способ определения антител к капсульному полисахариду haemophilus influenzae типа b. Антитела к полисахаридам


Антитела к полисахаридам - Справочник химика 21

    Механизм распознавания рецепторами и антителами своих антигенов почти неизвестен. Известно, однако, что это в высшей степени специфическое взаимодействие, так как его блокируют самые незначительные изменения в структуре углеводного антигена. Структурно измененный полисахарид или углеводсодержащий биополимер — это уже другой антиген на него реагируют рецепторы других лимфоцитов и вырабатываются другие антитела. [c.158]     Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

    Сходный метод — количественное определение одного из моносахаридов в осадке, который дает полисахарид с избытком антитела, — применяется для контроля чистоты антигенов, особенно часто в случае групповых веществ крови . Потеря иммунологической активности в процессе очистки свидетельствует о несомненной деструкции полисахарида. [c.518]

    Несомненно, что и биологические функции, и механические свойства полисахаридов и углеводсодержащих биополимеров в большой мере определяются конформацией макромолекулы и распределением в ней реакционноспособных групп. Все эти факторы зависят, в конечном счете, от первичной структуры полимера. Поэтому понимание факторов, определяющих специфичность биологической функции углеводсодержащих соединений и технические свойства полисахаридов, зависит в первую очередь от развития теоретических представлений о связи между строением, конформацией, реакционной способностью и физико-химическими свойствами полисахаридов и смешанных биополимеров, содержащих олиго- и полисахаридные цепи. Установление этих связей является предпосылкой для осуществления направленного синтеза соответствующих физиологически активных веществ и направленной модификации полисахаридов для получения материалов с заранее заданными свойствами. Поэтому исключительно важной задачей является разработка надежных методов установления первичной структуры полисахаридных цепей, требующих минимальной затраты времени и минимального количества материала. Не менее важны эффективные подходы к точной характеристике конформаций полисахаридной цепи в целом и отдельных ее участков, вплоть до моносахаридных звеньев. Очевидна также необходимость изучения реакционной способности полисахаридной цепи, ее отдельных звеньев и различных функциональных групп, что позволит понять механизм взаимодействия углеводсодержащих биополимеров с их партнерами в биологических системах (например, с антителами при иммунологических реакциях), наметить целесообразный путь модификации природного полимера для придания ему нужных свойств и т. д. [c.625]

    Образование антител стимулируется не только полисахаридом О-специфической боковой цепи и полисахаридом базального ядра, но также и липидом А, находящимся в комплексе, например, с сывороточным альбумином. Антитела к липиду А содержатся в крови не- [c.376]

    В 60-х годах были достигнуты важные успехи, открывшие новые пути изучения В-клеток. Первым из ннх была разработка метода локального гемолиза, который позволил идентифицировать и подсчитывать индивидуальные В-клетки, вырабатывающие антитела к определенному антигену. В простейшем варианте этого метода берут лимфоциты (обычно из селезенки) у животного, иммунизированного бараньими эритроцитами (БЭ). Их помещают затем в агар вместе с избытком Ю. В результате на чашке получается газон из иммобилизованных БЭ с вкраплением лимфоцитов. В этих условиях клетки не могут передвигаться, но любые выделяемые В-клеткой антитела будут диффундировать и покрывать поверхность всех БЭ, находящихся поблизости. Такие покрытые антителами эритроциты можно лизировать, добавив комплемент (разд. 17.5). Таким образом, присутствие каждой выделяющей антитела клетки обнаруживается по прозрачному пятну ( бляшке ) в темном слое БЭ. Аналогичный метод можно использовать для подсчета клеток, вырабатывающих антитела к другим антигенам, таким как белки или полисахариды, если присоединить эти антигены к поверхности бараньих эритроцитов. [c.20]

    Учитывая работы по определению поверхности активных центров антигенов, реагирующих с антителами, можно рассмотреть иммунохимические реакции пневмококковых и некоторых других полисахаридов.  [c.674]

    Поразительным является то, что комплемент фиксируется агрегатами, образованными огромным разнообразием антигенов (от различных белков до полисахаридов и липидных частиц, используемых в реакции Вассермана) с антителами различных биологических видов. [c.689]

    Интересно, что агрегаты, образованные лошадиными антителами с полисахаридами, не фиксируют комплемента молекулы [c.689]

    Одновременно с активацией классического пути приводится в действие также и альтернатавный путь-цепь реакций с положительной обратной связью, уси ливающая первоначальную выработку СЗЬ. Однако этот путь может быть активирован и в отсутствие антител полисахаридами, содержащимися в клеточных оболочках бактерий, дрожжей и простейших полагают, что он обеспечивает первую линию обороиы от инфекции, пока не сформировался иммунный ответ. [c.48]

    Разнообразие этих рецепторов (и клонов лимфоцитов) огромно число различных рецепторов составляет величину порядка миллиона, так что практически на любой чужеродный биополимер (антиген) находится соответствующий ему рецептор. Зрелые В-лимфоциты, не соприкасавшиеся со своими антигенами (их называют девственными лимфоцитами), не делятся. Однако контакт с антигеном, например с бактериальным полисахаридом, служит сигналом для целой цепи событий. В-Лимфоцит после этого трансформируется в плазматическую клетку и начинает делиться. Общее количество клеток данного клона резко возрастает они начинают продуцировать и секрети-ровать в кровь и лимфу большие количества свойственных этому клону иммуноглобулинов, т. е. антител, специфичных к данному антигену. Антитела реагируют с соответствующими антигенами в растворе, что приводит к их осаждению, и с теми же антигенами на поверхности бактериальной клетки. Таким образом происходят удаление [c.157]

    Лектинами называют белки или гликопротеиды растительного (фитогемагглютинины) или животного происхождения, проявляющие более или менее избирательное сродство к остаткам индивидуальных сахаров или групп сходных сахаров. Разнообразие остатков сахаров, часто встречающихся в природе, невелико, но они входят в салшх различных колхбинациях во множество биологически важных соединений полисахаридов, мукополисахаридов, гликопротеидов, глико-липидов и др. Многие из этих соединений участвуют в построении клеточных мембран. Подобно антителам, лектины обладают более чем одним участком связывания сахаров, что обусловливает их сио-собностъ агглютинировать эритроциты и другие клетки, отбирая их по классам, напрпмер опухолевые или эмбриональные. Используемые в качестве аффинных лигандов, лектины позволяют решать важные задачи очистки содержащих сахара компонентов плазмы, гликопротеидов клеточных мембран и др. [c.363]

    Гомополисахариды-декстран и леван стимулируют синтез антител у мышей и человека, но не у кролика и морской свинки. Детерминанта этих А. построена из 6-7 остатков моносахаридов. Антигенная структура полисахаридов в осн. определяется последовательностью мономеров и характером их связей, а не конформацией. А, микроорганиз- [c.174]

    Область, контактнрчтощая с антигеном (паратоп, или активный, антигенсвязывающий центр), располагается на N-конце РаЬ-фрагментов она представляет собой более или менее гл ок то полость, стенки к-рой сформированы ами-нокислотньгчш остатками гипервариабельных участков легкой и тяжелой пепей. У антител, связывающих белки и полисахариды, в полость может входить до 6-7 остатков аминокислот или моносахаров. У молекул IgG, IgD, IgE и IgA (молекула IgA построена подобно молекуле IgG) 2 активные центра, j молекул IgM -10. [c.217]

    ИММУНОХИМИЯ, изучает на мол. уровне механизмы иммунитета (способность организма защищать собственную целостность, в т.ч. невосприимчивость к инфекц. заболеваниям и биол. индивидуальность), а также компоненты, участвующие в иммунном ответе. К последним относятся антигены - биополимеры (гл. обр. белки и полисахариды, а также их синтетич аналоги), вызывающие развитие иммунного ответа, в т ч аллергию, антитела - белки, вырабатывающиеся в организме в ответ на воздействие антигена (см Иммуног.юбушны). комплемент система из ряда сывороточных белков, участвующая в иммунном ответе, рецепторы лимфоидных и др клеток иммунной системы (напр, моноядерных фагоцитов), а также продуцируемые этими клетками в-ва, регулирующие иммунный ответ. [c.218]

    Наружная поверхность внещней мембраны грамотрицательных бактерий покрыта удивительно сложно устроенным липополисахаридом [107, 108]. Внещний слой липополисахарида представляет собой совокупность длинных вытянутых полисахаридных цепочек, состоящих из повторяющихся специфических единиц, обладающих антигенными свойствами и получивщих название 0-антигенов. К этим полисахаридам могут быть получены специфические антитела. Структура полисахаридов характеризуется больщим разнообразием — известно 1000 се-ротипов сальмонелл. Согласно существующей классификации, их разделяют на 17 основных групп. В группу ЕЗ, например, входят сероти-пы, которые состоят из повторяющихся единиц [c.391]

    Исследования умеренных фагов сальмонелл позволили понять некоторые особенности механизмов, с помощью которых эти бактериальные вирусы связываются со стенками клеток-хозяеш. Местом первичного присоединения являются, по-видимому, сами О-антигены. Тонкие нити, расположенные на отростке фага (дополнение 4-Д), действуя наподобие антител, связываются со специфическими группировками полисахарида. Однако в результате включения генома фага и изменения строения О-антигена последующее присоединение -вирусов блокируется. В то же время клетки бактерий становятся восприимчивыми к вирусам другого штамма [109]. [c.394]

    Значительная информация об аминокислотных остатках, ответственных за связывание антигена, была получена методом афинной модификации [19]. Этот метод опирается на те же принципы, что и в случае фёрментов (см. разд. 23.3.10). Соединение, близкое по структуре антигену и несущее реакционноспособиую функциональную группу, может в принципе образовывать ковалентную связь с боковым радикалом аминокислоты, принадлежащей центру связывания. До сих пор этот метод не применялся в случае, если антиген представляет собой полисахарид или белок. При этом необходимо знание связывающейся на антителе части антигена, а также специфическое введение в этот участок реакционноспособной группировки. Вследствие этих затруднений современные исследования сконцентрировались на идентификации [c.565]

    Установлено, что полисахариды являются детерминантами, определяющими иммунологическую специфичность многих видов микроорганизмов. Специфическое взаимодействие зависит от ассоциации реакционноспособных групп полисахаридного антигена и белкового антитела, и потому метод, основанный на этом типе взаимодействий, обычно специфичен к строению полисахарида Если получить антисыворотку, специфичную к полисахаридам из вестного строения, ее можно использовать для установления сте пени структурного сходства неизвестных полисахаридов и полиса харидов, к которым специфична данная антисыворотка. Таким пу тем была обнаружена гетерогенность галактана из легких быка Преципитат, образуемый с антисывороткой, специфичной к Pneu mo o us типа XIV, содержал D-галактозу и D-глюкуроновую кис лоту в количествах, отличных от исходного препарата [62]. [c.227]

    Некоторые производные полисахаридов находят применение в промышленности так, например, ксантогенат целлюлозы применяется для производства искусственного шелка, а нитрат целлюлозы— для производства взрывчатых веществ. В связи с появлением водонерастворимых реагентов для приготовления иммуноадсорбентов и перевода ферментов и антител в нерастворимое состояние был синтезирован ряд новых модифицированных полисахаридов. Сведения о таких производных включены во многие обзоры, посвященные полисахаридам, например целлюлозе [222,223], крахмалу [224, 225] и другим [226] см, также [65, 227]. Чтобы облегчить поиск ссылок на методы их получения, эти производные классифицированы ниже по типу содержащихся в их молекулах заместителей, а не по природе исходного полисахарида. [c.273]

    Взаимодействие антиген—антитело, основанное на компле-ментарности определенных участков структуры антигена и белкового антитела, отличается чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. В области полисахаридов иммунологические реакции используются как для определения гомогенности и степени чистоты образца, так и для изучения структуры . [c.518]

    Важное значение в защитных реакциях организма имеют гликопротеины плазмы крови (см. стр. 576). Показано присутствие в плазме по крайней мере двадцати биологически активных гликопротеинов выполняющих различные функции. В частности, фракция углобулинов, к которой принадлежат антитела, вырабатываемые при введении в организм антигенов, содержит значительное количество остатков моносахаридов. Непосредственным участником защитной иммунной реакции в организме является так называемый комплемент , который соединяется с комплексом антиген—антитело и вызывает разрушение введенных чужеродных клеток. Активность комплемента зависйт от присутствия четырех компонентов, из которых по крайней мере два являются гликопротеинами. Многие полисахариды микроорганизмов повышают неспецифическую резистентность животных к бактериальной инфекции . Механизм их действия пока не вполне понятен. [c.606]

    Важную роль в защитных реакциях организмов играют гликопротеины плазмы крови [36]. Непосредственным участником защитной иммунной реакции в организме является так называемый комплемент , который, соединяясь с комплексом антиген— антитело, вызывает разрушение чужеродных клеток. Комплементарные системы играют защитную роль при воспалительных и аллергических реакциях биологичес(шх организмов. Они способны снижать гемолитическую активность при активации или ингибировании систем. К числу антикомплементарных полисахаридов относятся вещества, выделенные из китайской травы [67]. Два из них были экстрагированы горячей водой и оказались разветвленными арабиногалактанами, содержащими в разветвленной части макромолекулы остатки галактозы и арабинозы. [c.266]

