способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания. Антитела к хантавирусам


Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии. Способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках. Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность и специфичность обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявить предикторы тяжелого течения заболевания. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии.

Значительный прогресс в лабораторной диагностике ГЛПС наметился после внедрения различных вариантов иммуноферментного анализа с определением антител класса G и М. Эти методы позволяют определить общее количество антител без определения специфических антител к определенным компонентам хантавируса.

В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется диагностикум производства ИПиВЭ (г.Москва), позволяющий обнаружить антитела класса G к вирусу ГЛПС уже на первой неделе с начала заболевания в реакции непрямой иммунофлуоресценции (1). Однако в данном случае для подтверждения диагноза необходимо протестировать вторую сыворотку, отобранную через 5-7 дней после первой.

Прототипом нашего изобретения является иммуноблот анализ, используемый для выявления антител к различным компонентам вирусов, свободно циркулирующих в сыворотке крови, с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных мембран (НЦМ) (2).

Недостатком этого метода при диагностике геморрагической лихорадки является недостаточная специфичность.

Задачей изобретения является повышение эффективности обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявление предикторов тяжелого течения заболевания.

Поставленная задача достигается тем, что способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.

Способ осуществляется следующим образом.

Антигенный препарат хантавируса подвергают очистке и концентрированию при помощи изопикнического ультрацентрифугирования в 30% растворе калия бромида при 24000 об/мин в течение 20 часов при 20°С. После окончания центрифугирования содержимое отсасывают со дна пробирки при помощи перистальтического насоса через увикорд. Материал, содержащий максимальное поглощение при длине волны 280 нм, объединяют и проводят электрофоретическую разгонку в 5% растворе агарозы, содержащей 0,1% додецилсулфата натрия. Вырезают фрагменты агарозы, содержащие антиген, элюируют забуференным физраствором. Элюированный антиген подвергают диск-электрофорезу по Laemmli (3) для определения полипептидного состава антигенных препаратов хантавируса.

Электрофорез проводят при комнатной температуре при силе тока 7 мА/пластинка до внедрения белков в концентрирующий гель. Основной режим фракционирования - 30 мА/пластинка. Продолжительность электрофореза составляет 4-6 часов в зависимости от концентрации полиакриламидного геля (ПААГ).

Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ проводят, как после переноса белков на мембранные фильтры, так и непосредственно после электрофореза.

Белки после фракционирования фиксируют в водном растворе, содержащем 40% спирта (этанола или изопропанола-2) и 7% уксусной кислоты в течение суток. Фиксированный гель дважды промывают по 30 минут в дистиллированной воде при постоянном покачивании и проводят окрашивание 0,04% кумаси G-250 в 3,5% растворе хлорной кислоты в течение полутора часов. Затем гель погружают в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления от избытка красителя до полного обесцвечивания фона.

Также проводят дополнительное окрашивание с помощью азотнокислого серебра для выявления полисахаридов и повышения чувствительности окрашивания белковых зон с целью снижения фонового окрашивания и придания полученным дискретам черного цвета. Для этого гель выдерживают 3-е суток в дистиллированной воде при комнатной температуре с ежедневной сменой, далее воду сливают, гель перемешивают в растворе формалина (0,15 мкл на 350 мл h3O), выдерживают 30 минут при 37°С, дважды промывают дистиллированной водой по 20 минут, погружают в свежеприготовленный окрашивающий раствор на 15 минут (4 мл 20% водного раствора AgNO3), титруют раствором, содержащим 7,5 мл 0,36% NaOH и 3 мл 10% Nh5OH до полного исчезновения бурого осадка, объем раствора доводят до 100 мл дистиллированной водой, гель дважды промывают дистиллированной водой по 10 минут (350 мл на гель), погружают в проявляющий раствор, содержащий 2,5 мл 1% лимонной кислоты и 1 мл 37% раствора формалина. После появления черного окрашивания гель промывают два раза 5% раствором тиосульфата натрия. Окрашенный гель протоколируют при помощи оптического сканирования.

Для выявления антител класса IgG в сыворотке крови и в циркулирующих иммунных комплексах больных к хантавирусу инактивированный, лиофильно высушенный антигенный препарат хантавируса растворяют в лизирующей смеси, содержащей 1% додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола. Антигенный препарат кипятят 3 минуты в водяной бане и разгоняют в 12,5% полиакриламидном геле по Laemmli (3). По окончанию электрофореза гель выдерживают 30 минут в буфере для переноса (0,025М трис, 0,191М глицин, 20% метанол), собирают полусухой сендвич (semi-dry).

По окончанию электрофореза разделенный антигенный препарат переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (нм) в течение 45 минут при силе тока 100 мА. После окончания переноса антигена мембрану промывают последовательно дистиллированной водой, фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБТ), блок раствором, ФСБТ и высушивают. Далее мембрана нарезается на стрипы шириной 2-3 мм, которые помещают в специальные лоты-ванночки. В лоты вносят 2 мл ФСБТ, выдерживают 5 минут и вносят сыворотку в разведении 1:50 - 1:100. Инкубируют на шейкере 2 часа при комнатной температуре, затем промывают ФСБТ 4 раза по 1 минуте. Далее вносят конъюгат против антител класса IgG человека, меченный щелочной фосфатазой, инкубируют 1 час на шейкере. Затем промывают 4 раза ФСБТ по 1 минуте, вносят субстратный раствор, содержащий бром-хлор-индол-фосфат нитросиний тетрозоль (BCIP-NBT) и инкубируют 30 минут. Далее промывают дистиллированной водой 3 раза, высушивают, окрашенные стрипы приклеивают на бумагу, сканируют и денситометрируют. Учет результатов иммуноблотинга проводят при помощи оптического сканирования в отраженном свете на сканере SHARP JX-330 «Pharmacia Biotech» (Швеция).

Далее выделяются ЦИК из сыворотки крови, для этого используют 7%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярным весом 6000, который обеспечивает выделение двух фракций: «быстро» (18 часов-ЦИК-1) и «медленно» (72 часа-ЦИК-2) - преципитирующих ЦИК. Для этого сыворотки крови смешивают в соотношении 1:1 с 7%-ным раствором ПЭГ. Далее смесь инкубируют при +6 - +2°С в течение 18 и 72 часов. Преципитат осаждают центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и четырежды промывают десятикратным объемом 7%-ным раствором ПЭГ в 0,05М боратном буфере, рН 8,8. Далее препараты ЦИК диссоциируют температурным воздействием при +60°С в течение 3-х часов и проводят иммуноблот анализ для выявления антител класса IgG.

Нами проведены исследования динамики образования антител к хантавирусам и определение их диагностической значимости у больных ГЛПС при различных формах тяжести методом иммуноблот анализа.

Для выполнения поставленных задач было обследовано 226 больных ГЛПС. В зависимости от тяжести течения болезни все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 24 человека с легким течением болезни, вторую группу - 105 человек со среднетяжелым течением и третью группу - 97 человек с тяжелым течением.

Результаты исследований частоты выявления спектра хантавирусных антител класса IgG у больных ГЛПС методом иммуноблот анализа представлены в таблице 1.

Результаты анализа на наличие серологических маркеров хантавируса у больных различными формами тяжести ГЛПС показали, что частота выявления антител класса IgG к поверхностным белкам (молекулярной массы 58 кДа и 72 кДа) в сыворотке крови и в составе ЦИК-1 у наблюдаемых больных была 100%, носила стабильный характер и не зависела от тяжести инфекционного процесса (табл.1).

Антитела к нуклеокапсидному белку 45 кДа не были обнаружены ни в одной из тестируемых сывороток, как в свободном виде, так и в составе ЦИК-1.

Анализ выявления специфического спектра антител в составе ЦИК-2 показал, что доминирует по частоте выявление антител к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа, 72 кДа. Тем не менее, каких-либо корреляционных взаимосвязей частоты обнаружения антител и тяжести инфекционного процесса выявлено не было.

Наименьшая частота индикации антихантавирусных антител в ЦИК-2 была к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа. Максимальная частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа наблюдалась у больных тяжелой формой заболевания, которая составила 100%, начиная с лихорадочного периода.

У больных легкой формой антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа в лихорадочном периоде не определялись, в олигурическом периоде - лишь у 46,1% больных, в полиурическом - у 73,2%. У больных среднетяжелой формой заболевания частота их обнаружения была выше - 37,2%, 66,6% и 78,2% соответственно. Частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа у больных тяжелой формой заболевания была достоверно выше частоты выявления антител у больных легкой и среднетяжелой формами заболевания (р<0,01).

В результате проведенного иммуноблот анализа в циркулирующих иммунных комплексах у больных ГЛПС на ранних сроках заболевания обнаруживаются антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа только у больных тяжелой формой (100% случаев) и не обнаруживаются у больных с легким течением болезни.

