродуктивные потери, сопровождающиеся иммуногормональным стрессом, Moiyr способствовать синтезу аутоантител, что согласуется с результатами исследования A M Itsekson и соавт (2007)

При анализе соматической заболеваемости пациенток с сенсибилизацией к прогестерону установлено, что аутоиммунизация к прогестерону чаще всего наблюдается у женщин с аутоиммунными заболеваниями, такими как аутоиммунный тиреоидит, АФС, аутоиммунный васкулит Аутоиммунные заболевания достоверно чаще диагностированы у женщин I группы в 25% случаев по сравнению с 2,7% во II группе (р<0,001)

Принимая во внимание данные литературы о роли аутоантител к прогестерону в генезе дисменореи (Roby R R, 2006) нами был проведен анализ гинекологической заболеваемости У женщин с аутосенсибилизацией к прогестерону выявлен более высокий процент дисменореи и гипоплазии эндометрия, 61,5% и 55,8% соответственно, по сравнению с аналогичными показателями во II группе 35,1% (р<0,05) и 8% (р<0,001) Характерной особенностью пациенток с сенсибилизацией к прогестерону является прием препаратов прогестерона в анамнезе в 76,9% случаев

Установлено, что при наличии аутосенсибилизации к прогестерону отмечается повышение содержания в периферической крови лимфоцитов с фенотипом CD 19+5+, что свидетельствует об активации антителообразования и согласуется с данными А Е Beer и соавт (1999)

Доказательством системной аутоиммунной активности является выявление у пациенток с антителами к прогестерону аутосенсибилизации к ХГЧ в 53,8% случаев, АФА - в 55,8%, антител к аннексину - у 9,5% и антител к ß2-гликопротеину-1 - у 15,4% женщин В группе сравнения аутосенсибилизация к ХГЧ диагностирована в 21,6% случаев, АФА - в 18,9%, антитела к аннексину выявлены - у 2,7% и антитела к р2-гликопротеину-1 - у 8,1 % женщин (р<0,05)

Всем пациенткам было проведено тщательное клинико-лабораторное обследование и подготовка к беременности

Система проводимых реабилитационных мероприятий включала - нормализацию параметров иммунного и интерферонового статусов, с применением индукторов интерферона, с учетом подбора чувствительности,

— подготовку эндометрия, с использованием препаратов гестагенного ряда (дюфастон во II фазу менструального цикла в дозировке 20 мг в сутки) в течение двух менструальных циклов,

— в качестве иммуномодулирующей терапии проводилось лечение иммуноглобулином в цикле зачатия на 8-10 день цикла (интраглобин, октагам курсовая доза 5,0-10,0г),

— глюкокортикоидную терапию метилпреднизолоном (мегипред) 4мг в сутки, начиная со II фазы предполагаемого фертильного цикла, пациенткам с аутосенсибилизацией к прогестерону,

— иммуноцито герапию лимфоцитами мужа или донора на 5-7 день менструального цикла в цикле зачатия (при совместимости супругов по системе НЬА по 3 аллелям и отсутствии АФС, в I группе - 10 и во II - 8 пациенткам)

После проведения перечисленных мероприятий в случае нормализации параметров контрольных исследований иммунного, интерферонового статуса и состояния эндометрия беременность разрешалась

Особенности течения беременности были прослежены у 52 женщин I группы и 37 во II

Таблица 2

Структура осложнений течения беременности у обследуемых групп женщин

Вид патологии I группа («=5?) II группа (п=37)

абс % абс %

Гипоплазия хориона 17 33,0* 1 2,7

Плацентарная недостаточность 10 19,2** 4 10,8

*р<0,001

**р<0,05

Анализ течения беременности пациенток с сенсибилизацией к прогестерону показал, что, несмотря на проводимую подготовку, профилактику и своевременную терапевтическую коррекцию, наиболее характерным осложнением беременности является гипоплазия хориона в I триместре

14

беременности, которая составила 33% и в дальнейшем определяла формирование плацентарной недостаточности в 19,2% наблюдений (таблица 2) В группе сравнения гипоплазия хориона диагностирована в 2,7%, плацентарная недостаточность в 10,8% наблюдений (р<0,001 и р<0,05)