    Наряду с классическим существует и так называемый альтернативный путь, или путь вктивации комплемента, происходящей без участия антител, обнаруженный Л. Пилемером. Этот путь является, по-видимому, основным иа ранних этапах борьбы организма с бактериальной инфекцией, когда антитела еще не образова-лисЕ>, представляя собой первую лнн>1Ю защиты. Альтернативный путь также заканчивается образованием С5-конвертазы, однако ее формирование происходит без участия С1, С2 и С4 компонентов за счет взаимодействия СЗ компонента с другими факторами (рнс. 12.5). Реакция активируется полисахаридами клеточных стенок микроорганизмов и начинается с создания на мембране комплекса активированного СЗ компонента (СЗЬ) с фактором В. По- [c.222]

    По условиям проведения процесса различают нестерильные (крзгпнотоннажное производство кормовых дрожжей) и стерильные производства (полз ение антибиотиков, витаминов, моноклональных антител идр), аэробные, или с подачей воздуха и анаэробные (без подачи воздуха) — соответственно производства лимонной кислоты и полисахарида декстрана [c.239]

    Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9]

    Большинство макромолекул, включая практически все белки и большую часть полисахаридов, могут служить антигенами. Те участки поверхности антигена, которые взаимодействуют с антнгенсвязывающим участком молекулы антитела или же рецептора лимфоцита, называются аагшгеияымн детерминантами. Молекулы, которые хотя н связываются специфически с антителом нли с рецептором лимфоцита, но не могут индуцировать иммунный ответ, называют гантенами. Гаптен можно сделать полноценным антигеном, присоединив его к подходящей макромолекуле-носителю. В качестве гаптена в иммунологических экспериментах часто используют динит-рофенильную группу (ДНФ), которую обычно пришивают к белку, чтобы сделать ее антигенной (рнс. 17-8). [c.14]

    Рве. 17-51. Сравнительная схема образования СЗ-конвертазы и С5-юнвергазы классическим и альтернативным путями. В отличие от классического пути, запускаемого комплексами антиген-антитело, альтернативный путь приводится в действие субкомпонентом СЗЬ, полисахаридами клеточных оболочек и другими активаторами. Активированные компоненты юмплемента часто обозначают с помощью верхней черты (например, активированный С1 - как UT) ТОбы упростить текст, мы не "ользовались этим обозначением. [c.47]

    Иммунная система противодействует заболеванию организма и вторжению в него посторонних веществ. За последние 20 лет многое стало известным о группе ферментов и других белков, которые фиксируют присутствие инородного тела и координируют ответную реакцию организма. Клетки плазмы, продуцируемые белыми кровяными тельцами, выделяют в кровь молекулы антитела. Антитела нейтрализуют чужеродные белки или присутствующие в крови полисахариды, способные вызвать заболевание. Химикам принадлежит решающий вклад в изучение природы молекул антител. Именно химики первыми продемонстрировали, что это белки, а затем определили их действительное химическое строение, а также структуру кодируюпщх их генов. В результате стали проясняться детали созданной природой системы. Антитела содержат переменную (вариабельную) область, в которой последовательность аминокислот меняется в зависимости от того, какое инородное вещество надо нейтрализовать, и постоянную (константную) область, которая в основном одинакова в большинстве антител. Переменная область молекулы распознает и связывает специфические тела вторжения, а постоянная занимается собственно устранением постороннего вещества. Полученные результаты открывают широкие возможности для дальнейших исследований. Настоятельная необходимость самых интенсивных исследований в этой области усугубляется необходимостью разработки эффективного лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). [c.107]

    Осадки, образуемые нативной камедью акации с анти-SIIl-сывороткой и этой же и другими нативными камедями с анти-SI 1-сывор ткой, много меньше, чем осадки, образуемые гидролизатами этих камедей, получаемыми в результате частичного гидролиза, идущего с отщеплением пентоз. Б нативной камеди акации пен-тозные радикалы связаны с С-4 атомами глюкуроновой кислоты и С-З атомами и галактозных остатков. Эти пентозные радикалы, возможно, и Препятствуют приближению полисахарида камеди к рецепторам анти-SII- и анти-SII 1-антител. [c.679]

    Недавно Смит и др. (Smith et al., 1955) определили, что во всех кроличьих антителах против пневмококковых полисахаридов типа I, П1, VIII и XIV содержание аспарагиновой и глютаминовой кислот, глицина, аланина, лейцина, тирозина, гистамина, лизина, аргинина и триптофана было (в пределах ошибки опыта) одним и тем же. Некоторые отклонения в количествах других аминокислот, вероятно, связаны с различием глубины гидролиза молекулы антитела, скоростью отщепления и разделения аминокислот. [c.687]

chem21.info

способ определения антител к капсульному полисахариду haemophilus influenzae типа b - патент РФ 2331075

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается способа определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b. Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae, инкубируют, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 табл., 1 ил. способ определения антител к капсульному полисахариду haemophilus influenzae типа b, патент № 2331075

(56) (продолжение):

Diagnostic Laboratory Immunol., 2000, Jan. 7(1), 25-30. RU 2257412 C1, 27.07.2005. US 6177085 A, 23.01.2001.

Рисунки к патенту РФ 2331075

способ определения антител к капсульному полисахариду haemophilus influenzae типа b, патент № 2331075

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета при вакцинации существующими (АКТ-ХИБ) и разрабатываемыми форсифицированными вакцинами.

Haemophilus influenzae типа b (Hib) является наиболее частой причиной бактериальных менингитов, поражающих детей до 6-летнего возраста, особенно детей от 3 до 12 месяцев. При инфицировании этим видом бактерий у человека формируется иммунный ответ к трем основным антигенам: капсульному полисахариду, белкам наружной мембраны и липоолигосахаридам. Капсульный полисахарид - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) - является основой современных вакцинных препаратов. Для формирования Т-клеточного иммунитета его конъюгируют с различными бактериальными белками, такими как столбнячный и дифтерийный анатоксины и др. Для профилактики заболеваний, вызываемых Hib, за рубежом созданы вакцинирующие препараты. Одна из таких вакцин «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), представляющая собой конъюгат ПРФ со столбнячным анатоксином, сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность. Разрабатываются подобные вакцины и в нашей стране. Для оценки эффективности разрабатываемых отечественных форсифицированных вакцин необходимы тесты, регистрирующие уровень поствакцинального иммунитета.

Известен способ выявления антител к олигосахариду капсульного полисахарида Hib с помощью ИФА. В качестве иммуносорбента используют 96-луночный полистироловый планшет, на котором сорбирован олигосахарид, конъюгированный с альбумином человека [Clin. And Diagn. Labor. Immunol., 1996, Jan., p.84-88]. Анализируемые образцы сывороток титруют с 1:50 в фосфатно-солевом буфере с добавлением твина и ЭДТА. После инкубации и отмывания вносят моноклональный конъюгат. Полученное соединение антиген-антитело-конъюгат проявляют субстратной смесью с последующей детекцией на спектрофотометре. Для калибровочной кривой используют аффинноочищенные антитела.

Однако при использовании иммуносорбента, содержащего альбумин человека, есть вероятность определения аутоантител к нему в анализируемых пробах.

Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности определения антител к капсульному полисахариду H.influenzae за счет использования высокоочищенного полисахарида, не требующего конъюгации, а также за счет использования поликлонального конъюгата, представляющего собой кроличьи антитела против иммуноглобулинов G (H+L) человека, меченные пероксидазой, и калибровочных проб, представляющих собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib.

Для достижения указанного технического результата способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. Ед./мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 минут, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 минут в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.

Наличие гуморального иммунитета может быть оценено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода лежит иммуносорбент, представляющий собой стрипированный 96-луночный планшет, сорбированный высокоочищенным капсульным полисахаридом Hib, принадлежность которого к ПРФ доказана с помощью ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии и химического анализа, а специфическая активность - в различных серологических тестах.

При выполнении анализа образцы сывороток и калибровочные пробы вносят в лунки иммуносорбента в рабочем разведении. После инкубации и отмывки во все лунки иммуносорбента вносят конъюгат в рабочем разведении. Проявка реакции осуществляется субстратной смесью, содержащей тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода.

Калибровочные пробы - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. На их основе строится график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах (см. чертеж).

По калибровочному графику определяют относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых сыворотках крови человека.

Используемые реагенты:

(1) иммуносорбент - планшет полистирольный разборный, состоящий из 128-луночных стрипов, сорбированных капсульным полисахаридом Hib, - 1 шт.;

(2) калибровочные пробы (8) - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. Каждая проба содержит 0,2 мл раствора, во флаконе;

(3) отрицательный контроль (К-) - сыворотка крови человека, содержащая <0,5 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;

(4) положительный контроль (К+) - сыворотка крови человека, содержащая >2,0 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;

(5) конъюгат (КГ) - антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, жидкий, концентрированный - 1 фл., 0,2 мл;

(6) субстратная смесь, содержащая тетраметилбензидин (ТМБ) - 1 фл., 12 мл;

(7) промывающий и разводящий фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом (ФСБ-Д)к - 1 фл., 50 мл;

(8) стоп-реагент - 0,9 М H 2SO4.

Приготовление растворов для проведения анализа:

1) (ФСБ-Д)к перед применением разводят дистиллированной водой в 10 раз. Полученный раствор ФСБ-Д хранят не более 3 недель при 4-8°С. Раствор предназначен для отмывки планшета от непрореагировавших компонентов, разведения сывороток и конъюгата;

2) контроли (К+ и К-), а также анализируемые сыворотки перед проведением анализа разводят раствором ФСБ-Д до соотношения 1:100 (10 мкл на 1000 мкл ФСБ-Д.) Рабочее разведение сывороток хранению не подлежит;

3) рабочее разведение конъюгата готовят непосредственно перед использованием, разводя исходный раствор до соотношения 1:200 ФСБ-Д (50 мкл на 10 мл ФСБ-Д).

Последовательность операций

Отмывка иммуносорбента. Во все лунки планшета вносят ФСБ-Д в объеме не менее 0,2 мл. Выдерживают планшет при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 3 раза.

Внесение образцов. В лунки первого ряда планшета последовательно вносят калибровочные пробы №№1-8. Далее последовательно вносят рабочие растворы (1:100) контролей (К+ и К-) в дублях и анализируемые сыворотки. Объем вносимых проб - 100 мкл.

Инкубация. Выдерживают планшет с растворами сывороток в течение 30 мин при 18-22°С.

Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ-Д, как указано в п.1.

Внесение рабочего раствора конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора КГ.

Инкубация. Как в п.3.

Отмывка от избытка КГ. Как в п.1.

Внесение субстратного раствора ТМБ. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ.

Инкубация. 15-20 мин в темноте при температуре 18-22°С.

В каждую лунку вносят по 50 мкл стоп-реагента.

Учет результатов

Вывести спектрофотометр на нулевой уровень («blank») по воздуху.

Измерить оптическую плотность в лунках планшета при 450 нм в течение 10 минут после остановки реакции.

Построить график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах.

По калибровочному графику определить относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых пробах.

Пример исследования сывороток детей в возрасте до 3 лет, подвергшихся иммунизации вакциной «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), на наличие антител к капсульному полисахариду Hib

№№ п/п ОП 450 нмУсл. ед./мл
до иммунизациичерез месяц после иммунизациидо иммунизации через месяц после иммунизации
10,760,65 1,31,04°
20,830,94 1,61,9*
3 1,020,55 2,30,8°
40,711,36 1,25,2**
50,610,36 0,90,4°
60,550,56 0,80,8-
70,94 0,991,92,0*
80,93 1,051,82,4*
90,27 0,700,31,2**
100,70 1,251,23,9*
110,52 0,560,70,8*
120,65 0,861,01,6*
130,33 0,520,40,7*
140,28 1,480,36,7**
150,34 0,750,41,3*
161,32 1,734,714,8**
170,84 1,791,617,9**

Из 17 детей у 13 (*) уровень IgG AT после вакцинации вырос (из них - в 4 и более раз - только у 5 человек (**)). У 3 детей произошло понижение уровня AT после вакцинации (°), а у одного уровень AT не изменился (-).

Пример определения антител капсульному полисахариду в сыворотках вакцинированных детей с помощью набора «Fuller Laboratories» и предложенного способа.

№№ сыворотки Набор «Fuller»Предложенный способ
до вакцинациим кг/мл после вакцинациим кг/млдо вакцинации усл.ед./мл после вакцинации усл.ед./мл
10,721,1 1,581,87
20,522,4 1,25,17
3 0,521,9 0,271,09
40,421,8 1,173,87
50,422,6 0,286,68
60,211,4 0,381,32
71,722,2 4,7114,75
81,622,4 1,617,88

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b, заключающийся в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 условных единиц/мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.

www.freepatent.ru

Дополнительные лабораторные исследования - Справочник

Если результаты основных лабораторных исследований не позволили поставить или подтвердить диагноз, проводят более сложные лабораторные исследования. Поскольку нарушение разных звеньев иммунитета нередко наблюдается одновременно, при выявлении патологии показано полное исследование иммунной системы. Его обычно проводят в специализированных лабораториях. До постановки диагноза лечение не начинают.