Таким образом, выявление антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания позволяет диагностировать тяжелые формы болезни уже в самом начале болезни на ранних сроках.

Пример 1.

Больной К., 32 года. Диагноз: ГЛПС тяжелое течение. Поступил на 4-й день болезни с жалобами на лихорадку до 39 С°, головную боль, рвоту, нарушение зрения в виде «тумана» перед глазами, боли в поясничной области, снижение диуреза. В анализах крови: лейкоцитоз 15×109/л, тромбоцитопения, повышение мочевины - 25 ммоль/л, креатинин - 600 мкмоль/л.

Больному проводили исследование сыворотки на выявление антител класса IgG к хантавирусам в сыворотке крови и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Проводили электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса (фиг.1), определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, также антитела класса IgG определяли в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1 выявили антитела класса IgG к поверхностным белкам молекулярной массой 58кДа и 72 кДа. В составе ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к белкам массой 45 кДа, 58 кДа и 72 кДа. Выявление антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Наличие антител в составе ЦИК-2 к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания свидетельствовали о тяжелом течении болезни.

Пример 2.

Больная Ф. 27 лет. Поступила на 3 день болезни с жалобами на повышение температуры до 38 С°, головную боль, слабость. Уменьшение диуреза не отмечала. В анализах крови лейкоцитов - 6×109/л, тромбоцитов 190 тыс в мкл, мочевина - 6 ммоль/л, креатинин - 110 мкмоль/л.

Проведено исследование сыворотки крови на наличие антихантавирусных антител в сыворотке крови и в ЦИК методом иммуноблот анализа.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1, ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа и 72 кДа. Выявленние антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Отсутствие в составе ЦИК-2 антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа свидетельствовало о легком течении болезни.

Список использованной литературы

1. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики) / Р.Ш.Магазов (под ред. Акад. АН РБ Магазова Р.Ш.). - Уфа, Изд-во «Гилем», 2006. - 250 с.

2. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П.Иванов // Вопр. вирусол. - 1996. - №6. - С.236-265.

3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage / U.K. Laemmli // - Nature. London. - 1970, T4. V.227, pp.680-685.

1. Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом, включающий электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, отличающийся тем, что антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.

www.findpatent.ru

Хантавирусы - Инфекции

В июне 1993 г. недавно открытый хантавирус был определен как этиологический агент, вызвавший вспышку тяжелого респираторного заболевания на юго-западе США.

В настоящее время данное заболевание называется хантавирусным легочным синдромом. Зарегистрированы сот­ни случаев, вызванных близкородственными хантавирусами. Заболевание характеризуется лихорадочным продромальным периодом, вслед за которым быстро развивается некардиогенный отек легких и артериальная гипо­тония или шок. Более 50% больных хантавирусным легочным синдромом умерло.

Этиология

Хантавирусы — это род, входящий в семейство буньявирусов. Хантавирусы облада­ют суперкапсидом и содержат минус-цепь РНК, состоящую из трех уникальных сегментов. Вну­три рода выделено несколько патогенных вирусов, в том числе вирус Хантаан, вызывающий наи­более тяжелую геморрагическую лихорадку с почечным синдромом, встречающуюся преимуще­ственно на материковой части Азии; вирус Дубра­ва; вирус Пуумала, вирус Сеул. Широко распространен хантавирус Проспект-Хилл, который разносится серыми полевками, но у человека заболевания, вы­званные данным вирусом, не описаны.

Случаи хантавирусного легочного синдрома, выявленные в 1993 г., были вызваны вирусом Син- Номбр ,выделенным в Нью-Мексико от оленьего хомячка. Множество воз­будителей хантавирусного легочного синдрома, известных к настоящему времени, принадлежит к одной генетической группе хантавирусов и связа­но с грызунами. Места обитания данных грызунов ограничены американским континентом, поэтому хантавирусный легочный синдром считается бо­лезнью Западного полушария.

Эпидемиология

Обычно в анамнезе больных имеется недавний контакт на открытом воздухе с оленьими хомячками или проживание в местности, где обитает множество упомянутых грызунов. Груп­повые случаи хантавирусного легочного синдрома наблюдаются среди рабочих, которые очищают за­раженные грызунами дома. Примерно 50% случаев заболевания при­ходится на период с мая по июль. Почти все боль­ные — люди от 12 до 70 лет, 60% из них в возрасте 20-39 лет. У детей до 12 лет случаи заболевания ре­гистрируются редко. 2/з больных — мужчины, что, вероятно, отражает их более активную деятельность на свежем воздухе. Чем обусловлено почти полное отсутствие случаев заболевания среди детей млад­шего возраста — врожденной невосприимчивостью или отсутствием контакта с возбудителем — неиз­вестно. Во время вспышек в Аргентине удалось до­казать передачу инфекции от человека.

У своих животных-резервуаров хантавирусы вызывают пожизненную бессимптомную инфек­цию. Зараженные животные могут выделять ви­рус со слюной, мочой и калом в течение многих недель, однако продолжительность выделения и период максимальной заразности остаются не­известными. Присутствие вируса в слюне, чувстви­тельность данных животных к парентеральному заражению хантавирусами и полевые наблюдения за зараженными грызунами указывают на то, что важный механизм распространения вируса среди грызунов — укусы. В заражении человека участву­ют аэрозоли, образовавшиеся из слюны или выде­лений грызунов. Люди, посещавшие места ухода за животными, где находили приют грызуны, заража­лись после контактов, длившихся не менее 5 мин. Возможно, хантавирусы распространяются через загрязненную пищу и раны кожи или слизистых оболочек; передача людям происходила при уку­сах грызунов. Передача хантавируса от человека к человеку встречается чрезвычайно редко, однако зафиксирована в Аргентине.

Симптомы

В хантавирусном легочном синдроме выделяют продромальную и сердечно-легочную стадии. В среднем от появ­ления продромальных симптомов до госпитали­зации проходит 5,4 сут. Средняя продолжитель­ность времени от появления симптомов до смерти 8 сут (медиана 7 сут, пределы колебаний 2-16 сут). В продромальный период чаще всего встречаются лихорадка и миалгия (100%), кашель или одышка (76%), желудочно-кишечные расстройства, вклю­чающие рвоту, диарею и боль в средней части жи­вота (76%), головная боль (71 %). Сердечно-легоч­ная стадия манифестирует нарастающим кашлем и одышкой. При физикальном обследовании в этот период чаще всего обнаруживается учащенное ды­хание (100%), тахикардия (94%) и артериальная гипотония (50%). При наиболее тяжелом течении быстро развивается острый отек легких, гипоксия и шок. В летальных случаях отек легких сопро­вождался тяжелой гипотонией, часто приводящей к синусовой брадикардии, электромеханической диссоциации, желудочковой тахикардии или фи­брилляции. Артериальная гипотония может усугу­бляться даже при адекватном лечении.

Диагностика

Хантавирусный легочный синд­ром следует предполагать у ранее здорового чело­века, у которого после периода лихорадки разви­лась острая дыхательная недостаточность. С вы­сокой вероятностью на хантавирусы указывает тромбоцитопения в сочетании с лихорадочным продромальным периодом и кон­тактом с дикими грызунами в весенние или летние месяцы. Для подтверждения диагноза определяют антитела к хантавирусам класса М. Хантавирус­ный антиген можно выявить в тканях с помощью иммуногистохимического исследования или ам­плификации нуклеотидной последовательности хантавируса методом ПЦР с обратной транскрип­цией. Помощь в диагностике, эпидемиологических исследованиях и сдерживании вспышки можно по­лучить в департаменте здравоохранения.

Лечение

Необходимо обеспечить достаточную оксигенацию, а также поддерживать функцию сер­дечно-сосудистой системы. Патофизиология хантавирусного легочного синдрома сходна с таковой шока при лихорадке денге. Для лече­ния артериальной гипотонии с клиническими про­явлениями следует использовать вазопрессорные или инотропные средства в сочетании с внутривен­ным введением разумных объемов жидкости, чтобы не усугубить отек легких. Рибавирин, раннее вну­тривенное введение которого при геморрагической лихорадке с почечным синдромом порой спасает жизнь, при хантавирусном легочном синдроме бес­полезен.

Прогноз

Летальность составляет около 50%. Высокоспецифичными и чувствительными про­гностическими факторами летального исхода слу­жат резкие отклонения гематокрита, содержания лейкоцитов, ЛДГ и АЧТВ.

Профилактика

Единственный путь профилактики заражения хантавирусами — избегать контакта с грызунами. Важное значение имеет борьба с грызунами в жилище и вблизи него. Поскольку при работе с кровью, другими био­жидкостями и тканями больных людей и животных возможно образование вируссодержащего аэрозоля, в лаборатории должен быть обеспечен второй уро­вень биологической защиты. Больных необходимо изолировать.

surgeryzone.net

способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания - патент РФ 2484478

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии. Способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках. Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность и специфичность обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявить предикторы тяжелого течения заболевания. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Рисунки к патенту РФ 2484478

способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания, патент № 2484478

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии.