По видимому, механизм прерывания беременности при сенсибилизации к прогестерону связан с формированием неполноценной первой волны инвазии трофобласта, что клинически проявляется гипоплазией хориона в сроках 5-6 недель беременности

Опираясь на анализ особенностей течения беременности у пациенток с сенсибилизацией к прогестерону, нами были сформулированы и научно обоснованы принципы ведения беременности, сочетающие эффективность лечения и безопасность для пациентки

Терапия во время беременности включала в себя

- дидрогестерон (дюфастон) 20-30 мг в сутки с цикла зачатия до 16 недель беременности,

- использование глюкокортикоидных препаратов -метилпреднизолон (метипред) в дозе 4-8 мг в сутки в течение всей беременности,

- препараты иммуноглобулина, инграглобин, октагам курсовая доза 5,0-10,Ог, 3 и более курса в течение беременности (в сроке 7-8 недель беременности, в 24 недели и перед родоразрешением),

- иммунотерапию лимфоцитами мужа или донора пациенткам с совместимостью антигенов по системе НЬА по 3 и более аллелям и также при гипоплазии хориона (в I группе 22 и во II группе 8 пациенткам),

- профилактику и/или комплексную терапию плацентарной недостаточности и гипотрофии плода препаратами актовегин 200 мг - 5,0 мл внутривенно капельно №5-10, инстенон 2,0 мл внутривенно капельно №5-10, пирацетам 20%-5,0 мл внутривенно капельно №5-10, инфезол 500,0 мл внутривенно капельно №5-10,

- При клинических проявлениях угрозы преждевременных родов с учетом срока беременности и противопоказаний назначали один из видов токолитической терапии (ß-адреномиметики, нифедипин, индометацин и магнезиальная терапия)

На современном этапе изучения аутоиммунных состояний наиболее дискутабельным является вопрос об использовании глюкокортикоидных препаратов, тк по данным некоторых исследователей возможно развитие побочных эффектов у новорожденного В то же время имеются данные [Scott JR, 1994], свидетельствующие о высокой эффективности глюкокортикоидной терапии в качестве подготовки к беременности и лечения аутоиммунных процессов непосредственно во время беременности за счет снижения антителообразования, угнетения системы комплемента и образования фиксированных и циркулирующих иммунных комплексов Quenby S и соавт (2005) в своем исследовании доказали эффективность предгестационной подготовки с применением преднизолона у пациенток с аутоиммунными нарушениями и высоким уровнем естественных киллерных клеток в эндометрии В работе ПА Кирющенкова (2001) доказана высокая эффективность применения глюкокортикоидных препаратов, как в качестве предгестационной подготовки, так и терапии в течение беременности при аутосенсибилизации к ХГЧ

Также имеются данные об отсутствии неблагоприятного влияния метилпреднизолона на плод и новорожденного Это связано с рядом факторов

— повышенной способностью материнской плазмы связывать глюкокортикоидные препараты, что ограничивает их перенос через плаценту,

— высокой ферментативной активностью плацентарного барьера,

— не способностью печени плода реактивировать препарат до конца II триместра

Еще один дискутабельный вопрос о применении иммуноглобулина в лечении беременных с аутоиммунными нарушениями Имеются

многочисленные данные о том, что большие дозы иммуноглобулина подавляют продукцию аутоанттел Рекомендуемая доза составляет 1г/1кг веса в течение 2-х дней каждого месяца беременности до 36 недель, терапию начинали с ранних сроков беременности, проводимое лечение дало хорошие результаты -все пациентки благополучно завершили беременность Тем не менее, существует много противников терапии иммуноглобулином и основные положения состоят в следующем

- высокая стоимость препаратов иммуноглобулина,

- возможность передачи вирусной инфекции,

- существуют осложнения лечения в виде тошноты, головной боли, гипотензии, аллергических реакций вплоть до анафилактического шока, Несмотря на возражения, интерес к терапии иммуноглобулином