А. Исследование гуморального иммунитета

1. Определение числа B-лимфоцитов. На клеточной мембране лимфоцитов находится множество гликопротеидов, которые можно обнаружить при проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител. Некоторые из этих гликопротеидов специфичны для определенного типа клеток, например T-, B- и NK-лимфоцитов, разных субпопуляций T-лимфоцитов, моноцитов, и даже для определенных стадий их созревания и дифференцировки. Эти молекулы принято обозначать CD. В настоящее время определены функции многих CD. При оценке результатов исследования необходимо учитывать возраст больного. Кроме того, необходимо постоянно контролировать качество реактивов и соблюдение методики, поскольку даже незначительное ее нарушение искажает результаты исследования. Определение B-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии основано на выявлении иммуноглобулинов, фиксированных на поверхности клеток, CD19 и CD20. У детей старшего возраста и взрослых B-лимфоциты составляют 10—20% всех лимфоцитов крови, у детей младшего возраста их больше.

2. Определение титра антител. При подозрении на недостаточность гуморального иммунитета оценивают титр антител к белковым и полисахаридным антигенам. Обычно их определяют после вакцинации или инфекции.

а. Антитела к белковым антигенам. В большинстве случаев исследуют IgG к дифтерийному и столбнячному анатоксинам до и спустя 2—4 нед после вакцинации АКДС или АДС. Поскольку почти все взрослые вакцинированы АКДС, уровень антител после ревакцинации служит показателем вторичного иммунного ответа. Можно определить также антитела к антигену PRP после введения вакцины против Haemophilus influenzae типа B. Хотя этот антиген представляет собой полисахарид, в конъюгированной вакцине он действует как белковый антиген. Иногда исследуют антитела после иммунизации инактивированной вакциной против полиомиелита и рекомбинантной вакциной против гепатита B. При подозрении на иммунодефицит живые вирусные вакцины противопоказаны.

б. Антитела к полисахаридным антигенам. Для оценки гуморального иммунного ответа на полисахаридные антигены применяются пневмококковая и менингококковая вакцины, не содержащие белковых носителей. Титр антител определяют до и спустя 3—4 нед после вакцинации. В некоторых исследовательских лабораториях для этих целей используют неконъюгированную вакцину против Haemophilus influenzae типа B. Результаты оценивают с учетом возраста больного. Так, у детей младше 2 лет иммунный ответ на полисахаридные антигены слабый, у некоторых детей он остается таковым вплоть до 5 лет. В связи с этим применение полисахаридных вакцин у детей младшего возраста нецелесообразно и даже противопоказано, поскольку может привести к иммунологической толерантности и неэффективности ревакцинации в более старшем возрасте.

в. Оценка первичного и вторичного гуморального иммунного ответа. Для определения клиренса антигена, уровня IgM (при первичном иммунном ответе) и IgG (при вторичном иммунном ответе) в качестве белкового антигена используют бактериофаг фихи 174 — бактериальный вирус, безопасный для человека. Для оценки первичного гуморального иммунного ответа применяют также гемоцианин брюхоногих моллюсков, рекомбинантную вакцину против гепатита B, мономерный флагеллин, вакцину против клещевого энцефалита.

г. Естественные антитела (изогемагглютинины, антитела к стрептолизину O, гетерофильные антитела, например антитела к эритроцитам барана) в норме присутствуют в сыворотке почти всех людей. Это объясняется тем, что антигены, против которых направлены эти антитела, широко распространены и содержатся в пищевых продуктах, вдыхаемых частицах, микрофлоре дыхательных путей.

3. Определение подклассов IgG. Если при рецидивирующих бактериальных инфекциях дыхательных путей общий уровень IgG в норме или незначительно снижен или выявляется изолированный дефицит IgA, показано определение подклассов IgG. При этом можно обнаружить дефицит IgG2 (IgG2 составляет около 20% IgG), который может быть изолированным или сочетаться с дефицитом IgA или IgG4. Следует помнить, что функциональная оценка гуморального иммунного ответа — более информативный метод исследования, чем количественное определение подклассов IgG. Так, при нормальном уровне IgG2 часто бывает снижен уровень антител к полисахаридным антигенам Streptococcus pneumoniae. Наряду с этим возможен врожденный дефицит IgG2, обусловленный нарушением синтеза тяжелых цепей, в отсутствие каких-либо клинических проявлений иммунодефицита.

4. Определение IgA. Изолированный дефицит секреторного IgA при нормальном уровне IgA в сыворотке встречается редко. Как правило, наблюдается одновременный дефицит секреторного и сывороточного IgA. Изолированный дефицит IgA клинически не проявляется или сопровождается легкими инфекциями верхних дыхательных путей. Это обусловлено тем, что при дефиците IgA компенсаторно повышается уровень IgG в сыворотке и IgM в секрете слизистых. Уровень IgA измеряют в слезе, слюне и других биологических жидкостях. Существует два подкласса IgA — IgA1 и IgA2. В крови и секрете дыхательных путей преобладает IgA1, в секретах ЖКТ — IgA2. Нормальные показатели уровней IgA1 и IgA2.

5. Синтез иммуноглобулинов in vitro. Это исследование позволяет оценить выработку IgM, IgG и IgA стимулированными B-лимфоцитами. Смешивая обработанные разными стимуляторами T- и B-лимфоциты здоровых и больных, можно оценить функцию T-хелперов и B-лимфоцитов. В большинстве случаев дефицит антител обусловлен нарушением дифференцировки B-лимфоцитов в плазматические клетки.

6. Биопсию лимфоузлов при подозрении на первичный иммунодефицит, как правило, не производят. Она показана лишь в тех случаях, когда диагноз неясен и у больного увеличены лимфоузлы, что требует исключения гемобластоза. Биопсию обычно производят через 5—7 сут после антигенной стимуляции. Антиген вводят в область, лимфа от которой оттекает в группу лимфоузлов, один из которых подлежит биопсии. При недостаточности гуморального иммунитета в лимфоузле снижено число плазматических клеток, количество первичных фолликулов увеличено, вторичные фолликулы отсутствуют, толщина коркового вещества уменьшена, наблюдается перестройка ткани лимфоузла, иногда увеличивается число макрофагов и дендритных клеток.

7. Биопсию кишечника производят при общей вариабельной гипогаммаглобулинемии и изолированном дефиците IgA. Биопсия тонкой кишки показана при хронической диарее и синдроме нарушенного всасывания для исключения атрофии ворсинок слизистой и инфекций, вызванных Cryptosporidium spp. и Giardia lamblia.

8. Скорость выведения антител изучают с помощью меченых иммуноглобулинов. Это исследование показано при подозрении на потерю иммуноглобулинов через ЖКТ.

Б. Исследование клеточного иммунитета

1. Исследование поверхностных антигенов T-лимфоцитов. Определение поверхностных антигенов T-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии позволяет изучить их созревание, дифференцировку и активацию.

2. Стимуляция T-лимфоцитов in vitro. Нарушения созревания и дифференцировки T-лимфоцитов при иммунодефицитах с недостаточностью клеточного иммунитета происходят на разных уровнях. Так, при тяжелом комбинированном иммунодефиците нарушается созревание T-лимфоцитов в тимусе, что проявляется отсутствием на поверхности T-лимфоцитов антигена CD2. При этом заболевании также возможны отсутствие CD3, CD4 и неспособность T-лимфоцитов синтезировать цитокины. При синдроме обнаженных лимфоцитов на мембране активированных T-лимфоцитов отсутствуют антигены HLA класса II. При синдроме Вискотта—Олдрича снижена экспрессия антигена CD43, участвующего в активации T-лимфоцитов. Тяжелые иммунодефициты с недостаточностью клеточного иммунитета сопровождаются выраженным нарушением функции T-лимфоцитов, хотя абсолютное и относительное число этих клеток может быть нормальным.

а. Для стимуляции T-лимфоцитов in vitro используют следующие вещества.

1) Митогены — фитогемагглютинин, конканавалин A и др. — вызывают неспецифическую (не обусловленную связыванием с антигенраспознающими рецепторами) активацию T-лимфоцитов.

2) Растворимые антигены — антигены Candida albicans, столбнячный анатоксин — связываясь с антигенраспознающими рецепторами T-лимфоцитов памяти, вызывают специфическую активацию этих клеток.

3) Аллогенные клетки (в смешанной культуре лимфоцитов) активируют T-лимфоциты, поскольку несут на своей поверхности антигены HLA класса II.

4) Антитела к поверхностным антигенам T-лимфоцитов, участвующим в их активации, — CD2, CD3, CD43.

5) Химические вещества, например форболмиристатацетат (активирует протеинкиназу C) и иономицин (повышает содержание внутриклеточного кальция).

б. Активацию T-лимфоцитов обычно оценивают по следующим показателям.

1) Пролиферация.

2) Выработка цитокинов — интерлейкинов-2, -4, -5, интерферона гамма и фактора некроза опухолей.

3) Экспрессия маркеров активации — CD25 и антигенов HLA класса II.

4) Цитотоксичность.

в. Под действием митогенов, антигенов и аллогенных клеток покоящиеся T-лимфоциты активируются, превращаются в бластные клетки и начинают делиться. Таким образом, активацию лимфоцитов можно оценить по включению 3H- или 14C-тимидина в ДНК. Реакция лимфоцитов на стимулятор меняется в зависимости от дозы и продолжительности инкубации, поэтому перед проведением исследования необходимо построить нормальные кривые зависимости уровня включения изотопа от дозы стимулятора и времени инкубации лимфоцитов. Уровень радиоактивности клеток определяют с помощью сцинтилляционного счетчика и выражают в количестве импульсов в минуту. Результат оценивают по уровню радиоактивности нестимулированных (спонтанная пролиферация) и стимулированных лимфоцитов, а также по индексу стимуляции (отношение уровня радиоактивности стимулированных лимфоцитов к уровню радиоактивности нестимулированных лимфоцитов). Кроме того, можно вычислить отношение уровней радиоактивности стимулированных лимфоцитов больного и здорового человека. Спонтанная пролиферация лимфоцитов бывает повышена у больных, перенесших многократные переливания крови, больных аллергическими и аутоиммунными заболеваниями, при бактериальных и вирусных инфекциях, а также у новорожденных.

г. Смешанную культуру лимфоцитов применяют для оценки способности T-лимфоцитов распознавать антигены HLA аллогенных B-лимфоцитов и моноцитов. Стимулирующие клетки (аллогенные B-лимфоциты) инактивируют облучением или митомицином. Реакция лимфоцитов больного оценивается по включению в ДНК меченого тимидина.

3. Для оценки клеточного иммунитета иногда используют иммунизацию динитрохлорбензолом. Его вводят внутрикожно и только с диагностической целью. Однако поскольку динитрохлорбензол оказывает сильное раздражающее действие и является канцерогеном, это исследование проводят редко.

4. Биохимические исследования. При подозрении на комбинированную недостаточность гуморального и клеточного иммунитета определяют активность аденозиндезаминазы и пуриннуклеозидфосфорилазы (участвуют в метаболизме нуклеозидов). При атаксии-телеангиэктазии почти всегда повышен уровень альфа-фетопротеина в сыворотке, что позволяет дифференцировать это заболевание с другими нервными болезнями. К редким метаболическим нарушениям, сопровождающимся недостаточностью клеточного иммунитета, относятся оротовая ацидурия и биотин-зависимая недостаточность карбоксилаз (проявляется алопецией и неврологическими нарушениями). При недостаточности транскобаламина II (участвует в транспорте витамина B12) поражаются быстрообновляющиеся ткани, поэтому для этого заболевания характерны недостаточность гуморального иммунитета, нарушения кроветворения (анемия, тромбоцитопения), понос и отставание в развитии.

5. Генетические исследования. У больных с тяжелой недостаточностью клеточного иммунитета возможен химеризм (существование клеток разных генотипов в одном организме). Он возникает при попадании материнских клеток крови в кровь плода, переливании компонентов крови и трансплантации костного мозга. Если в крови больного содержатся клетки человека противоположного пола, химеризм легко выявить, обнаружив клетки с женским и мужским кариотипами. В остальных случаях проводят типирование клеток крови больного по HLA. Это исследование также позволяет выявить отсутствие антигенов HLA класса II на активированных T-лимфоцитах при синдроме обнаженных лимфоцитов.

6. Сканирующая электронная микроскопия выявляет T-лимфоциты, на поверхности которых нет микроворсинок, что характерно для синдрома Вискотта—Олдрича.

7. Биопсия тимуса производится в ряде случаев для подтверждения диагноза тяжелого комбинированного иммунодефицита. При недостаточности клеточного иммунитета в тимусе определяются скопления ретикулоэпителиальных клеток, отсутствие телец Гассаля и четкой границы между корковым и мозговым веществом, резкое снижение числа тимоцитов. Биопсию тимуса проводят хирурги, владеющие техникой этой операции.

8. Биопсия лимфоузлов. При недостаточности клеточного иммунитета в биоптате лимфоузла выявляется опустошение паракортикальной зоны. Из-за риска раневой инфекции и осложнений анестезии биопсию лимфоузлов проводят только в том случае, когда другие лабораторные исследования не позволяют подтвердить диагноз.