Значительный прогресс в лабораторной диагностике ГЛПС наметился после внедрения различных вариантов иммуноферментного анализа с определением антител класса G и М. Эти методы позволяют определить общее количество антител без определения специфических антител к определенным компонентам хантавируса.

В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется диагностикум производства ИПиВЭ (г.Москва), позволяющий обнаружить антитела класса G к вирусу ГЛПС уже на первой неделе с начала заболевания в реакции непрямой иммунофлуоресценции (1). Однако в данном случае для подтверждения диагноза необходимо протестировать вторую сыворотку, отобранную через 5-7 дней после первой.

Прототипом нашего изобретения является иммуноблот анализ, используемый для выявления антител к различным компонентам вирусов, свободно циркулирующих в сыворотке крови, с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных мембран (НЦМ) (2).

Недостатком этого метода при диагностике геморрагической лихорадки является недостаточная специфичность.

Задачей изобретения является повышение эффективности обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявление предикторов тяжелого течения заболевания.

Поставленная задача достигается тем, что способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.

Способ осуществляется следующим образом.

Антигенный препарат хантавируса подвергают очистке и концентрированию при помощи изопикнического ультрацентрифугирования в 30% растворе калия бромида при 24000 об/мин в течение 20 часов при 20°С. После окончания центрифугирования содержимое отсасывают со дна пробирки при помощи перистальтического насоса через увикорд. Материал, содержащий максимальное поглощение при длине волны 280 нм, объединяют и проводят электрофоретическую разгонку в 5% растворе агарозы, содержащей 0,1% додецилсулфата натрия. Вырезают фрагменты агарозы, содержащие антиген, элюируют забуференным физраствором. Элюированный антиген подвергают диск-электрофорезу по Laemmli (3) для определения полипептидного состава антигенных препаратов хантавируса.

Электрофорез проводят при комнатной температуре при силе тока 7 мА/пластинка до внедрения белков в концентрирующий гель. Основной режим фракционирования - 30 мА/пластинка. Продолжительность электрофореза составляет 4-6 часов в зависимости от концентрации полиакриламидного геля (ПААГ).

Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ проводят, как после переноса белков на мембранные фильтры, так и непосредственно после электрофореза.

Белки после фракционирования фиксируют в водном растворе, содержащем 40% спирта (этанола или изопропанола-2) и 7% уксусной кислоты в течение суток. Фиксированный гель дважды промывают по 30 минут в дистиллированной воде при постоянном покачивании и проводят окрашивание 0,04% кумаси G-250 в 3,5% растворе хлорной кислоты в течение полутора часов. Затем гель погружают в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления от избытка красителя до полного обесцвечивания фона.

Также проводят дополнительное окрашивание с помощью азотнокислого серебра для выявления полисахаридов и повышения чувствительности окрашивания белковых зон с целью снижения фонового окрашивания и придания полученным дискретам черного цвета. Для этого гель выдерживают 3-е суток в дистиллированной воде при комнатной температуре с ежедневной сменой, далее воду сливают, гель перемешивают в растворе формалина (0,15 мкл на 350 мл h3O), выдерживают 30 минут при 37°С, дважды промывают дистиллированной водой по 20 минут, погружают в свежеприготовленный окрашивающий раствор на 15 минут (4 мл 20% водного раствора AgNO3), титруют раствором, содержащим 7,5 мл 0,36% NaOH и 3 мл 10% Nh5 OH до полного исчезновения бурого осадка, объем раствора доводят до 100 мл дистиллированной водой, гель дважды промывают дистиллированной водой по 10 минут (350 мл на гель), погружают в проявляющий раствор, содержащий 2,5 мл 1% лимонной кислоты и 1 мл 37% раствора формалина. После появления черного окрашивания гель промывают два раза 5% раствором тиосульфата натрия. Окрашенный гель протоколируют при помощи оптического сканирования.

Для выявления антител класса IgG в сыворотке крови и в циркулирующих иммунных комплексах больных к хантавирусу инактивированный, лиофильно высушенный антигенный препарат хантавируса растворяют в лизирующей смеси, содержащей 1% додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола. Антигенный препарат кипятят 3 минуты в водяной бане и разгоняют в 12,5% полиакриламидном геле по Laemmli (3). По окончанию электрофореза гель выдерживают 30 минут в буфере для переноса (0,025М трис, 0,191М глицин, 20% метанол), собирают полусухой сендвич (semi-dry).

По окончанию электрофореза разделенный антигенный препарат переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (нм) в течение 45 минут при силе тока 100 мА. После окончания переноса антигена мембрану промывают последовательно дистиллированной водой, фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБТ), блок раствором, ФСБТ и высушивают. Далее мембрана нарезается на стрипы шириной 2-3 мм, которые помещают в специальные лоты-ванночки. В лоты вносят 2 мл ФСБТ, выдерживают 5 минут и вносят сыворотку в разведении 1:50 - 1:100. Инкубируют на шейкере 2 часа при комнатной температуре, затем промывают ФСБТ 4 раза по 1 минуте. Далее вносят конъюгат против антител класса IgG человека, меченный щелочной фосфатазой, инкубируют 1 час на шейкере. Затем промывают 4 раза ФСБТ по 1 минуте, вносят субстратный раствор, содержащий бром-хлор-индол-фосфат нитросиний тетрозоль (BCIP-NBT) и инкубируют 30 минут. Далее промывают дистиллированной водой 3 раза, высушивают, окрашенные стрипы приклеивают на бумагу, сканируют и денситометрируют. Учет результатов иммуноблотинга проводят при помощи оптического сканирования в отраженном свете на сканере SHARP JX-330 «Pharmacia Biotech» (Швеция).

Далее выделяются ЦИК из сыворотки крови, для этого используют 7%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярным весом 6000, который обеспечивает выделение двух фракций: «быстро» (18 часов-ЦИК-1) и «медленно» (72 часа-ЦИК-2) - преципитирующих ЦИК. Для этого сыворотки крови смешивают в соотношении 1:1 с 7%-ным раствором ПЭГ. Далее смесь инкубируют при +6 - +2°С в течение 18 и 72 часов. Преципитат осаждают центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и четырежды промывают десятикратным объемом 7%-ным раствором ПЭГ в 0,05М боратном буфере, рН 8,8. Далее препараты ЦИК диссоциируют температурным воздействием при +60°С в течение 3-х часов и проводят иммуноблот анализ для выявления антител класса IgG.

Нами проведены исследования динамики образования антител к хантавирусам и определение их диагностической значимости у больных ГЛПС при различных формах тяжести методом иммуноблот анализа.

Для выполнения поставленных задач было обследовано 226 больных ГЛПС. В зависимости от тяжести течения болезни все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 24 человека с легким течением болезни, вторую группу - 105 человек со среднетяжелым течением и третью группу - 97 человек с тяжелым течением.

Результаты исследований частоты выявления спектра хантавирусных антител класса IgG у больных ГЛПС методом иммуноблот анализа представлены в таблице 1.

Результаты анализа на наличие серологических маркеров хантавируса у больных различными формами тяжести ГЛПС показали, что частота выявления антител класса IgG к поверхностным белкам (молекулярной массы 58 кДа и 72 кДа) в сыворотке крови и в составе ЦИК-1 у наблюдаемых больных была 100%, носила стабильный характер и не зависела от тяжести инфекционного процесса (табл.1).

Антитела к нуклеокапсидному белку 45 кДа не были обнаружены ни в одной из тестируемых сывороток, как в свободном виде, так и в составе ЦИК-1.

Анализ выявления специфического спектра антител в составе ЦИК-2 показал, что доминирует по частоте выявление антител к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа, 72 кДа. Тем не менее, каких-либо корреляционных взаимосвязей частоты обнаружения антител и тяжести инфекционного процесса выявлено не было.

Наименьшая частота индикации антихантавирусных антител в ЦИК-2 была к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа. Максимальная частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа наблюдалась у больных тяжелой формой заболевания, которая составила 100%, начиная с лихорадочного периода.

У больных легкой формой антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа в лихорадочном периоде не определялись, в олигурическом периоде - лишь у 46,1% больных, в полиурическом - у 73,2%. У больных среднетяжелой формой заболевания частота их обнаружения была выше - 37,2%, 66,6% и 78,2% соответственно. Частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа у больных тяжелой формой заболевания была достоверно выше частоты выявления антител у больных легкой и среднетяжелой формами заболевания (р<0,01).

В результате проведенного иммуноблот анализа в циркулирующих иммунных комплексах у больных ГЛПС на ранних сроках заболевания обнаруживаются антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа только у больных тяжелой формой (100% случаев) и не обнаруживаются у больных с легким течением болезни.