чрезвычайно высок С целью уменьшения побочных эффектов и, что немало важно, стоимости терапии, в настоящее время разрабатываются алгоритмы лечения иммуноглобулином с использованием низких доз В КоМап и соавт в (2006) успешно проводили лечение пациенток с привычным невынашиванием беременности иммунного генеза внутривенным иммуноглобулином в курсовой дозе 0,5г/кг В работе IIВ БШскег и соавт (2000, 2005) доказана эффективность низких доз иммуноглобулина в лечении спонтанных репродуктивных потерь аутоиммунного генеза В исследовании проводилась предгестационная подготовка иммуноглобулином в цикле зачатия, курсовая доза составила 0,2г/кг, затем терапия продолжалась во время беременности ежемесячно до 2630 недель гестации На фоне проводимого лечения благополучно беременность завершилась в 95% случаев

Под влиянием проводимой терапии у пациенток I группы в сроке 8-9 недель беременности, отмечено выраженное снижение активности аутоантител Антитела к прогестерону определялись гочько у 42,3% (22) пациенток (р<0,05) I группы (таблица 3)

Таблица 3

Определение аутоантител к прогестерону у пациенток I группы в сроке 8-9

недель беременности

Аутоантитела к прогестерону I группа до лечения (п=52) I группа после лечения (п=52)

абс % абс %

1БМ 19 39,5* 8 15,4

24 46* 11 21,1

^М и 9 17,5* 3 5,8

*р<0,05

В 92,1% (82) наблюдениях беременность завершилась рождением жизнеспособного потомства Таким образом, результаты проведенной работы продемонстрировали сопоставимую эффективность комплексной предгестационной подготовки и лечения в течение беременности, хорошую переносимость препаратов и отсутствие побочных эффектов Исходы беременностей у наблюдаемых женщин представлены в таблице 4

Таблица 4

Исходы наблюдаемых беременностей у обследованных женщин

Исходы беременностей I группа (п=52) II группа (п=37)

абс % абс %

Неразвивающаяся беременность 2 3,8 2 5,4

Анэмбриония 1 1,9 1 2,7

Антенатальная гибель плода 1 1,9 — —

Преждевременные роды 3 5,8 1 2,7

Своевременные роды 45 86,6 33 89,2

При доношенном сроке было родоразрешено 78 женщин, преждевременные роды имели место у 4 пациенток

У 4 женщин в сроке 7-8 недель гсстации диагностирована неразвивающаяся беременность (I группа 3,8% (2), II группа 5,4% (2)) Анэмбриония была диагностирована в двух наблюдениях (в каждой группе но 1 случаю) В I группе у 1 (1,9%) женщины произошла антенатальная гибель плода в сроке 28 недель гестации на фоне плацентарной недостаточности тяжелой степени, преэклампсии легкой степени У пациенток с ранними потерями была диагностирована совместимость супругов по системе HLA более чем по грем локусам, сенсибилизация к ХГЧ, АФА При ультразвуковом исследовании до наступления неразвивающейся беременности диагностирована гипоплазия хориона Кариотипирование эмбриона было проведено в 1 случае, кариотип абортуса - 46 XX После удаления остатков плодного яйца была назначена реабилитационная терапия и подготовка к беременности с учетом выявленных нарушений

У 92,1% (82) женщин исследуемых групп беременность завершилась родами, у 92,3% (48) пациенток в I и 91,9% (34) во II группе соответственно

Своевременные самопроизвольные роды произошли у 42,7% (38) женщин, в I группе у 22, во II группе у 16 Родоразрешены путем операции кесарево сечение 44,5% (40) женщин (в I группе 23, во II группе 17) Дети в обеих группах родились с массой тела в среднем 3268,1±197,9г, длиной 50,25±1,03см, оценка по шкале Апгар составила 8/9 баллов