В. Исследование фагоцитов показано при хронических и рецидивирующих бактериальных инфекциях, если исследование гуморального и клеточного иммунитета не выявило отклонений от нормы. Недостаточность фагоцитов может быть обусловлена нарушением миграции, хемотаксиса, адгезии фагоцитов, а также нарушением собственно фагоцитоза. Кроме того, недостаточность фагоцитов может быть обусловлена дефицитом опсонинов (антител и комплемента) и нарушением метаболизма фагоцитов.

1. Тест восстановления нитросинего тетразолия применяется в диагностике хронической гранулематозной болезни. Суть метода заключается в следующем: к фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, в норме при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. О нарушении метаболизма фагоцитов судят по снижению интенсивности синего окрашивания. При выявлении нарушений определяют уровень цитохрома b558 и других белков фагоцитов.

2. Хемилюминесценция также позволяет оценить функциональную активность фагоцитов. В норме при фагоцитозе появляется большое количество свободных радикалов кислорода, окисляющих субстрат, например компоненты клеточной стенки бактерий. Окисление сопровождается излучением видимого или ультрафиолетового света. По интенсивности излучения можно судить о функциональной активности фагоцитов.

3. Оценка фагоцитарной активности — наиболее информативный способ исследования опсонинов и функционального состояния фагоцитов.

а. Техника проведения

1) Лейкоциты, выделенные из крови больного, отмывают от сыворотки, подсчитывают и помещают в среду, содержащую сыворотку здорового или больного (источник опсонинов) и живые бактерии (обычно Staphylococcus aureus или Escherichia coli).

2) Смесь инкубируют при 37°C, отбирая пробы через 0, 30, 60 и 120 мин после начала инкубации. Для определения числа жизнеспособных бактерий каждую пробу быстро охлаждают и делают посев.

3) Через 2 ч после начала инкубации смесь центрифугируют. Лейкоциты и фагоцитированные бактерии оседают на дно, а нефагоцитированные бактерии остаются в надосадочной жидкости. В осадке и надосадочной жидкости определяют число жизнеспособных бактерий.

б. Оценка результатов. В норме в течение 2 ч фагоцитами поглощается и разрушается около 95% бактерий. При хронической гранулематозной болезни число разрушенных бактерий не превышает 10%, а внутри лейкоцитов обнаруживаются жизнеспособные бактерии. Присутствие живых бактерий в лейкоцитах при инкубации с сывороткой здорового свидетельствует о нарушении переваривания бактерий в отсутствие снижения способности к захвату бактерий. Повышенное содержание жизнеспособных бактерий в надосадочной жидкости при инкубации с сывороткой больного свидетельствует о дефиците опсонинов.

4. Хемотаксис лейкоцитов. Нарушение хемотаксиса может быть обусловлено дефектом фагоцитов, наличием ингибиторов хемотаксиса, дефицитом сывороточных или тканевых факторов хемотаксиса.

а. Метод кожного окна. С помощью скальпеля удаляют поверхностный слой эпидермиса площадью 4 мм2 (при этом должно появиться небольшое количество крови). На поврежденный участок помещают покровное стекло. В течение суток каждые 0,5—2 ч покровное стекло меняют. Затем стекла окрашивают и исследуют под микроскопом находящиеся на них лейкоциты. В норме в течение первых 2 ч наблюдается приток нейтрофилов к месту повреждения. В течение последующих 12 ч нейтрофилы замещаются моноцитами.

б. Исследование хемотаксиса in vitro основано на стимуляции выделенных из крови фагоцитов факторами хемотаксиса. Способность фагоцитов к направленной миграции можно оценить, поместив их в камеру Бойдена или чашку Петри с агарозой.

5. Адгезия лейкоцитов. Нарушение адгезии лейкоцитов обусловлено снижением экспрессии или отсутствием на их поверхности молекул адгезии, например CD11/CD18. Для определения молекул адгезии применяют проточную цитофлюориметрию. Отсутствие CD11/CD18 на нейтрофилах и моноцитах проявляется поздним отпадением пуповины, рецидивирующими бактериальными инфекциями, пародонтитом. Адгезию лейкоцитов можно также оценить по их способности прилипать к эндотелиальным клеткам. Однако это исследование проводят лишь в некоторых исследовательских лабораториях.

6. Диагностика асплении. Селезенка играет важную роль в защите от инфекции, так как содержит огромное количество макрофагов и плазматических клеток. У больных с аспленией часто наблюдается сепсис, в мазках крови выявляются деформированные эритроциты и тельца Говелла—Жолли. Асплению выявляют с помощью сцинтиграфии и других инструментальных методов исследования.

7. Другие исследования. Определение активности миелопероксидазы, глутатионпероксидазы, лизоцима, Г-6-ФД, пируваткиназы и электронную микроскопию проводят для выявления незначительных нарушений функций фагоцитов и в научных целях. При нейтропении показаны повторные определения числа лейкоцитов в крови, определение числа лейкоцитов в крови после введения кортикостероидов, адреналина и эндотоксина, определение антител к лейкоцитам, исследование костного мозга.

8. Исследование костного мозга проводят при стойкой лейкопении или лейкоцитозе, изменении морфологии лейкоцитов, выявлении бластных форм в крови.

Г. Исследование комплемента. Если данные анамнеза и основных лабораторных исследований указывают на недостаточность комплемента, показано его углубленное исследование. Оно включает количественное определение и функциональную оценку компонентов комплемента, исследование альтернативного пути активации комплемента, определение опсонинов и факторов хемотаксиса в сыворотке. О дефиците опсонинов в исследуемой сыворотке свидетельствует ее неспособность усиливать фагоцитоз бактерий и дрожжевых грибов нормальными лейкоцитами.

Д. Пренатальная диагностика и генетическое консультирование. На сегодняшний день установлено, что многие иммунодефициты являются наследственными заболеваниями: известен тип их наследования, выявлена локализация дефектного гена, определен продукт этого гена. В настоящее время стало возможным выявление носительства дефектного гена. Так, гетерозиготное носительство дефектного гена, кодирующего какой-либо фермент, можно выявить по снижению активности этого фермента, например при аутосомно-рецессивном тяжелом комбинированном иммунодефиците снижена активность аденозиндезаминазы, при хронической гранулематозной болезни — ферментов дыхательной цепи, при X-сцепленной агаммаглобулинемии — тирозинкиназы в B-лимфоцитах. Выявлен также целый ряд дефектов, не связанных с нарушением синтеза ферментов, например при X-сцепленном тяжелом комбинированном иммунодефиците — нарушен синтез гамма-цепи рецептора к интерлейкину-2, синдроме гиперпродукции IgM — синтез гликопротеида клеточной мембраны gp39 — лиганда рецептора CD40 B-лимфоцитов. У девочек с X-сцепленными иммунодефицитами, проявляющимися нарушением дифференцировки лимфоцитов (X-сцепленная агаммаглобулинемия, X-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит, синдром Вискотта—Олдрича), в крови выявляются как дифференцированные, так и недифференцированные лимфоциты. Это обусловлено тем, что X-хромосома, несущая дефектный ген, инактивирована лишь в части клеток. Наличие недифференцированных лимфоцитов в отсутствие клинических проявлений этих иммунодефицитов указывает на носительство дефектного гена. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов также позволяет выявить носителей дефектного гена в семье. Лабораторные методы пренатальной диагностики основаны на исследовании клеток пуповинной крови и околоплодных вод, а также ворсин хориона. Так, при всех формах тяжелого комбинированного иммунодефицита в пуповинной крови отсутствуют T-лимфоциты, при синдроме Вискотта—Олдрича обнаруживаются тромбоцитопения и T-лимфоциты, лишенные микроворсинок.

Источник: Г.Лолор-младший, Т.Фишер, Д.Адельман "Клиническая иммунология и аллергология" (пер. с англ.), Москва, "Практика", 2000

опубликовано 19/08/2011 11:37обновлено 19/08/2011— Первичные иммунодефициты

spravka.komarovskiy.net

Способ определения антител к капсульному полисахариду haemophilus influenzae типа b

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается способа определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b. Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae, инкубируют, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета при вакцинации существующими (АКТ-ХИБ) и разрабатываемыми форсифицированными вакцинами.

Haemophilus influenzae типа b (Hib) является наиболее частой причиной бактериальных менингитов, поражающих детей до 6-летнего возраста, особенно детей от 3 до 12 месяцев. При инфицировании этим видом бактерий у человека формируется иммунный ответ к трем основным антигенам: капсульному полисахариду, белкам наружной мембраны и липоолигосахаридам. Капсульный полисахарид - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) - является основой современных вакцинных препаратов. Для формирования Т-клеточного иммунитета его конъюгируют с различными бактериальными белками, такими как столбнячный и дифтерийный анатоксины и др. Для профилактики заболеваний, вызываемых Hib, за рубежом созданы вакцинирующие препараты. Одна из таких вакцин «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), представляющая собой конъюгат ПРФ со столбнячным анатоксином, сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность. Разрабатываются подобные вакцины и в нашей стране. Для оценки эффективности разрабатываемых отечественных форсифицированных вакцин необходимы тесты, регистрирующие уровень поствакцинального иммунитета.

Известен способ выявления антител к олигосахариду капсульного полисахарида Hib с помощью ИФА. В качестве иммуносорбента используют 96-луночный полистироловый планшет, на котором сорбирован олигосахарид, конъюгированный с альбумином человека [Clin. And Diagn. Labor. Immunol., 1996, Jan., p.84-88]. Анализируемые образцы сывороток титруют с 1:50 в фосфатно-солевом буфере с добавлением твина и ЭДТА. После инкубации и отмывания вносят моноклональный конъюгат. Полученное соединение антиген-антитело-конъюгат проявляют субстратной смесью с последующей детекцией на спектрофотометре. Для калибровочной кривой используют аффинноочищенные антитела.

Однако при использовании иммуносорбента, содержащего альбумин человека, есть вероятность определения аутоантител к нему в анализируемых пробах.

Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности определения антител к капсульному полисахариду H.influenzae за счет использования высокоочищенного полисахарида, не требующего конъюгации, а также за счет использования поликлонального конъюгата, представляющего собой кроличьи антитела против иммуноглобулинов G (H+L) человека, меченные пероксидазой, и калибровочных проб, представляющих собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib.

Для достижения указанного технического результата способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. Ед./мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 минут, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 минут в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.

Наличие гуморального иммунитета может быть оценено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода лежит иммуносорбент, представляющий собой стрипированный 96-луночный планшет, сорбированный высокоочищенным капсульным полисахаридом Hib, принадлежность которого к ПРФ доказана с помощью ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии и химического анализа, а специфическая активность - в различных серологических тестах.

При выполнении анализа образцы сывороток и калибровочные пробы вносят в лунки иммуносорбента в рабочем разведении. После инкубации и отмывки во все лунки иммуносорбента вносят конъюгат в рабочем разведении. Проявка реакции осуществляется субстратной смесью, содержащей тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода.

Калибровочные пробы - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. На их основе строится график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах (см. чертеж).

По калибровочному графику определяют относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых сыворотках крови человека.

Используемые реагенты:

(1) иммуносорбент - планшет полистирольный разборный, состоящий из 128-луночных стрипов, сорбированных капсульным полисахаридом Hib, - 1 шт.;

(2) калибровочные пробы (8) - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. Каждая проба содержит 0,2 мл раствора, во флаконе;

(3) отрицательный контроль (К-) - сыворотка крови человека, содержащая <0,5 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;

(4) положительный контроль (К+) - сыворотка крови человека, содержащая >2,0 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;

(5) конъюгат (КГ) - антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, жидкий, концентрированный - 1 фл., 0,2 мл;

(6) субстратная смесь, содержащая тетраметилбензидин (ТМБ) - 1 фл., 12 мл;

(7) промывающий и разводящий фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом (ФСБ-Д)к - 1 фл., 50 мл;

(8) стоп-реагент - 0,9 М h3SO4.

Приготовление растворов для проведения анализа:

1) (ФСБ-Д)к перед применением разводят дистиллированной водой в 10 раз. Полученный раствор ФСБ-Д хранят не более 3 недель при 4-8°С. Раствор предназначен для отмывки планшета от непрореагировавших компонентов, разведения сывороток и конъюгата;

2) контроли (К+ и К-), а также анализируемые сыворотки перед проведением анализа разводят раствором ФСБ-Д до соотношения 1:100 (10 мкл на 1000 мкл ФСБ-Д.) Рабочее разведение сывороток хранению не подлежит;

3) рабочее разведение конъюгата готовят непосредственно перед использованием, разводя исходный раствор до соотношения 1:200 ФСБ-Д (50 мкл на 10 мл ФСБ-Д).

Последовательность операций

Отмывка иммуносорбента. Во все лунки планшета вносят ФСБ-Д в объеме не менее 0,2 мл. Выдерживают планшет при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 3 раза.

Внесение образцов. В лунки первого ряда планшета последовательно вносят калибровочные пробы №№1-8. Далее последовательно вносят рабочие растворы (1:100) контролей (К+ и К-) в дублях и анализируемые сыворотки. Объем вносимых проб - 100 мкл.