Таким образом, выявление антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания позволяет диагностировать тяжелые формы болезни уже в самом начале болезни на ранних сроках.

Пример 1.

Больной К., 32 года. Диагноз: ГЛПС тяжелое течение. Поступил на 4-й день болезни с жалобами на лихорадку до 39 С°, головную боль, рвоту, нарушение зрения в виде «тумана» перед глазами, боли в поясничной области, снижение диуреза. В анализах крови: лейкоцитоз 15×109/л, тромбоцитопения, повышение мочевины - 25 ммоль/л, креатинин - 600 мкмоль/л.

Больному проводили исследование сыворотки на выявление антител класса IgG к хантавирусам в сыворотке крови и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Проводили электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса (фиг.1), определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, также антитела класса IgG определяли в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1 выявили антитела класса IgG к поверхностным белкам молекулярной массой 58кДа и 72 кДа. В составе ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к белкам массой 45 кДа, 58 кДа и 72 кДа. Выявление антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Наличие антител в составе ЦИК-2 к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания свидетельствовали о тяжелом течении болезни.

Пример 2.

Больная Ф. 27 лет. Поступила на 3 день болезни с жалобами на повышение температуры до 38 С°, головную боль, слабость. Уменьшение диуреза не отмечала. В анализах крови лейкоцитов - 6×109/л, тромбоцитов 190 тыс в мкл, мочевина - 6 ммоль/л, креатинин - 110 мкмоль/л.

Проведено исследование сыворотки крови на наличие антихантавирусных антител в сыворотке крови и в ЦИК методом иммуноблот анализа.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1, ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа и 72 кДа. Выявленние антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Отсутствие в составе ЦИК-2 антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа свидетельствовало о легком течении болезни.

способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания, патент № 2484478

Список использованной литературы

1. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики) / Р.Ш.Магазов (под ред. Акад. АН РБ Магазова Р.Ш.). - Уфа, Изд-во «Гилем», 2006. - 250 с.

2. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П.Иванов // Вопр. вирусол. - 1996. - № 6. - С.236-265.

3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage / U.K. Laemmli // - Nature. London. - 1970, T4. V.227, pp.680-685.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом, включающий электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, отличающийся тем, что антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.

www.freepatent.ru

Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии. Способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках. Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность и специфичность обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявить предикторы тяжелого течения заболевания. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии.

Значительный прогресс в лабораторной диагностике ГЛПС наметился после внедрения различных вариантов иммуноферментного анализа с определением антител класса G и М. Эти методы позволяют определить общее количество антител без определения специфических антител к определенным компонентам хантавируса.

В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется диагностикум производства ИПиВЭ (г.Москва), позволяющий обнаружить антитела класса G к вирусу ГЛПС уже на первой неделе с начала заболевания в реакции непрямой иммунофлуоресценции (1). Однако в данном случае для подтверждения диагноза необходимо протестировать вторую сыворотку, отобранную через 5-7 дней после первой.

Прототипом нашего изобретения является иммуноблот анализ, используемый для выявления антител к различным компонентам вирусов, свободно циркулирующих в сыворотке крови, с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных мембран (НЦМ) (2).

Недостатком этого метода при диагностике геморрагической лихорадки является недостаточная специфичность.

Задачей изобретения является повышение эффективности обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявление предикторов тяжелого течения заболевания.

Поставленная задача достигается тем, что способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.

Способ осуществляется следующим образом.

Антигенный препарат хантавируса подвергают очистке и концентрированию при помощи изопикнического ультрацентрифугирования в 30% растворе калия бромида при 24000 об/мин в течение 20 часов при 20°С. После окончания центрифугирования содержимое отсасывают со дна пробирки при помощи перистальтического насоса через увикорд. Материал, содержащий максимальное поглощение при длине волны 280 нм, объединяют и проводят электрофоретическую разгонку в 5% растворе агарозы, содержащей 0,1% додецилсулфата натрия. Вырезают фрагменты агарозы, содержащие антиген, элюируют забуференным физраствором. Элюированный антиген подвергают диск-электрофорезу по Laemmli (3) для определения полипептидного состава антигенных препаратов хантавируса.

Электрофорез проводят при комнатной температуре при силе тока 7 мА/пластинка до внедрения белков в концентрирующий гель. Основной режим фракционирования - 30 мА/пластинка. Продолжительность электрофореза составляет 4-6 часов в зависимости от концентрации полиакриламидного геля (ПААГ).

Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ проводят, как после переноса белков на мембранные фильтры, так и непосредственно после электрофореза.

Белки после фракционирования фиксируют в водном растворе, содержащем 40% спирта (этанола или изопропанола-2) и 7% уксусной кислоты в течение суток. Фиксированный гель дважды промывают по 30 минут в дистиллированной воде при постоянном покачивании и проводят окрашивание 0,04% кумаси G-250 в 3,5% растворе хлорной кислоты в течение полутора часов. Затем гель погружают в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления от избытка красителя до полного обесцвечивания фона.

Также проводят дополнительное окрашивание с помощью азотнокислого серебра для выявления полисахаридов и повышения чувствительности окрашивания белковых зон с целью снижения фонового окрашивания и придания полученным дискретам черного цвета. Для этого гель выдерживают 3-е суток в дистиллированной воде при комнатной температуре с ежедневной сменой, далее воду сливают, гель перемешивают в растворе формалина (0,15 мкл на 350 мл h3O), выдерживают 30 минут при 37°С, дважды промывают дистиллированной водой по 20 минут, погружают в свежеприготовленный окрашивающий раствор на 15 минут (4 мл 20% водного раствора AgNO3), титруют раствором, содержащим 7,5 мл 0,36% NaOH и 3 мл 10% Nh5OH до полного исчезновения бурого осадка, объем раствора доводят до 100 мл дистиллированной водой, гель дважды промывают дистиллированной водой по 10 минут (350 мл на гель), погружают в проявляющий раствор, содержащий 2,5 мл 1% лимонной кислоты и 1 мл 37% раствора формалина. После появления черного окрашивания гель промывают два раза 5% раствором тиосульфата натрия. Окрашенный гель протоколируют при помощи оптического сканирования.

Для выявления антител класса IgG в сыворотке крови и в циркулирующих иммунных комплексах больных к хантавирусу инактивированный, лиофильно высушенный антигенный препарат хантавируса растворяют в лизирующей смеси, содержащей 1% додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола. Антигенный препарат кипятят 3 минуты в водяной бане и разгоняют в 12,5% полиакриламидном геле по Laemmli (3). По окончанию электрофореза гель выдерживают 30 минут в буфере для переноса (0,025М трис, 0,191М глицин, 20% метанол), собирают полусухой сендвич (semi-dry).

По окончанию электрофореза разделенный антигенный препарат переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (нм) в течение 45 минут при силе тока 100 мА. После окончания переноса антигена мембрану промывают последовательно дистиллированной водой, фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБТ), блок раствором, ФСБТ и высушивают. Далее мембрана нарезается на стрипы шириной 2-3 мм, которые помещают в специальные лоты-ванночки. В лоты вносят 2 мл ФСБТ, выдерживают 5 минут и вносят сыворотку в разведении 1:50 - 1:100. Инкубируют на шейкере 2 часа при комнатной температуре, затем промывают ФСБТ 4 раза по 1 минуте. Далее вносят конъюгат против антител класса IgG человека, меченный щелочной фосфатазой, инкубируют 1 час на шейкере. Затем промывают 4 раза ФСБТ по 1 минуте, вносят субстратный раствор, содержащий бром-хлор-индол-фосфат нитросиний тетрозоль (BCIP-NBT) и инкубируют 30 минут. Далее промывают дистиллированной водой 3 раза, высушивают, окрашенные стрипы приклеивают на бумагу, сканируют и денситометрируют. Учет результатов иммуноблотинга проводят при помощи оптического сканирования в отраженном свете на сканере SHARP JX-330 «Pharmacia Biotech» (Швеция).

Далее выделяются ЦИК из сыворотки крови, для этого используют 7%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярным весом 6000, который обеспечивает выделение двух фракций: «быстро» (18 часов-ЦИК-1) и «медленно» (72 часа-ЦИК-2) - преципитирующих ЦИК. Для этого сыворотки крови смешивают в соотношении 1:1 с 7%-ным раствором ПЭГ. Далее смесь инкубируют при +6 - +2°С в течение 18 и 72 часов. Преципитат осаждают центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и четырежды промывают десятикратным объемом 7%-ным раствором ПЭГ в 0,05М боратном буфере, рН 8,8. Далее препараты ЦИК диссоциируют температурным воздействием при +60°С в течение 3-х часов и проводят иммуноблот анализ для выявления антител класса IgG.