Преждевременно были родоразрешены 3 пациентки в I группе и 1 во II Причинами преждевременных родов являлись краевая отслойка плаценты при частичном предлежании в сроке 33-34 недель беременности у 1 (1,9%) пациентки I группы, преждевременное излитие околоплодных вод в сроке 34-35 недель i естации, в I группе у 2 (3,8%) женщин и во II группе у 1 (2,7%) Во всех случаях преждевременных родов родились жизнеспособные дети с оценкой по шкале Апгар 7/8 баллов, средняя масса при рождении составила 2165,5±95,2г, длина 43,75± 1,0см

выводы

Среди пациенток с привычной потерей беременности сенсибилизация к прогестерону выявлена в 42% случаев Аутосенсибилизация к прогестерону в основном диагностируется в группе пациенток, у которых выявлены различные аутоантитела (к ХГЧ, тиреохлобулину, АФА) Предрасполагающими факторами развития аутосенсибилизации к прогестерону у женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе являются отягощенный аллергологический анамнез (25%), самопроизвольные и искусственные (40,4%) прерывания беременности, искусственное прерывание первой беременности (26,9%), прием препаратов нрогестеронового ряда при предыдущих беременностях (76,9%)

Вне беременности синдром аутосенсибилизации к прогестерону характеризуется определенными клиническими и иммунологическими изменениями дисменорея (61,5%), гипоплазия эндометрия (55,8%), повышение относительного содержания лимфоцитов с фенотипом СБ 19+5+ (42,3%) в периферической крови

Проведение соответствующей предгестационной подготовки, которая должна включать в себя нормализацию параметров иммунного и интерферонового статусов, снижение уровня СО 19+5+ в периферической крови, нормализацию толщины эндометрия, путем применения дидро1 естерона и иммуномодуляторов способствовало более благополучному течению беременности

На фоне проводимой прегравидарной подготовки и профилактики плацентарной недостаточности течение беременности при аутосенсибилизации к прогестерону характеризуется высокой частотой развития гипоплазии хориона (33%) и развитием плацентарной недостаточности (19,2%)

Терапия, проводимая у беременных с сенсибилизацией к прогестерону, должна носить комплексный и дифференцированный характер с

использованием метилпреднизолона и препаратов иммуноглобулина, необходимо своевременно проводить профилактику и лечение плацентарной недостаточности Своевреме1шая диагностика и комплексная терапия у женщин с аутосенсибилизацией к прогестерону и привычным невынашиванием беременности способствовали рождению жизнеспособных детей в 92,1% случаев

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В алгоритм обследования женщин с привычными потерями беременности, отягощенным аллергологическим анамнезом следует включить обследование на наличие антител к прогестерону При выявлении антител к прогестерону предгестационная подготовка включает в себя коррекцию иммунного статуса и подготовку эндометрия препаратами иммуноглобулина, дидрогестерона, а также назначение метилпреднизолона, начиная со II фазы предполагаемого фертильного цикла Применение препаратов натурального прогестерона нецелесообразно в связи с возможностью усиления сенсибилизации к прогестерону

Во время беременности необходимо продолжить проводимую глюкокортикоидную терапию метилпреднизолоном (4-8мг/сут), проводить курсы внутривенного введения иммуноглобулина (курсовая доза 5-Юг, минимум 3 курса в течение беременности), в I триместре беременности прогестсроновую поддержку осуществлять препаратом дидрогестерона (20-30мг/суг) до 16 недель беременности У беременных женщин с аутосенсибилизацией к прогестерону необходимо проводить профилактику плацентарной недостаточности, начиная с I триместра беременности

ВА

АФА

HLA

Ig

АФС

ХГЧ

CD

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

антитела к фосфолипидам антифосфолипидный синдром волчаночный антикоагулянт

р2 субъединица хорионического гонадотропина человека кластер дифференцировки лейкоцитарные антигены человека иммуноглобулин

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гладкова, К.А. Сенсибилизация к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности первого триместра [Текст] / К А Гладкова, ИВ Менжинская // Мать и дитя материалы VII Рос науч форума - 2005 - С 48

2 Гладкова, К.А. Сенсибилизация к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности [Текст] / К А Гладкова, И В Менжинская // Мать и дитя материалы VIII Рос науч форума -2006 - С 69

3 Гладкова, К.А. Аугосенсибилизация к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности [Текст] / К А Гладкова // Первый международный конгресс по репродуктивной медицине - 2006 - С 203-204

4 Гладкова, К.А. Роль сенсибилизации к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности [Текст] / К А Гладкова, И В Менжинская, В М Сидельникова, Г Т Сухих // Проблемы репродукции. - 2007. - №6 - С. 95-99.