Инкубация. Выдерживают планшет с растворами сывороток в течение 30 мин при 18-22°С.

Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ-Д, как указано в п.1.

Внесение рабочего раствора конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора КГ.

Инкубация. Как в п.3.

Отмывка от избытка КГ. Как в п.1.

Внесение субстратного раствора ТМБ. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ.

Инкубация. 15-20 мин в темноте при температуре 18-22°С.

В каждую лунку вносят по 50 мкл стоп-реагента.

Учет результатов

Вывести спектрофотометр на нулевой уровень («blank») по воздуху.

Измерить оптическую плотность в лунках планшета при 450 нм в течение 10 минут после остановки реакции.

Построить график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах.

По калибровочному графику определить относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых пробах.

Пример исследования сывороток детей в возрасте до 3 лет, подвергшихся иммунизации вакциной «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), на наличие антител к капсульному полисахариду Hib

№№ п/пОП 450 нмУсл. ед./мл
до иммунизациичерез месяц после иммунизациидо иммунизациичерез месяц после иммунизации
10,760,651,31,04°
20,830,941,61,9*
31,020,552,30,8°
40,711,361,25,2**
50,610,360,90,4°
60,550,560,80,8-
70,940,991,92,0*
80,931,051,82,4*
90,270,700,31,2**
100,701,251,23,9*
110,520,560,70,8*
120,650,861,01,6*
130,330,520,40,7*
140,281,480,36,7**
150,340,750,41,3*
161,321,734,714,8**
170,841,791,617,9**

Из 17 детей у 13 (*) уровень IgG AT после вакцинации вырос (из них - в 4 и более раз - только у 5 человек (**)). У 3 детей произошло понижение уровня AT после вакцинации (°), а у одного уровень AT не изменился (-).

Пример определения антител капсульному полисахариду в сыворотках вакцинированных детей с помощью набора «Fuller Laboratories» и предложенного способа.

№№ сывороткиНабор «Fuller»Предложенный способ
до вакцинациим кг/млпосле вакцинациим кг/млдо вакцинации усл.ед./млпосле вакцинации усл.ед./мл
10,721,11,581,87
20,522,41,25,17
30,521,90,271,09
40,421,81,173,87
50,422,60,286,68
60,211,40,381,32
71,722,24,7114,75
81,622,41,617,88

Способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b, заключающийся в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 условных единиц/мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.

www.findpatent.ru

способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами - патент РФ 2380709

Изобретение относится к медицинской иммунологии, в частности к способам выявления и идентификации антител к полисахаридным антигенам, и может быть использовано для определения уровней антител в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) при диагностике заболеваний, вызываемых капсульными формами таких возбудителей, как Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, а также для определения уровня поствакцинального иммунитета. Ковалентное связывание полисахарида к предварительно иммобилизованному на поверхности планшета белку обеспечивает надежную и простую фиксацию антигенов, исключающую влияние сторонних химических групп на результаты анализа, что приводит к упрощению способа сенсибилизации планшета при обеспечении достоверности ТИФА. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

Рисунки к патенту РФ 2380709

способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами, патент № 2380709

Изобретение относится к медицинской иммунологии, в частности к способам выявления и идентификации антител к полисахаридным антигенам, и может быть использовано для определения уровней антител в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) (ELISA) при диагностике заболеваний, вызываемых капсульными формами таких возбудителей, как Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, а также для определения уровня поствакцинального иммунитета при вакцинировании вакцинами, содержащими полисахаридные антигены.

Для диагностики инфекционных заболеваний используют различные способы, например микроскопическое исследование мазков, культуральные, определение уровня антител к антигенам возбудителя методом ТИФА. Однако культуральные и микроскопические методы трудоемки, дорогостоящи и непригодны для массового применения. Известные диагностические системы для твердофазного иммуноферментного определения антител к полисахаридным антигенам сложны в изготовлении и дорогостоящи, поскольку отрицательно заряженные или нейтральные полисахариды слабо адсорбируются на поверхности пластика. Для надежной фиксации полисахаридов на планшете используют сэндвич-метод, когда полисахарид связывается с иммобилизованными на поверхности планшета специфическими антителами. Для изготовления сенсибилизированного планшета его обрабатывают цельной гипериммунной сывороткой, либо очищенными цельными антителами, либо Fab - фрагментами специфических антител (Barbara A. and all; Journal Of Clinical Microbiology, July 1982, p.63-69) [1]. Однако для использования известного способа требуется получение специфических гипериммунных сывороток, что является сложным и длительным процессом, кроме того, получение таких сывороток сложно стандартизовать, в результате чего серии сенсибилизированных планшетов могут значительно различаться по количеству связавшегося антигена, что снижает достоверность анализа.

Известен способ сенсибилизации пластикового планшета, в котором для повышения сорбции полисахаридов осуществляют предварительную конъюгацию полисахарида с белком-носителем, что обеспечивает надежную фиксацию его на пластике (Massimo Mariani and all. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Sept. 1998, p.667-674) [2]. При этом конъюгацию полисахарида осуществляют известным способом, с последующей гель-хроматографией для выделения конъюгата. Однако, ввиду малого объема получаемого препарата и потерь, неизбежных при гель-хроматографии, для массового изготовления сенсибилизированных планшетов этот способ не используется. Кроме того, при хроматографии невозможно достичь полной очистки конъюгата от несвязавшегося полисахарида и белка-носителя, что приводит к отклонениям от расчетных значений связавшегося антигена при сенсибилизации планшета. Эта проблема весьма актуальна, и ее решению посвящен патент (US 6284250, НКИ 424/193, МПК А61К 47/48, 04.02.1999) [3], в котором представлен способ разделения конъюгата и свободного белка с помощью пористых гранул "StrataClean", которые при добавлении в раствор поглощают несвязавшийся белок. Однако этот способ требует проведения дополнительных операций, связанных с перемешиванием раствора с гранулами, инкубацией, с последующим разделением раствора и гранул, что усложняет изготовление сенсибилизированного планшета.

Известен способ фиксации полисахарида на поверхности планшета с помощью реакционных групп, внедряемых в молекулу полисахарида по карбоксильной или альдегидной группе (US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04.2005) [4]. Внедрение посторонних групп в молекулу полисахарида при связывании антител с данной группой может привести к искажению результатов ТИФА. В патенте (US 6218195, НКИ 436/518, МПК G01N 33/569, 17.04.2001) [5] приведен способ фиксации полисахаридного антигена на поверхности пластика при помощи раствора для разведения коньюгата пероксидазы хрена (Calbiochem-Novabiochem Corporation, La Jolla, Calif. 9203C, USA, catalogue #516534). Однако механизм действия не приведен, что затрудняет оценку способа и возможность его применения с иными полисахаридными антигенами.

Известен быстрый, опосредованный нагреванием способ выполнения сорбционного иммуноферментного анализа (RU 2309407 С2, G01N 33/544, 33/543, 33/53, 10.05.2006) [6]. Согласно способу анализ проводят на активированной поверхности, способной образовывать ковалентную связь с биомолекулой, при этом все стадии ТИФА, такие как связывание антигена, блокирование, связывание антитела и конъюгата, проводят путем термальной активации в термоциклере и только реакцию фермент-субстрат проводят вне термоциклера при комнатной температуре. Инертную твердую поверхность, такую как поликарбонатный планшет для ПЦР(обычно применяемые для полимеразной цепной реакции) и 96-луночный полистирольный планшет для ТИФА, активировали путем фотохимической реакции, проводимой в сухих условиях с использованием 1-фтор-2-нитро-4-азидобензола (FNAB). В известном способе планшет сенсибилизируют антителами или белковыми антигенами. Однако неизвестно о применимости упомянутого способа для сенсибилизации полисахаридными антигенами, которые, как известно, являются одними из основных антигенов грамотрицательных микроорганизмов, таких как Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas.

Наиболее близким по выполнению и достигаемому результату к заявляемому изобретению является Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces (US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04.2005) [7], принимаемый за прототип.

Согласно способу-прототипу получают конъюгат капсульного полисахарида грамотрицательных бактерий с репортерной группой молекул. Для получения наилучших результатов в иммобилизации полисахаридных антигенов для диагностических или для иного применения необходимо иммобилизовывать антиген в правильной ориентации к твердой фазе. Для обеспечения этого необходимо регионспецифичное формирование устойчивых химических связей между репортерной молекулой и полисахаридным антигеном. Изобретение включает шаги для формирования ковалентной связи между карбоксильной группой полисахарида и репортерной молекулой, с образованием конъюгата полисахарида с репортерной молекулой, которая содержит участок связывания с субстратом. В раствор полисахарида, выделенного из бактериальной массы и содержащего карбоксильные группы, добавляют активирующее вещество, представляющее собой реакционную группу, способную к фотореакционному, термореакционному либо аффинному связыванию с поверхностью планшета. При этом в растворе полисахарида происходит образование конъюгата полисахарида с упомянутой репортерной группой посредством ковалентной связи. При нанесении раствора конъюгата полисахарида с репортерной группой на планшет происходит связывание реакционной группы непосредственно с поверхностью планшета, и обеспечивается фиксация полисахаридного антигена. В результате получают иммуносорбент, который способен присоединять антитела к полисахаридным антигенам при проведении ТИФА.

Внедрение в состав полисахарида групп молекул, обеспечивающих ковалентное связывание полисахарида с пластиком, влияет на результат анализа при связывании антител с этими группами молекул и, следовательно, приводит к снижению достоверности анализа. Кроме того, использование фотореактивных и термореактивных или аффинных групп усложняет способ сенсибилизации планшета, так как требует дополнительного оборудования.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого, пригодного к массовому использованию и обеспечивающего достоверность результатов ТИФА способа сенсибилизации планшета полисахаридными анитигенами.

Поставленная задача решена с достижением нового технического результата - упрощения способа сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа за счет исключения использования при активации полисахаридных антигенов химических фотореактивных, термореактивных и аффинных групп, включаемых в состав иммуносорбента и способных оказать влияние на результаты анализа, при сохранении достоверности ТИФА.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами грамотрицательных микроорганизмов, обладающих полисахаридной капсулой, заключающемся в активации и конъюгации полисахаридных антигенов с фиксацией их на поверхности планшета, согласно изобретению поверхность планшета предварительно покрывают раствором белка, содержащего реакционно-способные аминогруппы (Nh4), а фиксацию полисахаридных антигенов осуществляют путем ковалентного связывания активированных полисахаридов с иммобилизованным на поверхности планшета упомянутым белком.

Новизна настоящего изобретения состоит также в том, что активацию полисахаридного антигена осуществляют окислением путем добавления к водному раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл периодата натрия (NaIO4 ) при соотношении 1:1.

Новизна настоящего изобретения состоит также в том, что активацию полисахаридного антигена осуществляют добавлением бромциана (BrCN) в соотношении 1:10 к раствору полисахарида концентрацией 10-100 мг/мл.

В заявляемом способе твердая фаза представлена иммобилизованным на поверхности планшета белком, в то время как у прототипа связывание конъюгированного и активированного полисахарида происходит непосредственно с поверхностью планшета. Ковалентное связывание полисахарида к предварительно иммобилизованному на поверхности планшета белку обеспечивает надежную и более простую, по сравнению с прототипом, фиксацию антигенов, исключающую влияние сторонних химических групп на результаты анализа, что приводит к упрощению способа сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа при обеспечении достоверности ТИФА. Известно нанесение белка на поверхность планшета после фиксации антигена для исключения неспецифического связывания при проведении ТИФА («Теория и практика иммуноферментного анализа», Егоров A.M. и др. М.: Высш. Шк., 1991, с.214) [8]. В отличие от известной функции белка, в настоящем изобретении белок наносят на поверхность планшета до фиксации антигена и полисахаридные антигены фиксируют путем конъюгации полисахарида с иммобилизованным на поверхности планшета белком.

Изобретение поясняется чертежом и таблицей.

На чертеже приведена последовательность определения специфических антител в ТИФА. В таблице представлены результаты испытаний двух типов планшетов, полученных заявляемым способом при определении антител класса G мыши к полисахаридному антигену-декстрану в опытных и контрольной группах.

Способ сенсибилизации планшета полисахаридными антигенами осуществляется следующим образом (см. чертеж). Поверхность лунки планшета 1 покрывают раствором белка 2, белок иммобилизуется на поверхности лунки. Активированный капсульный полисахарид 3 ковалентно связывается с иммобилизованным белком 4. Полученный иммуносорбент используют в ТИФА известным способом («Иммуноферментный анализ», Нго Т. М.: Мир 1988 - 196 с.) [9]. Для этого в лунку вносят исследуемую сыворотку крови, инкубируют и отмывают от не связавшихся с иммуносорбентом антител. Затем вносят конъюгат фермента со специфическим антителом 6, инкубируют, отмывают и добавляют раствор субстрата фермента 7, в результате ферментативной реакции образуется окрашенный продукт 8. Реакцию останавливают добавлением кислоты и измеряют оптическую плотность планшетным фотометром. По величине оптической плотности определяют количество антител в исследуемой сыворотке крови.

Способ сенсибилизации планшета представлен подготовкой планшета, активацией и фиксацией полисахаридных антигенов.