Нами проведены исследования динамики образования антител к хантавирусам и определение их диагностической значимости у больных ГЛПС при различных формах тяжести методом иммуноблот анализа.

Для выполнения поставленных задач было обследовано 226 больных ГЛПС. В зависимости от тяжести течения болезни все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 24 человека с легким течением болезни, вторую группу - 105 человек со среднетяжелым течением и третью группу - 97 человек с тяжелым течением.

Результаты исследований частоты выявления спектра хантавирусных антител класса IgG у больных ГЛПС методом иммуноблот анализа представлены в таблице 1.

Результаты анализа на наличие серологических маркеров хантавируса у больных различными формами тяжести ГЛПС показали, что частота выявления антител класса IgG к поверхностным белкам (молекулярной массы 58 кДа и 72 кДа) в сыворотке крови и в составе ЦИК-1 у наблюдаемых больных была 100%, носила стабильный характер и не зависела от тяжести инфекционного процесса (табл.1).

Антитела к нуклеокапсидному белку 45 кДа не были обнаружены ни в одной из тестируемых сывороток, как в свободном виде, так и в составе ЦИК-1.

Анализ выявления специфического спектра антител в составе ЦИК-2 показал, что доминирует по частоте выявление антител к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа, 72 кДа. Тем не менее, каких-либо корреляционных взаимосвязей частоты обнаружения антител и тяжести инфекционного процесса выявлено не было.

Наименьшая частота индикации антихантавирусных антител в ЦИК-2 была к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа. Максимальная частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа наблюдалась у больных тяжелой формой заболевания, которая составила 100%, начиная с лихорадочного периода.

У больных легкой формой антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа в лихорадочном периоде не определялись, в олигурическом периоде - лишь у 46,1% больных, в полиурическом - у 73,2%. У больных среднетяжелой формой заболевания частота их обнаружения была выше - 37,2%, 66,6% и 78,2% соответственно. Частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа у больных тяжелой формой заболевания была достоверно выше частоты выявления антител у больных легкой и среднетяжелой формами заболевания (р<0,01).

В результате проведенного иммуноблот анализа в циркулирующих иммунных комплексах у больных ГЛПС на ранних сроках заболевания обнаруживаются антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа только у больных тяжелой формой (100% случаев) и не обнаруживаются у больных с легким течением болезни.

Таким образом, выявление антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания позволяет диагностировать тяжелые формы болезни уже в самом начале болезни на ранних сроках.

Пример 1.

Больной К., 32 года. Диагноз: ГЛПС тяжелое течение. Поступил на 4-й день болезни с жалобами на лихорадку до 39 С°, головную боль, рвоту, нарушение зрения в виде «тумана» перед глазами, боли в поясничной области, снижение диуреза. В анализах крови: лейкоцитоз 15×109/л, тромбоцитопения, повышение мочевины - 25 ммоль/л, креатинин - 600 мкмоль/л.

Больному проводили исследование сыворотки на выявление антител класса IgG к хантавирусам в сыворотке крови и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Проводили электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса (фиг.1), определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, также антитела класса IgG определяли в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1 выявили антитела класса IgG к поверхностным белкам молекулярной массой 58кДа и 72 кДа. В составе ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к белкам массой 45 кДа, 58 кДа и 72 кДа. Выявление антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Наличие антител в составе ЦИК-2 к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания свидетельствовали о тяжелом течении болезни.

Пример 2.

Больная Ф. 27 лет. Поступила на 3 день болезни с жалобами на повышение температуры до 38 С°, головную боль, слабость. Уменьшение диуреза не отмечала. В анализах крови лейкоцитов - 6×109/л, тромбоцитов 190 тыс в мкл, мочевина - 6 ммоль/л, креатинин - 110 мкмоль/л.

Проведено исследование сыворотки крови на наличие антихантавирусных антител в сыворотке крови и в ЦИК методом иммуноблот анализа.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1, ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа и 72 кДа. Выявленние антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Отсутствие в составе ЦИК-2 антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа свидетельствовало о легком течении болезни.

Список использованной литературы

1. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики) / Р.Ш.Магазов (под ред. Акад. АН РБ Магазова Р.Ш.). - Уфа, Изд-во «Гилем», 2006. - 250 с.

2. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П.Иванов // Вопр. вирусол. - 1996. - №6. - С.236-265.

3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage / U.K. Laemmli // - Nature. London. - 1970, T4. V.227, pp.680-685.

Формула изобретения

1. Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом, включающий электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, отличающийся тем, что антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.

bankpatentov.ru

Monitoring of the activity of antibodies against hantavirus in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome | Shakirova

Abstract

Aim. To determine the diagnostic significance of antibodies to Hantavirus in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome, depending on the period and the severity of the course of disease. Methods. Studied was the content of specific antibodies (immunoglobulins G) to hantaviruses in blood serum in the rapidly precipitating and slowly precipitating circulating immune complexes by enzyme immunoassay using a test system «Hantagnost» in modification. Studied were 226 patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (24 patients with mild form, 105 with moderate and 97 patients with severe form of the disease) in the febrile, oliguric and polyuric periods. Results. Specific antibodies (immunoglobulins G) were present already in the febrile period of the disease in all (100%) patients in the serum and in the rapidly precipitating circulating immune complexes. Antibodies in the slowly precipitating complexes in the febrile period were found only in patients with severe and moderate forms of hemorrhagic fever with renal syndrome, in subsequent periods they were found significantly more frequently in patients with a severe course of disease. Severe forms of hemorrhagic fever with renal syndrome caused the most pronounced serologic response with a maximal content of immunoglobulins G to Hantaviruses in the oliguric period. During the period of polyuria the severe forms of hemorrhagic fever with renal syndrome were accompanied by significantly lower levels of free circulating antibodies and a high level of bound antibodies compared with moderate and mild forms of the disease. Conclusion. In patients with hemorrhagic fever with renal syndrome anti-Hantavirus antibodies (immunoglobulins G) in serum and in the rapidly precipitating immune complexes are detected already at the early stages of the disease in 100% of the cases; the frequency of detection of antibodies in the slowly precipitating circulating immune complexes in the early stages depends on the severity of disease: they are present in 100% of patients with a severe form of the disease, in 50% - with the moderate form, and with the mild form - can not be detected.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - одно из распространённых природно-очаговых заболеваний. Заболеваемость неуклонно растёт, поражая людей молодого, трудоспособного возраста, что наносит значительный экономический и социальный ущерб. Течение ГЛПС характеризуется большим разнообразием клинических проявлений, поражением многих органов и систем. В связи с этим своевременная диагностика ГЛПС зачастую затруднена, что приводит к диагностическим ошибкам, а следовательно, к поздней госпитализации больных и ухудшению прогноза болезни. Всё это свидетельствует о необходимости разработки новых подходов к специфической диагностике для оценки степени тяжести и прогнозирования течения заболевания. Известно, что ГЛПС сопровождается интенсивным синтезом антител против антигенов хантавируса и образованием иммунных комплексов [4, 5]. Несомненно, иммунные комплексы играют важную роль в патогенезе ГЛПС, особенно при тяжёлом течении заболевания. Существенным фактором повреждения эндотелия сосудов считают циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), оседающие на цитоплазматических мембранах с последующим развитием деструктивного иммунокомплексного панваскулита [5]. Нередко специфические осложнения при ГЛПС в виде формирования почечной недостаточности и хронической патологии у реконвалесцентов оказываются патогенетически связанными с формированием иммунных комплексов [3]. Качественный и количественный состав ЦИК во многом определяет характер и исход иммунологического разрешения ГЛПС. Достоверность обнаружения вирус-специфических антител может быть существенно повышена только при их параллельном выявлении в свободном и связанном виде в ЦИК, потому что не всегда существует корреляция между содержанием свободных и связанных в ЦИК антихантавирусных антител. Однако в доступной литературе мы не нашли работ по изучению специфических антихантавирусных антител в составе ЦИК. Целью настоящего исследования было изучение динамики образования антител к хантавирусам и определение их диагностической значимости у больных ГЛПС различной степени тяжести. В течение 2006-2009 гг. были обследованы 226 больных ГЛПС. В зависимости от тяжести течения болезни все больные были разделены на три группы: первую составили 24 человека с лёгким течением болезни, вторую - 105 человек со среднетяжёлым течением, третью - 97 человек с тяжёлым течением ГЛПС (табл. 1). В контрольную группу вошли 53 практически здоровых человека (добровольные доноры), в анамнезе у которых не было указаний на перенесённую ГЛПС. Достоверных различий по возрасту в группах не было. ГЛПС диагностировали на основании общепринятых клинических, эпидемиологических, лабораторных и инструментальных данных, для верификации диагноза проводили реакцию непрямой иммунофлюоресценции в парных сыворотках. Тяжесть течения ГЛПС оценивали по следующим критериям: лёгкое течение - лихорадка до 38 °С, олигурия до 900 мл/сут, микропротеинурия, микрогематурия, нормальное содержание мочевины плазмы крови, повышение концентрации креатинина до 130 мкмоль/л; среднетяжёлое течение - лихорадка до 39,5 °С, головная боль, частая рвота, интенсивная боль в области поясницы, боли в животе, геморрагическая сыпь, олигурия до 300 мл/сут, концентрация мочевины в плазме крови до 18 ммоль/л, креатинина - до 300 мкмоль/л; тяжёлое течение - осложнения в виде инфекционно-токсического шока и острой сосудистой недостаточности, геморрагический синдром, олигурия менее 300 мл/сут или анурия, концентрация мочевины в плазме крови свыше 18,5 ммоль/л, креатинина - более 300 мкмоль/л (Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я., 2009). Для определения иммуноглобулинов G (IgG) к хантавирусу в сыворотке крови использовали иммуноферментную тест-систему «Хантагност» (производство Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН). С целью оптимизации метода получения ЦИК из сывороток крови использовали 7% полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 (ПЭГ-6000 Serva) для определения содержания ЦИК различной молекулярной массы по оптической плотности [1]. При диск-электрофорезе в полиакриламидном геле с 7% раствором полиэтиленгликоля выделено две фракции: быстро преципитирующие (18 ч - ЦИК-1) и медленно преципитирующие (72 ч - ЦИК-2) ЦИК, которые были представлены на электрофореграммах иммуноглобулиновой зоной и не содержали примесей белков плазмы крови. Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере IBM PC «Pentium» с использованием пакета прикладных программ «Statistica 5.5». Изменения признавали статистически значимыми при p 0,05). В составе ЦИК-2 отмечена аналогичная динамика содержания антител 0,24±0,03 и 0,20±0,032 ед. опт.пл. соответственно (р >0,05). При среднетяжёлом течении ГЛПС в динамике заболевания произошло достоверное снижение количества антител в составе ЦИК-1 (2,21±0,8 и 1,97± ±0,08 ед. опт. пл.), тогда как в составе ЦИК-2 уровень антител не имел достоверных отличий в разные периоды болезни (р >0,05) (см. табл. 3). При тяжёлом течении ГЛПС в отличие от больных со среднетяжёлыми и лёгкими формами в период олигурии количество хантавирусных антител, циркулирующих в свободном виде, было достоверно выше, чем в составе ЦИК (р 0,05 Б Олигурический 2,0±0,1 2,02±0,1 2,48±0,13 2,11±0,08 р2-3 >0,05; р2-4 0,05 рА-Б 0,05 Б ЦИК-1, олигурический 2,18±0,4 2,21±0,8 2,08±0,06 2,18±0,07 >0,05 В ЦИК-1, полиурический 1,89±0,1 1,97±0,08 2,12±0,22 2,02±0,08 р2-3 >0,05; р2-4 0,05 рА-Б >0,05; рА-В >0,05; рБ-В 0,05 >0,05 А ЦИК-2, лихорадочный 0 0,28±0,05 0,49±0,04 0,21±0,1 р2-3 0,05 В ЦИК-2, полиурический 0,20±0,03 0,28 ±0,05 0,56±0,06 0,33±0,05 р2-3 >0,05; р2-4 0,05 >0,05 >0,05 >0,05