5 Гладкова, К.А. Аугосенсибилизация к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности [Текст] / К А Гладкова, И В Менжинская // Мать и дитя материалы IX Рос науч форума - 2007 - С 51

6 Привычное невынашивание беременности Антитела к прогестерону [Текст] / В М Сидельникова, К.А. Гладкова // Акушерство национальное руководство под ред Э К Айламазяна, В И Кулакова, В Е Радзинского, Г М Савельевой - 2007 - С

7 Антипрогестероновые антитела в клинике привычного невынашивания беременности [Текст] /ИВ Менжинская, К А Гладкова, В М Свделышкова, Г Т Сухих // Иммунология. - 2008 - №1. - С 34-37.

8 Антитела к прогестерону у женщин с привычным невынашиванием беременности [Текст] /ИВ Менжинская, К.А. Гладкова, В М Сидельникова, Г Т Сухих//Аллергология и иммунология -2008 -том 9 -С 89

medical-diss.com

Способ определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности иммунологии, и предназначено для определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека. Изобретение раскрывает способ непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, в котором в качестве антигена на поверхность полистирола иммобилизуют конъюгат прогестерона с гемоцианином: гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон. Предлагаемый способ технически прост, информативен, обладает высокой чувствительностью и специфичностью при определении антител к прогестерону в сыворотке и плазме крови больных с привычным невынашиванием беременности и бесплодием, его применение позволяет получить достоверные результаты при хранении готовых планшетов до 1 года. Изобретение может быть применено для обследования больных с различной акушерско-гинекологической патологией. 7 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу определения антител к прогестерону, и может быть использовано в биологии и медицине для определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека при акушерско-гинекологической патологии, а именно при привычном невынашивании беременности, бесплодии, у больных с гипоплазией эндометрия, неудачами в программах экстракорпорального оплодотворения, с акушерскими осложнениями (гипоплазия хориона, угроза прерывания беременности, хроническая плацентарная недостаточность), с предменструальным синдромом, после применения гормональных контрацептивов и препаратов, содержащих прогестерон.

Известен способ определения антител к прогестерону [1], заключающийся в том, что на поверхность лунок полистирольного микропланшета иммобилизуют конъюгат прогестерона с БСА из 0,1 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора (рН 9,5) в концентрации 10 мкг/мл при 4°С в течение ночи; планшет промывают трисовым солевым буферным раствором (рН 7,4), содержащим 0,05% твина-20; планшет обрабатывают смесью 1,5% БСА и 1,5% желатина в трисовом солевом буферном растворе при комнатной температуре в течение 2 часов и затем при 4°С в течение ночи; сыворотки крови для определения IgM и IgG исследуют в разведении 1:100 по объему и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов, для определения IgE сыворотки исследуют в разведении 1:2 по объему и инкубируют в течение ночи; антитела козы, меченные щелочной фосфатазой, к IgM, IgG или IgE человека инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов; инкубацию с субстратно-хромогенной смесью, содержащей паранитрофенилфосфат, проводят в течение 45 минут. К недостаткам следует отнести сложность и многоэтапностъ методики, включение длительных инкубации, в том числе в течение ночи. Многокомпонентность системы, использование длительных инкубаций, конъюгата поликлональных антител с ферментом для детекции антител к прогестерону приводят к недостаточно высокой чувствительности, специфичности, точности и воспроизводимости определения.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ определения антител к прогестерону [2], заключающийся в том, что конъюгат прогестерона с БСА (БСА-11α-гидроксипрогестерон) иммобилизуют на полистирольную поверхность лунок микропланшета из фосфатно-солевого буферного раствора при 20±2°С в течение 18±2 часов; сыворотки крови разводят 1:100 в фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 0,5% желатина и 0,5% твина-20, и инкубируют на встряхивателе при 20±2°С в течение 1 часа; планшет промывают фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5% твина-20; планшет инкубируют с мышиными моноклональными антителами к IgM, IgG человека, меченными пероксидазой хрена, при 20±2°С в течение 1 часа; планшет инкубируют с субстратно-хромогенным раствором, содержащим 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода. Использование в качестве антигена конъюгата прогестерона с БСА, в котором содержание прогестерона ограничивается 12-16 молекулами прогестерона на 1 молекулу БСА, отсутствие дополнительной обработки поверхности твердой фазы блокирующим раствором, содержащим инертные белки, использование высокой концентрации поверхностно-активного вещества в буфере для промывки и разведения сывороток и конъюгата приводят к ограничению чувствительности, специфичности и точности определения.