Подготовка планшета

Раствор белка, имеющий свободные реакционно-способные Nh4 и СООН группы, например, бычьего сывороточного альбумина (БСА), концентрацией 2%, в изотоническом фосфатно-солевом буфере (ЗФР), рН 7,5, содержащем 0,01% мертиолята натрия, вносят по 300 мкл в каждую лунку иммунологического планшета и оставляют при 37°С на 12 часов. Затем планшет пятикратно отмывают от несвязавшегося белка раствором Твин-20 концентрации 0,05% в изотоническом фосфатно-солевом буфере рН 7,5. После этого планшет готов к нанесению активированного полисахарида.

Активация полисахаридных антигенов

К раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл добавляют NaIO4 в весовом отношении 1:1 к полисахаридному антигену, раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте и перемешивании в течение 0,5-5 часов. Для завершения реакции добавляют 1/2способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами, патент № 2380709 объема 0,2М раствора этиленгликоля. Перемешивают в течение 30 минут и затем диализуют против дистиллированной воды либо обессоливают методом ультрафильтрации. Фильтрат удаляют, а концентрат используют для сенсибилизации планшета. Перед нанесением на планшет в раствор окисленного полисахарида добавляют NaBh5 в весовом соотношении 1/3 к полисахариду и устанавливают рН 5,0 с помощью 0,1М ацетатного буфера. Полученный раствор разводят 0,05М ацетатным буфером рН 5,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл.

В другом частном случае в раствор содержащий 10-100 мг/мл полисахаридного антигена добавляют BrCN в весовом соотношении 1/10 к полисахаридному антигену, рН раствора доводят до 10 с помощью 0,1М NaOH, перемешивают в течение 5 минут, затем рН доводят до 8,0 с помощью 0,1М HCl и разводят ЗФР рН 8,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл.

Фиксация полисахаридных антигенов

Полученные растворы активированных полисахаридов вносят по 300 мкл в лунки предварительно подготовленного планшета и оставляют при комнатной температуре на 3 часа. Полисахаридный антиген ковалентно связывается с белком, иммобилизованным на поверхности планшета, взаимодействием альдегидных групп окисленного полисахарида с белком по Nh4 группе.

Способ был реализован в эксперименте по созданию и применению иммуносорбента на основе полисахарида декстрана.

Проведение ТИФА. Реагенты и расходные материалы, которые были использованы при проведении ТИФА.

Планшет для проведения иммуноферментной реакции с нанесенным антигеном, приготовление которого описано выше. Стандартный раствор для промывки планшета, который готовят добавлением к ЗФР твин-20 до конечной концентрации 0,05%. В качестве иммуноферментного коньюгата используют антитела, меченные пероксидазой хрена, со специфичностью к иммуноглобулинам мыши класса G. Рабочий раствор конъюгата готовят согласно рекомендации изготовителя. Дилюент - растворитель для сывороток, готовят путем добавления стерильной сыворотки лошади до конечной концентрации 1% к ЗФР, содержащему 0,05% твин-20. Субстрат - химический субстрат для проявления ферментативной реакции, например раствор тетра-метил-бензидина (ТМБ). Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед применением смешиванием раствора ТМБ с раствором перекиси водорода в пропорции, рекомендованной производителем. В качестве стоп-реагента для остановки ферментативной реакции используют 0,5М раствор серной кислоты.

Постановка анализа

1. В лунку планшета А1 вносят 100 мкл сыворотки крови, содержащей IgG к ВСА в качестве положительного контроля, в лунки В1 и С1 вносят по 100 мкл сыворотки крови мыши, не содержащей антител к ВСА и полисахариду, инактивированной прогреванием в течение 3 ч при температуре 56°С. В остальные лунки планшета вносят по 90 мкл раствора для разведения сывороток и по 10 мкл исследуемых сывороток. Содержимое лунок перемешивают с помощью пипетки. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С.

2. По окончании инкубации удаляют содержимое лунок и промывают планшет пять раз рабочим фосфатно-солевым буфером, содержащим твин. Для этого вносят в каждую лунку планшета от 200 до 250 мкл раствора, а затем удаляют содержимое лунок в емкость с дезраствором. По окончании промывки остатки раствора удаляют, активно постукивая планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.

3. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата пероксидазы. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С.

4. По окончании инкубации удаляют содержимое лунок и промывают планшет, как описано в п.2.

5. Вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и помещают на 20 мин в защищенное от света место при температуре от 20°С до 27°С.

6. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента и проводят измерение оптической плотности на планшетном фотометре ЭФОС 9305 при длине волны 450 нм.

Пример 1

Активацию полисахаридного антигена осуществляли окислением путем добавления к водному раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл периодата натрия NaIO4 при соотношении концентраций 1:1. Указанные концентрации позволяют получить гарантированное ковалентное связывание активированного полисахарида к иммобилизованному на поверхности планшета белку (табл.). В конкретном примере выполнения навеску 50 мг декстрана Т-500 производства Pharmacia растворяли в 10 мл дистиллированной воды и добавляли 50 мг NaIO4, перемешивали в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре. Затем добавляли 5 мл 0,2М раствора этиленгликоля. Раствор диализовали 24 часа против 0,05М ацетатного буфера рН 5,0. Перед нанесением на планшет добавляли 0,025 г NaBh5 , разводили 0,05М ацетатным буфером рН 5,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл и вносили по 300 мкл в лунки предварительно подготовленного заявляемым способом планшета.

Пример 2

Активацию полисахаридного антигена осуществляли добавлением бромциана BrCN в соотношении 1:10 к раствору полисахарида концентрацией 10-100 мг/мл. Указанные концентрации позволяют получить гарантированное ковалентное связывание активированного полисахарида к иммобилизованному на поверхности планшета белку (табл.). В конкретном примере выполнения навеску 50 мг декстрана Т-500 производства Pharmacia растворяли в 10 мл дистиллированной воды и добавляли 1 мг BrCN. Доводили рН до 10,5 0,1М NaOH, перемешивали в течение 5 минут при температуре 4-5°С. Затем устанавливали рН 8,0 с помощью 0,1М HCl, разводили (ЗФР) рН 8,0 до концентрации полисахарида 5 мкг/мл и вносили по 300 мкл в лунки предварительно подготовленного заявленным способом планшета.

Пример 3

Для проверки заявляемого способа сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа был проведен эксперимент по иммунизации мышей конъюгатом столбнячного анатоксина с декстраном и последующему определению титров антиполисахаридных антител в сыворотке крови. В нативном (немодифицированном) виде декстран обладает низкой иммуногенностью. Ковалентная сшивка декстрана с иммуногенным белком приводит к образованию антител к полисахариду у привитых конъюгатом экспериментальных животных. Конъюгацию декстрана с анатоксином проводили окислением декстрана периодатом натрия и связыванием альдегидных групп окисленного полисахарида с белком по Nh4 группе. 25 самцов беспородных мышей массой 15-20 г были иммунизированы конъюгатом декстрана и столбнячного анатоксина. Иммунизацию проводили двукратно с 10-дневным интервалом в иммунизирующей дозе 0,3 мг декстрана. Через 7 дней после повторной иммунизации исследовали сыворотку крови мышей методом ТИФА на наличие антиполисахаридных антител класса G с применением планшетов, сенсибилизированных заявляемым способом на наличие антиполисахаридных антител. В качестве контроля использовали сыворотку крови мышей, которым вместо конъюгата вводили изотонический раствор. Как следует из таблицы, интенсивность окраски в лунках с сыворотками крови мышей опытной группы более чем в четыре раза превосходит значения для сывороток неиммунизированных мышей контрольной группы. Так как статистический критерий Стьюдента, t для экспериментальных и контрольных групп ниже 0,005 (Статистический анализ медицинских данных: Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю.Реброва. - М.: Медиа-Сфера, 2003. - 312 с.) [10], что свидетельствует о достоверности различий между контролем и опытом. Следовательно, у опытной группы развился иммунный ответ на полисахарид, и иммуносорбент, построенный заявляемым способом, позволяет диагностировать произошедшее нарастание количества специфических антиполисахаридных антител. Исключение использования при активации полисахаридных антигенов химических фотореактивных, термореактивных и аффинных групп, включаемых в состав иммуносорбента и способных оказать влияние на результаты анализа, обеспечивает достоверность ТИФА и упрощает способ сенсибилизации планшета полисахаридными антигенами.

Источники информации

1. Barbara A. and all; Journal Of Clinical Microbiology, July 1982, p.63-69.

2. Massimo Mariani and all. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Sept. 1998, p.667-674.

3. US 6284250, НКИ 424/193, МПК А61К 47/48, 04.02.1999.

4. US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04. 2005.

5. US 6218195, НКИ 436/518, МПК G01N 33/569, 17.04.2001.

6. RU 2309407 C2, G01N 33/544, 33/543, 33/53, 10.05.2006.

7. US 6881549, НКИ 435/7.35, МПК G01N 33/543, 19.04.2005.

8. Теория и практика иммуноферментного анализа /Егоров A.M. и др. М.: Высш. Шк.,1991, 214 с.

9. Иммуноферментный анализ / Нго Т. М.: Мир, 1988. 197 с.

10. Статистический анализ медицинских данных: Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю.Реброва. - М.: Медиа-Сфера, 2003. - 312 с.

Таблица 1
Результаты испытаний двух типов планшетов, полученных заявляемым способом при определении антител класса G мыши к полисахаридному антигену (декстрану) в опытных и контрольной группах
способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами, патент № 2380709 Способ активации полисахарида
Концентрация полисахарида при активации, в мг/мл Периодатное окисление Активация бромцианом
Опытная группа КонтрольнаяОпытная группаКонтрольная
Оптическая плотность при D 450nm в О.Е. Оптическая плотность при D 450 nm в О.Е. Оптическая плотность при D 450nm в О.Е. Оптическая плотность при D 450 nm в О.Е.
100,711±0,069 0,157±0,027 0,735±0,060 0,142±0,018
500,728±0,075 0,160±0,024 0,752±0,067 0,123±0,022
1000,719±0,086 0,171±0,031 0,756±0,051 0,122±0,023

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа полисахаридными антигенами грамотрицательных микроорганизмов, обладающих полисахаридной капсулой, заключающийся в активации и конъюгации полисахаридных антигенов с фиксацией их на поверхности планшета, отличающийся тем, что поверхность планшета предварительно покрывают раствором белка, содержащего реакционно-способные аминогруппы (-Nh3), а фиксацию полисахаридных антигенов осуществляют путем ковалентного связывания активированных полисахаридов с иммобилизованным на поверхности планшета упомянутым белком.

2. Способ сенсибилизации планшета по п.1, отличающийся тем, что активацию полисахаридного антигена осуществляют окислением путем добавления к водному раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл периодата натрия NalO4 при соотношении концентраций 1:1 к полисахаридному антигену.

3. Способ сенсибилизации планшета по п.1, отличающийся тем, что активацию полисахаридного антигена осуществляют добавлением к раствору полисахаридного антигена концентрацией 10-100 мг/мл бромциана BrCN в соотношении 1:10 к полисахаридному антигену.

www.freepatent.ru

Антигены полисахариды - Справочник химика 21

    Интересная группа соединений образуется как бы на границе существования двух важных классов соединений — липидов и углеводов. В зависимости от соотношения липидных и углеводных фрагментов, эти соединения определяют как гликолипиды (в самом общем случае), выделяя в них группу липо-полисахаридов. В природе эти соединения распространены очень широко — они обнаружены в растениях, животных и микроорганизмах. В последнем случае, для микроорганизмов, характерно присутствие липо-полисахаридов, которые играют важную роль в их жизнедеятельности участвуют в формировании клеточных мембран, в транс-мембранном транспорте различных соединений, являются эндотоксинами, антигенами, рецепторами бактериофагов. В организмах человека и животных полисахаридный фрагмент этих липидов, направленный в сторону окружающей среды от клеточной [c.127]     Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

    По реакции с иодом полисахариды условно разделяют на крахмалоподобные (синяя окраска) и гликогеноподобные (различная бурая окраска). По структуре полисахариды могут быть линейными (амилаза), разветвленными (амилопектин, гликоген), циклическими (декстрины Шар-дингера). По биологическому значению полисахариды делятся на конструктивные (целлюлоза, хитин и др.), энергетические или запасные (крахмал, гликоген, эремуран), физиологически активные (гепарин — антикоагулянт крови и регулятор липидного обмена, гиалуроновая кислота — регулятор проницаемости тканей и минерального обмена), иммунополисахариды (полисахариды крови, декстран, полисахариды пневмококков, крахмал и др. обладают антигенными свойствами). [c.30]