V G Shakirova

Vene-shakirova[email protected] State Medical Academy, Kazan, Russia

I M Khaertynova

Kazan State Medical Academy, Kazan, Russia

K S Khaertynov

Republican Centre for Prevention and Control of AIDS, Kazan, Russia

  • Герасимов И.Г., Зоркова Е.В. Оптимизация метода определения концентрации циркулирующих иммунных комплексов различной величины // Клин. лабор. диагност. - 2001. - №7. - С. 48-49.
  • Инфекционные болезни: национальное руководство / Под ред. Н.Д. Ющука, Ю.Я. Венгерова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 1056 с.
  • Комисарова М.М., Мохова О.Т., Гришкин И.Г. Характер поражения почек у детей в острый и реконвалесцентный период геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Дальневост. мед. ж. - 2002. - №3. - С. 62-64.
  • Магазова Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики) / Под ред. Р.Ш. Магазова - Уфа: Гилем. - 2006. - 250 с.
  • Морозов В.Г., Иванов А.П., Деконенко А.Е. и др. Концентрация специфических иммуноглобулинов класса М в сыворотке крови больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в зависимости от сроков и характера течения болезни // Дальневост. мед. ж. - 2003. - №3. - С. 107-108.
Views

Abstract - 77

PDF (Russian) - 145

journals.eco-vector.com

СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ХАНТАВИРУСУ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКЕ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ТЯЖЕЛЫХ ФОРМ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии.

Значительный прогресс в лабораторной диагностике ГЛПС наметился после внедрения различных вариантов иммуноферментного анализа с определением антител класса G и М. Эти методы позволяют определить общее количество антител без определения специфических антител к определенным компонентам хантавируса.

В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется диагностикум производства ИПиВЭ (г.Москва), позволяющий обнаружить антитела класса G к вирусу ГЛПС уже на первой неделе с начала заболевания в реакции непрямой иммунофлуоресценции (1). Однако в данном случае для подтверждения диагноза необходимо протестировать вторую сыворотку, отобранную через 5-7 дней после первой.

Прототипом нашего изобретения является иммуноблот анализ, используемый для выявления антител к различным компонентам вирусов, свободно циркулирующих в сыворотке крови, с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных мембран (НЦМ) (2).

Недостатком этого метода при диагностике геморрагической лихорадки является недостаточная специфичность.

Задачей изобретения является повышение эффективности обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявление предикторов тяжелого течения заболевания.

Поставленная задача достигается тем, что способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.

Способ осуществляется следующим образом.

Антигенный препарат хантавируса подвергают очистке и концентрированию при помощи изопикнического ультрацентрифугирования в 30% растворе калия бромида при 24000 об/мин в течение 20 часов при 20°С. После окончания центрифугирования содержимое отсасывают со дна пробирки при помощи перистальтического насоса через увикорд. Материал, содержащий максимальное поглощение при длине волны 280 нм, объединяют и проводят электрофоретическую разгонку в 5% растворе агарозы, содержащей 0,1% додецилсулфата натрия. Вырезают фрагменты агарозы, содержащие антиген, элюируют забуференным физраствором. Элюированный антиген подвергают диск-электрофорезу по Laemmli (3) для определения полипептидного состава антигенных препаратов хантавируса.

Электрофорез проводят при комнатной температуре при силе тока 7 мА/пластинка до внедрения белков в концентрирующий гель. Основной режим фракционирования - 30 мА/пластинка. Продолжительность электрофореза составляет 4-6 часов в зависимости от концентрации полиакриламидного геля (ПААГ).

Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ проводят, как после переноса белков на мембранные фильтры, так и непосредственно после электрофореза.

Белки после фракционирования фиксируют в водном растворе, содержащем 40% спирта (этанола или изопропанола-2) и 7% уксусной кислоты в течение суток. Фиксированный гель дважды промывают по 30 минут в дистиллированной воде при постоянном покачивании и проводят окрашивание 0,04% кумаси G-250 в 3,5% растворе хлорной кислоты в течение полутора часов. Затем гель погружают в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления от избытка красителя до полного обесцвечивания фона.

Также проводят дополнительное окрашивание с помощью азотнокислого серебра для выявления полисахаридов и повышения чувствительности окрашивания белковых зон с целью снижения фонового окрашивания и придания полученным дискретам черного цвета. Для этого гель выдерживают 3-е суток в дистиллированной воде при комнатной температуре с ежедневной сменой, далее воду сливают, гель перемешивают в растворе формалина (0,15 мкл на 350 мл h3O), выдерживают 30 минут при 37°С, дважды промывают дистиллированной водой по 20 минут, погружают в свежеприготовленный окрашивающий раствор на 15 минут (4 мл 20% водного раствора AgNO3), титруют раствором, содержащим 7,5 мл 0,36% NaOH и 3 мл 10% Nh5OH до полного исчезновения бурого осадка, объем раствора доводят до 100 мл дистиллированной водой, гель дважды промывают дистиллированной водой по 10 минут (350 мл на гель), погружают в проявляющий раствор, содержащий 2,5 мл 1% лимонной кислоты и 1 мл 37% раствора формалина. После появления черного окрашивания гель промывают два раза 5% раствором тиосульфата натрия. Окрашенный гель протоколируют при помощи оптического сканирования.

Для выявления антител класса IgG в сыворотке крови и в циркулирующих иммунных комплексах больных к хантавирусу инактивированный, лиофильно высушенный антигенный препарат хантавируса растворяют в лизирующей смеси, содержащей 1% додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола. Антигенный препарат кипятят 3 минуты в водяной бане и разгоняют в 12,5% полиакриламидном геле по Laemmli (3). По окончанию электрофореза гель выдерживают 30 минут в буфере для переноса (0,025М трис, 0,191М глицин, 20% метанол), собирают полусухой сендвич (semi-dry).