Технической задачей изобретения является создание чувствительного, специфичного и простого в исполнении способа определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом ИФА. Эта задача решается описываемым способом определения антител к прогестерону, заключающимся в использовании в качестве антигена конъюгата прогестерона с гемоцианином с высоким содержанием прогестерона от 120 до 150 молекул на 1 молекулу гемоцианина, иммобилизации антигена на поверхность полистирола из водного буферного раствора (рН 7,2±0,2), обработке поверхности водным буферным раствором, содержащим 5-20 мг/мл инертного белка (БСА, желатина), инкубации сывороток крови, разведенных в соотношении 1:10-1:100 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка (БСА, желатина) и 0,05-0,1% по объему твина-20, промывании поверхности до и после инкубации водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, использовании для детекции антител к прогестерону конъюгата моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с ферментом.

Практически способ осуществляется следующим образом.

Конъюгат прогестерона с гемоцианином из лимфы улитки Megathura crenulata (гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон) в водном буферном растворе (фосфатно-солевом, трисовом) с рН 7,2±0,2, содержащем 0,05-0,1% проклина 300, в концентрации 1-5 мкг/мл иммобилизуют на поверхность полистирола при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают указанным водным буферным раствором, поверхность обрабатывают водным буферным раствором, содержащим 5-20 мг/мл инертного белка (БСА, желатина) при 20±2°С в течение 60-90 минут, промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% по объему твина-20. Образцы сыворотки, плазмы крови, разведенные в соотношении 1:10-1:100 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% по объему твина-20, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60-120 минут, поверхность твердой фазы до и после инкубации промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, и инкубируют с конъюгатом мышиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с пероксидазой хрена в разведении в соотношении 1:2000-1:60000 по объему в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% твина-20, при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60±10 минут. После промывания водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, инкубируют с субстратно-хромогенной смесью, содержащей 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода, при 20±2°С в течение 15-20 минут, ферментативную реакцию останавливают 0,5М h3SO4 результат анализа оценивают инструментально путем измерения оптической плотности (ОП) на фотометре при длине волны 450 нм.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что в качестве антигена используют конъюгат прогестерона с гемоцианином, адсорбцию антигена на поверхность полистирола проводят из водного буферного раствора с рН 7,2±0,2 при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают водным буферным раствором и обрабатывают раствором инертного белка (БСА, желатина) с концентрацией 5-20 мг/мл при 20±2°С в течение 60-90 минут, образцы сыворотки, плазмы крови разводят в водном буферном растворе, содержащем 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05-0,1% по объему твина-20, в соотношении 1:10-1:100 по объему и инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200-300 об/мин в течение 60-120 минут, поверхность полистирола до и после инкубации промывают водным буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% твина-20, инкубируют с конъюгатом мышиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, с пероксидазой хрена в водном буферном растворе, содержащим 5-10 мг/мл инертного белка и 0,05%-0,1% твина-20.

Пример 1. Для подтверждения возможности получения технического результата с помощью заявленного способа определения аутоантител к прогестерону используют образцы сыворотки, плазмы крови здоровых доноров и пациенток с привычным невынашиванием беременности и бесплодием.