    Одна из нерешенных и ожидающих своего объяснения загадок иммунологии связана с тем, что животное после иммунизации бывает иногда способно сохранять невосприимчивость в течение многих лет или даже всей своей жизни. У таких животных в течение всего периода невосприимчивости можно обнаружить присутствие антител [136]. Очень трудно решить вопрос о том, сохраняются ли в организме этих животных небольшие количества антигена, активно способствующего образованию антител. Это, повидимому, имеет место при некоторых вирусных заболеваниях, сопровождающихся длительно сохраняющимся иммунитетом [2]. Небольшие количества ослабленного вируса могут сохраняться в организме и вызывать образование антител. Еще более поразительным примером может служить то, что введенные мышам в дозе 0,5 мг антигенные полисахариды пневмококков удается обнаружить в органах подопытного животного через несколько месяцев после инъекции [137]. Эти данные подтверждают ту точку зрения, что даже в тех случаях, когда иммунитет сохраняется в течение длительного периода времени, образование антител происходит таким же путем, как описано выше, т. е. путем изменения белкового синтеза под действием молекул антигена. Длительным пребыванием антител в тканях организма, возможно, объясняется также так называемая анамнестическая реакция, т. е. появление в организме значительных количеств антител в том случае, когда животному производится повторная инъекция небольшой дозы антигена через большой промежуток времени после первой инъекции. Наблюдаемое при этом внезапное увеличение титра антисыворотки обусловлено, повидимому, переходом антител из ткани в кровоток. Истинное новообразование антител в этих случаях никем до настоящего времени не было еще достаточно убедительно показано [139]. [c.350]

    Механизм распознавания рецепторами и антителами своих антигенов почти неизвестен. Известно, однако, что это в высшей степени специфическое взаимодействие, так как его блокируют самые незначительные изменения в структуре углеводного антигена. Структурно измененный полисахарид или углеводсодержащий биополимер — это уже другой антиген на него реагируют рецепторы других лимфоцитов и вырабатываются другие антитела. [c.158]

    Они могут быть различной природы (бактерии, вирусы, нуклеиновые кислоты, липиды, полисахариды, белки и пр.). Для антигенов характерны два отличительных свойства иммуноген-ность и антигенная специфичность. [c.90]

    Сходный метод — количественное определение одного из моносахаридов в осадке, который дает полисахарид с избытком антитела, — применяется для контроля чистоты антигенов, особенно часто в случае групповых веществ крови . Потеря иммунологической активности в процессе очистки свидетельствует о несомненной деструкции полисахарида. [c.518]

    Клеточные стенки многих низших грибов содержат-хитин, целлюлозу или оба этих полисахарида. Однако наряду с ними, а часто и вместо них, в клеточной стенке микроорганизмов содержатся специфические полисахариды или углеводсодержащие биополимеры, обеспечивающие антигенную специфичность поверхности клеток. [c.551]

    К первому типу относятся веш,ества, строение которых аналогично строению полисахаридов соединительной ткани. Они содержат неразветвленные или слаборазветвленные полисахаридные цепи с большим количеством кислотных групп. Примером таких соединений могут служить пектиновые кислоты, V -антиген грамотрицательных бактерий, многие полисахариды капсулы пневмококков. Эти вещества обычно внеклеточной природы. [c.609]

    НИИ макромолекулярной структуры. Вместе с тем именно эти особенности макромолекулярной структуры полисахаридов обусловливают, вероятно, специфичность их биологических функций, отличающуюся от специфичности белков и нуклеиновых кислот. Первостепенное значение для выполнения этих функций имеет, по-видимому, распределение реакционноспособных групп на поверхности макромолекулы углеводсодержащего биополимера. Указанными выше особенностями макромолекулярной структуры полисахаридов определяется возможность большого разнообразия в таком распределении и, следовательно, большой объем информации, который может передаваться с помощью углеводсодержащих биополимеров. Специфические для каждого вида, а часто и для каждого индивидуума антигенные свойства поверхности клеток, которые связаны с присутствием углеводсодержащих биополимеров, могут служить хорошей иллюстрацией огромных возможностей передачи специфической информации, характерной для этого класса соединений. [c.636]

    С их помощью был осуществлен синтез сложного гетерополисахарида, структура которого соответствовала 0-антигенному полисахариду бактерии 5а11попе11а new пgIoп. [c.489]

    Капсулы хорошо выявляются при суспендировании бактерий в туши или черной краске (нигрозине) —на темном фоне бактерии и их капсулы светлые, поскольку тушь и нигрозин не проникают в капсулы. Значение капсул для бактерий объяснить трудно, так как они не характерны для определенных родов или видов. В пределах вида одни штаммы образуют капсулы, другие в тех же условиях не образуют. Слизь капсул непрочно задерживается на клеточной оболочке бактерий. Встряхиванием или энергичным перемешиванием культуры капсульных бактерий можно частично или полностью удалить капсулы. В углеводных капсулах обнаружены глюкоза, галактоза, рамноза, манноза, абеквоза, фукоза, колитоза, гептоза и другие сахара. У нескольких штаммов одного и того же вида в состав капсул могут входить различные сахара. На этом основаны серологические реакции типизации штаммов пневмококков (по так называемому соматическому 0-антигену). Полисахарид декстрсаи, из [c.24]

    Биологические функции. Белки могут выполнять в живых организмах самые различные функции катализировать (ферменты) и регулировать (гормоны) биохимич. реакции входить в состав соединительной ткани (напр., коллаген) или мышц (актин, миозин) служить резервными питательными веществами (гранулы белка в цитоплазме) и др. Функции дезоксирибонуклеиновой к-ты — передача генетич. информации из поколения в поколение при клеточном делении. Этот Б. служит исходной матрицей при передаче информации внутри клетки. Рибонуклеиновая к-та также участвует в этом процессе, приводящем к синтезу специфич. белков клетки. Полисахариды могут служить резервными питательными веществами (напр., крахмал, гликоген), выполнять структурные функции (напр., целлюлоза полисахариды соединительной ткани), обеспечивать специфические свойства поверхности клеток (напр.1, антигенные полисахариды микроорганизмов) или защиг ту организма в целом (напрнмер, камеди и слизи растений). [c.128]

    Шибаев В. П., Чекунчиков В. П., Кочетков Н. К. Синтез бактериальных антигенных полисахаридов и их фрагментов, Сообщ. 9. Синтез полисахарида — повторяющегося звона О-специ-фического полисахарида Salmonella newington с радиоактивной меткой в [c.349]

    Баркер (Англия) осветил вопрос о структуре антигенных полисахаридов пневмококков. Приведя литературные данные о специфических полисахаридах пневмококков ( 2 разных типов), докладчик остановился главным образом на своих работах по изучению полисахарида пневмококка типа V. Структурными компонентами его являются D-глюкоза, D-глюкуроновая кислота, новый гексозамин — пневмозамин и N-ацетиламиносахар X (строение его пока еще недостаточно выяснено). [c.324]

    Некогда полагали, что антигенами могут быть только белки теперь мы знаем, что некоторые углеводы также обладают высокой антигенностью. Жесткими участками в полисахаридных антигенах могут быть пиранозные или фуранозные кольца [25]. Высокомолекулярные углеводы варьируют по своей антигенности. Полисахариды пневмококков антигенны для человека и мыши, но не для кроликов [8]. Декст-раны, явно не антигенные для кроликов, антигенны для человека [17, 18]. Очищенные группоспецифические А- и В-антигены крови антигенны для человека, но не для кролика [16,24]. [c.49]

    Для решения вопроса о том, являются ли антитела сывороточными глобулинами или же они только связаны с этой фракцией, можно использовать специфические методы очистки антител. Обычно эти методы включают два основных этапа 1) образование преципитата антиген—антитело и 2) диссоциацию преципитата и выделение чистого антитела. Первые успешные опыты этого рода были предприняты Фелтоном [42], который преципи-тировал антигенные полисахариды пневмококков соответствующей иммунной сывороткой, а затем разлагал преципитат, обрабатывая его гидроокисью бария. При такой обработке антитела переходят в раствор, нерастворимые же бариевые соли полисахаридов остаются в осадке. Гейдельбергер и его сотрудники успешно расщепляли подобные преципитаты, обрабатывая их концентрированными растворами хлористого натрия [43, 44]. В лаборатории автора для получения чистых антител преципитаты азобелков обрабатывались разведенными кислотами в присутствии нейтральных солей. При этом большая часть антител отщеплялась и переходила в раствор, а антиген и недиссоцииро-ванная часть антител оставались в осадке [45]. Растворы антител, полученные при помощи этих методов, содержат глобулины, не отличающиеся по свойствам от описанных выше нормальных глобулинов. Дальнейшие исследования показали, что больше 90% выделенных подобным образом глобулинов осаждается соответствующим антигеном. Это весьма убедительно подтверждает, что данные глобулины действительно идентичны с настоящими антителами. [c.336]

    Важное значение в защитных реакциях организма имеют гликопротеины плазмы крови (см. стр. 576). Показано присутствие в плазме по крайней мере двадцати биологически активных гликопротеинов выполняющих различные функции. В частности, фракция углобулинов, к которой принадлежат антитела, вырабатываемые при введении в организм антигенов, содержит значительное количество остатков моносахаридов. Непосредственным участником защитной иммунной реакции в организме является так называемый комплемент , который соединяется с комплексом антиген—антитело и вызывает разрушение введенных чужеродных клеток. Активность комплемента зависйт от присутствия четырех компонентов, из которых по крайней мере два являются гликопротеинами. Многие полисахариды микроорганизмов повышают неспецифическую резистентность животных к бактериальной инфекции . Механизм их действия пока не вполне понятен. [c.606]

    На рис. 2 показан радиоавтограф аналитических ИЭФ-фореграмм последовательных фракций, полученных в препаративном ИЭФ. Аналитические ИЭФ-фореграммы были проявлены иодированным ( Ч) антигеном [полисахарид стрептококка группы А (вариант)]. Препаративному ИЭФ были подвергнуты 150 мг IgG, выделенного из антисыворотки кролика препаративным электрофорезом в блоке агарозы (Braun, Krause, 1968 см. также гл. 2). [c.139]

    Кор представляет собой линейный или слаборазвет-вленный (по типу гребнеобразного) полисахарид, содержащий остатки довольно необычных моносахаридов — 2-кето-З-дезоксиоктоновых кислот (общая формула 40). Наконец, О-антигенная цепь — это обычно регулярный полисахарид, построенный из повторяющихся три—гекса-сахаридных (часто разветвленных) звеньев причем в их состав нередко входят весьма экзотические моносахариды. [c.46]

    Разнообразие этих рецепторов (и клонов лимфоцитов) огромно число различных рецепторов составляет величину порядка миллиона, так что практически на любой чужеродный биополимер (антиген) находится соответствующий ему рецептор. Зрелые В-лимфоциты, не соприкасавшиеся со своими антигенами (их называют девственными лимфоцитами), не делятся. Однако контакт с антигеном, например с бактериальным полисахаридом, служит сигналом для целой цепи событий. В-Лимфоцит после этого трансформируется в плазматическую клетку и начинает делиться. Общее количество клеток данного клона резко возрастает они начинают продуцировать и секрети-ровать в кровь и лимфу большие количества свойственных этому клону иммуноглобулинов, т. е. антител, специфичных к данному антигену. Антитела реагируют с соответствующими антигенами в растворе, что приводит к их осаждению, и с теми же антигенами на поверхности бактериальной клетки. Таким образом происходят удаление [c.157]

    Гомополисахариды-декстран и леван стимулируют синтез антител у мышей и человека, но не у кролика и морской свинки. Детерминанта этих А. построена из 6-7 остатков моносахаридов. Антигенная структура полисахаридов в осн. определяется последовательностью мономеров и характером их связей, а не конформацией. А, микроорганиз- [c.174]

    MOB также м.б. полисахаридами или липополисахаридами. В-ва групп крови являются гликопротеинами их антигенные св-ва определяются углеводным компонентом. К гликопротеинам относятся также опухолево-змбрио-нальные А. Детерминанты этих А. находятся в белковой части молекулы. Еще одна важная группа А. гликопротеино-вой природы-А. главного комплекса гистосовместимости (они располагаются на пов-сти клеток). Их значимость определяется тем фактом, что они служат объектом узнавания для Т-лимфоцитов, к-рые несут регуляторную ф-цию, а также удаляют чужеродные клетки или же свои клетки, имеющие на пов-сти вирусные или другие А. [c.174]

    Заслуживает особого внимания применение высокомолекулярных комплексообразователей для выделения полисахаридов. Простейшим примером могут служить комплексы целлюлозы с амилозой или растительными галактоманнанами , образование которых объясняется сходством линейно построенных молекул этих соединений. Некоторые белки образуют нерастворимые комплексы с полисахаридами, например, кон-канавалин-А осаждает гликоген и некоторые другие высокоразветвлен-ные полисахариды . Наиболее избирательным методом осаждения полисахаридов является действие соответствующих антисывороток , применяемое в аналитических и, гораздо реже, в препаративных целях (подробнее об антигенных свойствах полисахаридов и явлении иммунитета см. стр. 518 и 604). [c.485]

    Область, контактнрчтощая с антигеном (паратоп, или активный, антигенсвязывающий центр), располагается на N-конце РаЬ-фрагментов она представляет собой более или менее гл ок то полость, стенки к-рой сформированы ами-нокислотньгчш остатками гипервариабельных участков легкой и тяжелой пепей. У антител, связывающих белки и полисахариды, в полость может входить до 6-7 остатков аминокислот или моносахаров. У молекул IgG, IgD, IgE и IgA (молекула IgA построена подобно молекуле IgG) 2 активные центра, j молекул IgM -10. [c.217]