По окончанию электрофореза разделенный антигенный препарат переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (нм) в течение 45 минут при силе тока 100 мА. После окончания переноса антигена мембрану промывают последовательно дистиллированной водой, фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБТ), блок раствором, ФСБТ и высушивают. Далее мембрана нарезается на стрипы шириной 2-3 мм, которые помещают в специальные лоты-ванночки. В лоты вносят 2 мл ФСБТ, выдерживают 5 минут и вносят сыворотку в разведении 1:50 - 1:100. Инкубируют на шейкере 2 часа при комнатной температуре, затем промывают ФСБТ 4 раза по 1 минуте. Далее вносят конъюгат против антител класса IgG человека, меченный щелочной фосфатазой, инкубируют 1 час на шейкере. Затем промывают 4 раза ФСБТ по 1 минуте, вносят субстратный раствор, содержащий бром-хлор-индол-фосфат нитросиний тетрозоль (BCIP-NBT) и инкубируют 30 минут. Далее промывают дистиллированной водой 3 раза, высушивают, окрашенные стрипы приклеивают на бумагу, сканируют и денситометрируют. Учет результатов иммуноблотинга проводят при помощи оптического сканирования в отраженном свете на сканере SHARP JX-330 «Pharmacia Biotech» (Швеция).

Далее выделяются ЦИК из сыворотки крови, для этого используют 7%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярным весом 6000, который обеспечивает выделение двух фракций: «быстро» (18 часов-ЦИК-1) и «медленно» (72 часа-ЦИК-2) - преципитирующих ЦИК. Для этого сыворотки крови смешивают в соотношении 1:1 с 7%-ным раствором ПЭГ. Далее смесь инкубируют при +6 - +2°С в течение 18 и 72 часов. Преципитат осаждают центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и четырежды промывают десятикратным объемом 7%-ным раствором ПЭГ в 0,05М боратном буфере, рН 8,8. Далее препараты ЦИК диссоциируют температурным воздействием при +60°С в течение 3-х часов и проводят иммуноблот анализ для выявления антител класса IgG.

Нами проведены исследования динамики образования антител к хантавирусам и определение их диагностической значимости у больных ГЛПС при различных формах тяжести методом иммуноблот анализа.

Для выполнения поставленных задач было обследовано 226 больных ГЛПС. В зависимости от тяжести течения болезни все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 24 человека с легким течением болезни, вторую группу - 105 человек со среднетяжелым течением и третью группу - 97 человек с тяжелым течением.

Результаты исследований частоты выявления спектра хантавирусных антител класса IgG у больных ГЛПС методом иммуноблот анализа представлены в таблице 1.

Результаты анализа на наличие серологических маркеров хантавируса у больных различными формами тяжести ГЛПС показали, что частота выявления антител класса IgG к поверхностным белкам (молекулярной массы 58 кДа и 72 кДа) в сыворотке крови и в составе ЦИК-1 у наблюдаемых больных была 100%, носила стабильный характер и не зависела от тяжести инфекционного процесса (табл.1).

Антитела к нуклеокапсидному белку 45 кДа не были обнаружены ни в одной из тестируемых сывороток, как в свободном виде, так и в составе ЦИК-1.

Анализ выявления специфического спектра антител в составе ЦИК-2 показал, что доминирует по частоте выявление антител к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа, 72 кДа. Тем не менее, каких-либо корреляционных взаимосвязей частоты обнаружения антител и тяжести инфекционного процесса выявлено не было.

Наименьшая частота индикации антихантавирусных антител в ЦИК-2 была к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа. Максимальная частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа наблюдалась у больных тяжелой формой заболевания, которая составила 100%, начиная с лихорадочного периода.

У больных легкой формой антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа в лихорадочном периоде не определялись, в олигурическом периоде - лишь у 46,1% больных, в полиурическом - у 73,2%. У больных среднетяжелой формой заболевания частота их обнаружения была выше - 37,2%, 66,6% и 78,2% соответственно. Частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа у больных тяжелой формой заболевания была достоверно выше частоты выявления антител у больных легкой и среднетяжелой формами заболевания (р<0,01).

В результате проведенного иммуноблот анализа в циркулирующих иммунных комплексах у больных ГЛПС на ранних сроках заболевания обнаруживаются антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа только у больных тяжелой формой (100% случаев) и не обнаруживаются у больных с легким течением болезни.

Таким образом, выявление антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания позволяет диагностировать тяжелые формы болезни уже в самом начале болезни на ранних сроках.

Пример 1.

Больной К., 32 года. Диагноз: ГЛПС тяжелое течение. Поступил на 4-й день болезни с жалобами на лихорадку до 39 С°, головную боль, рвоту, нарушение зрения в виде «тумана» перед глазами, боли в поясничной области, снижение диуреза. В анализах крови: лейкоцитоз 15×109/л, тромбоцитопения, повышение мочевины - 25 ммоль/л, креатинин - 600 мкмоль/л.

Больному проводили исследование сыворотки на выявление антител класса IgG к хантавирусам в сыворотке крови и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Проводили электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса (фиг.1), определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, также антитела класса IgG определяли в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1 выявили антитела класса IgG к поверхностным белкам молекулярной массой 58кДа и 72 кДа. В составе ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к белкам массой 45 кДа, 58 кДа и 72 кДа. Выявление антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Наличие антител в составе ЦИК-2 к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания свидетельствовали о тяжелом течении болезни.

Пример 2.

Больная Ф. 27 лет. Поступила на 3 день болезни с жалобами на повышение температуры до 38 С°, головную боль, слабость. Уменьшение диуреза не отмечала. В анализах крови лейкоцитов - 6×109/л, тромбоцитов 190 тыс в мкл, мочевина - 6 ммоль/л, креатинин - 110 мкмоль/л.

Проведено исследование сыворотки крови на наличие антихантавирусных антител в сыворотке крови и в ЦИК методом иммуноблот анализа.

В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1, ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа и 72 кДа. Выявленние антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Отсутствие в составе ЦИК-2 антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа свидетельствовало о легком течении болезни.

Список использованной литературы

1. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики) / Р.Ш.Магазов (под ред. Акад. АН РБ Магазова Р.Ш.). - Уфа, Изд-во «Гилем», 2006. - 250 с.

2. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П.Иванов // Вопр. вирусол. - 1996. - №6. - С.236-265.

3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage / U.K. Laemmli // - Nature. London. - 1970, T4. V.227, pp.680-685.

СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ХАНТАВИРУСУ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКЕ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ТЯЖЕЛЫХ ФОРМ ЗАБОЛЕВАНИЯ

edrid.ru

ХАНТАВИРУСЫ И ДИАГНОСТИКА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ

Транскрипт

1 ХАНТАВИРУСЫ И ДИАГНОСТИКА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ В.В. Распопин Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) острое вирусное природно-очаговое заболевание человека зоонозной природы, характеризующееся системным поражением мелких сосудов, геморрагическим диатезом, гемодинамическими расстройствами и развитием острой почечной недостаточности. Этиология Возбудителями ГЛПС является ряд генетически различных серотипов хантавирусов (Пуумала, Хантаан, Сеул, Амур, Добрава и Сааремаа), принадлежащих к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae [1 3]. Хантавирусы имеют сегментированный одноцепочечный РНК-геном. Три сегмента нуклеиновой кислоты, S (малый), M (средний) и L (большой), кодируют нуклеопротеин (NP), оболочечные гликопротеины (G1, G2) и РНК-зави симую РНК-полимеразу соответственно. Гликопротеины принимают непосредственное участие в инфицировании макрофагов, лимфоцитов, эпителиальных, фолликулярных, дендритных и эндотелиальных клеток, связываясь с их рецепторами. Нуклеопротеин синтезируется на ранних стадиях инфекции и играет ключевую роль в таких важных этапах жизненного цикла вируса, как трансляция, транспорт и сборка зрелых вирионов. Пока- 1 ПАМЯТКА ВРАЧУ