Конъюгат гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) с рН 7,2±0,2, содержащем 0,05% проклина 300, в концентрации 1 мкг/мл вносят по 100 мкл в лунки полистирольного микропланшета (Nunc MaxiSorp, Thermo Fisher Scientific, Дания) и инкубируют при 20±2°С в течение 18±2 часов. Планшет промывают 4 раза ФСБР. В лунки планшета вносят по 200 мкл ФСБР, содержащего 10 мг/мл БСА, и инкубируют при 20±2°С в течение 90±10 минут. После 4-кратного промывания планшета ФСБР, содержащим 0,05% по объему твина-20, в лунки вносят по 100 мкл образцов сыворотки, плазмы крови, предварительно разведенных в ФСБР, содержащем 5 мг/мл БСА и 0,05% по объему твина-20, в соотношении 1:100 по объему, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200 об/мин в течение 60±10 минут. После 4-кратного промывания планшета ФСБР, содержащим 0,05% твина-20, в лунки вносят конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена к IgM человека в разведении в соотношении 1:30000 по объему, к IgG человека в разведении в соотношении 1:50000 по объему в ФСБР, содержащем 5 мг/мл БСА и 0,05% твина-20, по 100 мкл в лунку, инкубируют при 20±2°С на орбитальном шейкере при 200 об/мин в течение 60±10 минут. После 4-кратного промывания планшетов ФСБР, содержащим 0,05% твина-20, в лунки вносят по 100 мкл субстратно-хромогенного раствора, содержащего 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода, инкубируют при 20±2°С в течение 15-20 минут, реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 0,5 М h3SO4. Оценку результатов проводят инструментально путем измерения ОП на фотометре при длине волны 450 нм.

Пример 2. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена для иммобилизации на твердую фазу используют гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США).

Пример 3. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена для иммобилизации на твердую фазу используют БСА-11α-гидроксипрогестерон (Michigan Diagnostics, США).

Пример 4. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что выполняют 2-кратное титрование образцов сыворотки крови больных с привычным невынашиванием беременности (1:100-1:6400).

Пример 5. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена на поверхность твердой фазы иммобилизуют гемоцианин из лимфы улитки Megathura crenulata (Sigma-Aldrich, США).

Пример 6. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве антигена на поверхность твердой фазы иммобилизуют БСА (Sigma-Aldrich, США).

Пример 7. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 2, за исключением того, что используют планшет, который после иммобилизации антигена и обработки раствором инертного белка, хранят в вакуумной упаковке при +4°С в течение 1 года.

Способ определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа, включающий адсорбцию конъюгата прогестерона с белком-носителем на поверхность полистирола, обработку поверхности водным раствором инертного белка, инкубацию с разведенной сывороткой, плазмой крови, инкубацию с конъюгатом антител к иммуноглобулинам человека с ферментом, инкубацию с субстратно-хромогенным раствором, отличающийся тем, что на полистирольную поверхность адсорбируют конъюгат прогестерона с гемоцианином (гемоцианин-11α-гидроксипрогестерон, гемоцианин-3α-гидроксипрогестерон) в водном буферном растворе (фосфатно-солевом, трисовом) с pH 7,2±0,2, содержащем 0,05-0,1% проклина 300, при 20±2°С в течение 18±2 часов, поверхность промывают указанным буферным раствором и обрабатывают буферным раствором, содержащим инертный белок (БСА, желатин) в концентрации 5-20 мг/мл, инкубируют с образцами сыворотки, плазмы крови, разведенными в соотношении 1:10-1:100 по объему в буферном растворе, содержащем инертный белок в концентрации 5-10 мг/мл и 0,05-0,1% по объему твина-20, поверхность до и после инкубации промывают буферным раствором, содержащим 0,05-0,1% по объему твина-20, инкубируют с мышиными моноклональными антителами к иммуноглобулинам человека класса М, G, А, Е, конъюгированными с пероксидазой хрена, используют субстратно-хромогенный раствор, содержащий 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин и перекись водорода измеряют оптическую плотность при длине волны 450 нм.

www.findpatent.ru


Смотрите также