    Наиб, практическое использование находит сахароза, к-рая по масштабам ежегодного получения (св. 100 млн. т) занимает одно из первых мест среди индивидуальных орг. соединений. В небольишх кол-вах производятся лактоза и циклодекстрины, используемые в фармацевтич. пром-сти. Синтетич. О., идентичные антигенным детер.мннаитам бактериальных полисахаридов, мог>т иайти применение при сиитезе искусств, антигенов, перспективных для получения специфич, вакцин. [c.379]

    Наружная поверхность внещней мембраны грамотрицательных бактерий покрыта удивительно сложно устроенным липополисахаридом [107, 108]. Внещний слой липополисахарида представляет собой совокупность длинных вытянутых полисахаридных цепочек, состоящих из повторяющихся специфических единиц, обладающих антигенными свойствами и получивщих название 0-антигенов. К этим полисахаридам могут быть получены специфические антитела. Структура полисахаридов характеризуется больщим разнообразием — известно 1000 се-ротипов сальмонелл. Согласно существующей классификации, их разделяют на 17 основных групп. В группу ЕЗ, например, входят сероти-пы, которые состоят из повторяющихся единиц [c.391]

    Значительная информация об аминокислотных остатках, ответственных за связывание антигена, была получена методом афинной модификации [19]. Этот метод опирается на те же принципы, что и в случае фёрментов (см. разд. 23.3.10). Соединение, близкое по структуре антигену и несущее реакционноспособиую функциональную группу, может в принципе образовывать ковалентную связь с боковым радикалом аминокислоты, принадлежащей центру связывания. До сих пор этот метод не применялся в случае, если антиген представляет собой полисахарид или белок. При этом необходимо знание связывающейся на антителе части антигена, а также специфическое введение в этот участок реакционноспособной группировки. Вследствие этих затруднений современные исследования сконцентрировались на идентификации [c.565]

    Взаимодействие антиген—антитело, основанное на компле-ментарности определенных участков структуры антигена и белкового антитела, отличается чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. В области полисахаридов иммунологические реакции используются как для определения гомогенности и степени чистоты образца, так и для изучения структуры . [c.518]

    Полисахариды капсулы пневмококков Пневмококки — одна из немногих групп микроорганизмов, хорошо изученных в иммунохимиче-ском отношении. В настоящее время различают 75 антигенных типов пневмококков типовая специфичность связана с различиями в строении полисахаридов капсулы этих микроорганизмов. Специфические антипневмо-кокковые сыворотки получаются достаточно легко и широко применяются при установлении строения полисахаридов иммунохимическими методами . В частности, перекрестные реакции антипневмококковых сывороток с полисахаридами известного строения были использованы и для изучения строения некоторых полисахаридов капсулы пневмококков. [c.549]

    Гликолипиды и гликолипопротеины являются важными биополимерами некоторых микроорганизмов. Эти вещества обладают антигенными свойствами и, по-видимому, определяют серологическую характеристику микроорганизма. Так, в оболочках грамотрицательных бактерий имеется гликолипидный комплекс, обладающий свойствами антигена. Это вещество было выделено из Salmonella и осторожным гидролизом разделено на липидную часть и полисахарид. В настоящее время получены уже достаточно определенные сведения о строении этого полисахарида, природа липидной части и связи ее с полисахаридом еще не выяснена. Очевидно, в ближайшее время эти интересные и очень важные для характеристики биологических свойств микроорганизма вещества будут подробно изучены. [c.590]

    Другой хемотип — сложные высокоразветвленные соединения. Центральная цепь этих соединений не обязательно полисахаридной природы. Она может быть полипептидной, рибитфосфатной или состоять из смешанных полимеров. Определяющее значение для биологической функции имеют концевые олигосахаридные цепи, в состав которых обычно не входят уроновые кислоты или сульфоэфиры. Носителем отрицательных зарядов являются лишь остатки сиаловых кислот. Примерами таких соединений могут служить групповые вещества крови, муцин подчелюстной железы, 0-антиген грамотрицательных бактерий, полисахарид капсулы пневмококков типа XIV, декстраны. [c.609]

    Важную роль в защитных реакциях организмов играют гликопротеины плазмы крови [36]. Непосредственным участником защитной иммунной реакции в организме является так называемый комплемент , который, соединяясь с комплексом антиген— антитело, вызывает разрушение чужеродных клеток. Комплементарные системы играют защитную роль при воспалительных и аллергических реакциях биологичес(шх организмов. Они способны снижать гемолитическую активность при активации или ингибировании систем. К числу антикомплементарных полисахаридов относятся вещества, выделенные из китайской травы [67]. Два из них были экстрагированы горячей водой и оказались разветвленными арабиногалактанами, содержащими в разветвленной части макромолекулы остатки галактозы и арабинозы. [c.266]

chem21.info

Иммунологические реакции полисахаридов - Справочник химика 21

    Специфические иммунологические реакции полисахаридов [c.430]

    Несомненно, что и биологические функции, и механические свойства полисахаридов и углеводсодержащих биополимеров в большой мере определяются конформацией макромолекулы и распределением в ней реакционноспособных групп. Все эти факторы зависят, в конечном счете, от первичной структуры полимера. Поэтому понимание факторов, определяющих специфичность биологической функции углеводсодержащих соединений и технические свойства полисахаридов, зависит в первую очередь от развития теоретических представлений о связи между строением, конформацией, реакционной способностью и физико-химическими свойствами полисахаридов и смешанных биополимеров, содержащих олиго- и полисахаридные цепи. Установление этих связей является предпосылкой для осуществления направленного синтеза соответствующих физиологически активных веществ и направленной модификации полисахаридов для получения материалов с заранее заданными свойствами. Поэтому исключительно важной задачей является разработка надежных методов установления первичной структуры полисахаридных цепей, требующих минимальной затраты времени и минимального количества материала. Не менее важны эффективные подходы к точной характеристике конформаций полисахаридной цепи в целом и отдельных ее участков, вплоть до моносахаридных звеньев. Очевидна также необходимость изучения реакционной способности полисахаридной цепи, ее отдельных звеньев и различных функциональных групп, что позволит понять механизм взаимодействия углеводсодержащих биополимеров с их партнерами в биологических системах (например, с антителами при иммунологических реакциях), наметить целесообразный путь модификации природного полимера для придания ему нужных свойств и т. д. [c.625]

    Поскольку полисахариды могут быть получены из моносахаридов, каждый из которых связан с одним из четырех атомов углерода последующего моносахарида (если мы имеем дело с гексозами) посредством одной из двух (а- или -) форм глюкозидной связи, весьма большое число полисахаридов может быть получено из ограниченного числа моносахаридов, даже если они расположены в той же самой последовательности. Углеводные группы, играющие роль детерминантов в иммунологических реакциях, представляют значительный интерес в том отношении, что в от- [c.669]

    Вследствие крайней сложности белкового набора, синтезируемого клетками млекопитающих, изучение всей проблемы на молекулярном уровне требует много времени и часто приводит к неоднозначным результатам. Практически очень интересной кажется область иммунологических исследований изучается реакция многоклеточных систем на введение чужеродных тел-антигенов. Антигены — это, как правило, макромолекулы-белки или полисахариды попадая в организм, они вызывают образование особых плазматических клеток, синтезирующих антитела. Антитела, покинув клетку, вступают в контакт с антигеном. Антитела имеют в молекуле две точки одна специфична и в отношении химической природы, и в отношении пространственной конфигурации, а другая сходна у различных антител. Антитела соединяются с антигеном, и продукт реакции выводится из организма особыми клетками, поглощающими весь возникший комплекс антиген — антитело. Вероятно, появление антигена стимулирует образование плазматических клеток из каких-то предшественников и затем вызывает синтез специфической м-РНК, на которой и получается белок, рассчитанный на захват данного антигена. [c.214]

    Хотя в настоящий момент еще нет возможности удовлетворительно объяснить все явления, сопровождающие иммунизацию, можно, однако, предположить, что в основе этих явлений лежит реакция антигена с антителом. В некоторых случаях за этой реакцией следует вторая, а именно соединение комплекса антиген — антитело с комплементом. В настоящее время можно считать установленным, что преципитация, агглютинация, лизис и другие иммунологические явления представляют собой различные проявления действия одного и того же антитела. Так, например, антитела против полисахаридов пневмококков обладают способностью преципитировать эти полисахариды, агглютинировать и растворять клетки этих бактерий и усиливать их фагоцитоз [132]. Эти же самые антитела обладают способностью защищать человека и животных от инфекции вирулентными пневмококками [133, 134]. [c.349]

    Так как способность к перекрестной реакции зависит от структурного сходства полисахаридов, то иммунологическая реакция успешно применяется при структурных исследованиях. Так, Волфром (1947, 1952) выделил из легких крупного рогатого скота после удаления гепарина галактан и показал, что последний состоит в основном из D-галактозы. Гейдельбергер нашел (1955), что галактан, выделенный из легких, как и предполагалось, образует осадок с полисахаридом пневмококков типа XIV. Однако галактан давал также положительную реакцию преципитации и с полисахаридом пневмококков типа II, состоящим из L-рамнозы, /)-глюкозы и D-глюкуроновой кислоты. В дальнейшем при помощи бумажной хроматографии было показано, что галактан, выделенный Волфромом из легких крупного рогатого скота, неоднороден и загрязнен примесями, содержащими D-глюкуро-новую кислоту. [c.579]

    Полисахариды по всему своему химическому облику являются ти-пичными высокомолекулярными веществами, и именно это свойство, очевидно, должно быть принято за критерий, отделяющий типичные полисахариды от моио- и олигосахаридов. Полисахариды имеют исключительно большое значение. Они — один из важнейших типов природных биогенных поли.меров, участвующих в различных процессах жизнедеятельности. Их биологическое значение может быть сравнено со значением белков, хотя пока еще гораздо менее изучено. К полисахаридам ]1 их ближайшим производным относятся, например, такие важнейгиие в биологическом отношении типы соединений, как полисахариды плазмы крови, определяющие ее групповую принадлежность, полисахариды, определяющие специфичность иммунологических реакций, гликоген — полисахарид, являющийся главным углеводным резервом животного организма, гликопептиды, специфические полисахаридн микроорганизмов и т. д. и т. п. [c.151]

    Взаимодействие антиген—антитело, основанное на компле-ментарности определенных участков структуры антигена и белкового антитела, отличается чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. В области полисахаридов иммунологические реакции используются как для определения гомогенности и степени чистоты образца, так и для изучения структуры . [c.518]

    Иммунологически активные полисахариды. — Чужеродные белки (антигены), введенные в организм животного, стимулируют образование в крови веществ (антител), которые способны соединяться с антигенами. Е заимодействие антигенов с антителами может привести к образованию осадка (реакция преципитации). Так как такими чужеродными белками являются токсины или другие ядовитые выделения различных патогенных организмов, то, очевидно, реакция антиген— антитело представляет собой основу иммунитета к определенному виду инфекционного заболевания. Эта реакция в высокой степени специфична например, пневмококки принадлежат к одному из четырех серологических типов, и организмы, обладающие иммунитетом по отношению к одному из них, как правило, не иммунны к другому. [c.565]

    Мы будем интересоваться только одной стороной иммунологической реакции — синтезом -глобулина в организме животного. В стороне останутся многие важные вопросы этого явления. Так, мы не коснемся проблем химии иммунитета. В настоящее время известно множество химических соединений, главным образом ароматических и гетероциклических, которые, будучи химически присоединены к белкам посредством реакционноспособных функциональных групп, вызывают образование в организме животного специфических антител, настроенных на структуру им.енно тех соединений,- с помощью которых образованы антигены. Те соединения, которые способны образовывать с белками-носителями антигены, носят название гаптенов. Типичньши гаптенами являются полисахариды, входящие в состав оболочки бактерий. После образования антител к белкам, несущим на себе гаптенные группы, антитела могут реагировать уже не с исходными антигенами, а с чистыми гаптенами, т. е. с низкомоле-кулярными веществами. Гаптенные вещества, их химизм и специфичность — все это составляет существенную часть иммунологии, которо мы не будем касаться. Другой аспект иммунологии — физиологический. В число реакции иммунитета входят острые физиолюгические реакции организма как целого, нанример анафилактический шок, или сложные реакции ряда белков крови, [c.502]

    Имеющиеся в настоящее время сведения об иммунологических реакциях при лечении хлорамфениколом довольно ограниченны, но, по-видимому, можно заключить, что выработка организмом иммунитета в этом случае затруднена. По всей вероятности, образование агглютининов в крови снижается, хотя и незначительно. Уменьшается также содержание в крови у-глобулинов и возрастает содержание полисахаридов и липидов, связанных с альбуминовой и у-глобулиновой фракциями, Снижение образования антител при лечении хлорамфениколом, вероятно, вызвано как слишком кратковременным действием бактериального антигена, так и непосредственным угнетающим действием антибиотика на образование антител, В то же время антибиотик изменяет антигенные свойства некоторых микроорганизмов и уменьшает их устойчивость к антителам и к бактерицидному действию сыворотки крови. Этим, очевидно, можно в некоторых случаях объяснить повышен- [c.346]

chem21.info


Смотрите также