2 зано также, что данный белок участвует в модуляции иммунного ответа хозяина на хантавирусную инфекцию [2]. Эпидемиология К настоящему времени различают две нозологические формы хантавирусной инфекции хантавирусный кардиолегочный синдром, регистрируемый в странах Северной и Южной Америки, и ГЛПС, широко распространенную на евразийском континенте, в том числе и на территории России [4, 5]. В странах Европы и Азии ежегодно фиксируется около 100 тыс. случаев данного заболевания, большая часть из которых приходится на Китай. В нашей стране ГЛПС занимает по заболеваемости ведущее место среди зоонозов и одно из первых мест среди природно-очаговых болезней человека [6]. Ежегодно в РФ официально регистрируется в среднем случаев этой инфекции. Наибольшее количество, заболевших ГЛПС, было отмечено в 1997 г. [7]. Около 90 % всех пациентов с диагнозом ГЛПС приходится на Приволжский и Уральский федеральный округ [8]. На севере Европейской части России доминирующими возбудителями ГЛПС являются хантавирусы Пуумала и Сааремаа, на юге страны Добрава [6]. В Сибири обнаружена циркуляция шести серотипов хантавирусов, однако связь с заболеванием человека ГЛПС установлена пока только для вирусов Пуумала и Добрава [9]. В дальневосточных регионах возбудителями ГЛПС являются вирусы Хантаан, Амур и Сеул [10]. Роль остальных хантавирусов в патологии человека остается предметом дальнейших исследований. Природный резервуар хантавирусов мышевидные грызуны, у которых инфекция протекает в латентной форме. Принято считать, что каждый серотип/генотип хантавирусов имеет единственного естественного хозяина. Инфекционный вирус выделяется грызунами во внешнюю среду с мочой, фекалиями или слюной животных [1, 11]. Пути передачи инфекции человеку аспирационный, алиментарный и контактный. В эндемичных по ГЛПС районах отмечают увеличение числа заболевших людей каждые 3 4 года, что связано 2

3 с периодичностью массового размножения доминирующих видов грызунов и повышением уровня их инфицированности хантавирусами. Передача вируса от больных ГЛПС здоровым людям до настоящего времени зарегистрирована не была [1, 6]. Патогенез и клиника Механизмы патогенеза и патоморфологии органов-мишеней при инфекции, ассоциированной с разными видами хантавирусов, имеют общий иммуноопосредованный характер. Патогенез хантавирусной инфекции складывается из следующих факторов: проникновения патогена в респираторные пути; вирусемии и диссеминации; репликации в клетках дыхательных путей, макрофагах, дендритных клетках, эндотелии сосудов микроциркуляторного русла и тканях органов-мишеней. При этом размножение хантавируса в различных клетках не сопровождается их повреждением, что свидетельствует о неспособности хантавируса к прямому цитопатогенному эффекту и инициации некроза тканей. развития системного и локального иммунного воспаления с инициацией высокой сосудистой проницаемости. Это обуславливает центральные и микроциркуляторные гемодинамические нарушения гиповолемию, плазморею, гипергидратацию тканей, сгущение крови, нарушения работы сердца, синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром) и, как следствие, деструктивные процессы в тканях и полиорганную недостаточность (респираторный тракт, почки, мозг, печень, сердце) [12, 13]. В развитии ГЛПС выделяют несколько периодов: инкубационный, составляющий от 7 до 46 дней, в среднем 14 дней; начальный (лихорадочный) 1 5 дней. Заболевание развивается остро и проявляется в виде недомогания, головной и мышечной боли, повышения температуры. Возможны катаральные явления, чувство тяжести и тупая боль в пояснице, нарушения зрения. У больного ГЛПС, как 3

4 правило, наблюдается гиперемия лица, шеи, верхней половины тела, могут быть мелкие геморрагии на коже и зеве, одутловатость, пастозность лица и век, инъецированность сосудов склер и конъюнктив; в олигурический период (со 2 4 до 8 11 дня болезни) нарастают проявления типичных для ГЛПС интоксикационного синдрома; геморрагического синдрома; нарушений деятельности сердечно-сосудистой системы; поражений вегетативной нервной системы; острой почечной недостаточности; в полиурический период (с 13-го по по день болезни) восстанавливается диурез. Азотный, электролитный и водный балансы постепенно нормализуются; на 3 4 неделе болезни полиурия уменьшается, состояние пациента улучшается, начинается период реконвалесценции, длящийся 3 4 недели [14]. Клинические проявления ГЛПС могут существенно отличаться в зависимости от вида инфицирующего хантавируса. Наиболее тяжелые формы заболевания с развитием массивного геморрагического синдрома и шока могут быть вызваны серотипом Добрава. Летальность при этом составляет 5 13 %. У больных, зараженных вирусами Хантаан и Амур, отмечается преимущественно типичный геморрагический синдром, среднетяжелые и тяжелые формы ГЛПС составляют %, а летальность до 8 %. Кроме того, при инфекции, обусловленной хантавирусом Амур, в 78 % случаев развивается ДВС-синдром. Для лиц, инфицированных вирусом Сеул, в основном характерна среднетяжелая форма заболевания, сопровождающая почечной недостаточностью и гепатопатией. Смертность при этой инфекции составляет 1 2 %. При заражении хантавирусами Пуумала и Сааремаа преобладают симптомы нефропатии, геморрагический синдром менее выражен, а шок развивается относительно редко. Летальность относительно невысокая и составляет 0 0,2 % среди пациентов, имевших симптоматику ГЛПС [15]. 4

5 Клинические признаки ГЛПС и степень их проявления у больных, инфицированных одним и тем же серотипом хантавируса, могут значительно варьировать, а в ряде случаев заболевание может протекать в стертой и атипичной формах (менингоэнцефалитическая, абдоминальная, гипертоксическая, ГЛПС с затянувшейся более 12 дней олигоурией, лихорадочная) [12, 14]. При клинической диагностике симптомы ГЛПС ошибочно могут быть отнесены к таким заболеваниям, как грипп и другие ОРВИ, Крым- Конго геморрагическая лихорадка, псевдотуберкулез, энтеровирусная инфекция, острый гломерулонефрит, токсическая нефропатия, геморрагический васкулит, менингококковая инфекция, а с учетом данных эпиданамнеза к лептоспирозу, клещевому энцефалиту, боррелиозу [5, 12, 14]. В связи с этим, а также вследствие многообразия клинических проявлений ГЛПС, расширения ареалов природных очагов, роста заболеваемости, наличия тяжелых форм и высокой летальности особое значение приобретает своевременная и точная лабораторная диагностика ГЛПС. Лабораторная диагностика ГЛПС Прямые методы диагностики хантавирусных инфекций включают в себя исследования по выявлению самого вируса, его антигенов и РНК. Прямую изоляцию вируса из лейкоцитарной фракции крови или биоптатов органов пациента проводят либо на лабораторных животных, либо на клеточной линии Vero-Е6. Однако этот метод может быть реализован только в специальных лабораториях и требует больших временных затрат (4 8 недель) [15]. Чувствительным методом лабораторного подтверждения хантавирусной инфекции является иммуногистохимический метод обнаружения вирусных антигенов в гистологических препаратах с использованием специфичных меченых антител. Этот метод может иметь важное значение в ретроспективной постмортальной диагностике ГЛПС [16]. Для обнаружения хантавирусов применяют метод гибридизации in situ, который позволяет 5

6 определить наличие РНК вируса в исследуемом биоптате либо секционном материале [15]. В настоящее время для прямого выявления возбудителей инфекционных заболеваний широко используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), позволяющую выявить нуклеиновые кислоты возбудителей в клинических пробах обследуемых лиц с высокой чувствительностью и специфичностью. Хантавирусы имеют одноцепочечную геномную РНК отрицательной полярности, поэтому для ее определения применяют метод ОТ-ПЦР, включающий проведение обратной транскрипции вирусной РНК, а затем ПЦР [17, 18]. Применение этого метода в лабораториях позволяет обнаружить РНК хантавируса в крови пациентов на самой ранней стадии патологического процесса, что особенно важно при развитии тяжелых форм заболевания. Однако ОТ-ПЦР имеет ограничения, поскольку вирусемия при хантавирусной инфекции часто совпадает с инкубационным периодом или началом заболевания, а на 3 9 день после появления его симптомов вирус, как правило, элиминируется из кровотока. Вследствие этого РНК хантавируса в крови или моче госпитализированных больных с ГЛПС может не выявляться [19]. В настоящее время основой лабораторной диагностики ГЛПС являются серологические методы исследования [20]. Показано, что структурные белки хантавирусов, нуклеокапсидный (NP) и оболочечные (G1, G2), отличаются высокой иммуногенностью и при развитии инфекции индуцируют продукцию специфических антител [21, 22]. Иммуноглобулины класса М (IgM) к хантавирусам можно выявить в сыворотке крови больных уже на 1 7 день после появления признаков заболевания. Концентрация IgM достигает максимальных значений к 8 25 дню, а к концу третьего месяца от начала заболевания они перестают обнаруживаться. Определение этого серологического маркера позволяет проводить раннюю лабораторную диагностику ГЛПС [5, 12, 20]. Иммуноглобулины класса G (IgG) к хантавирусам начинают продуцироваться в организме человека на 2 9 день после появления симптомов 6

7 заболевания, а через дня их концентрация в крови достигает максимальных значений. Показано, что на ранних стадиях ГЛПС у больных определяются преимущественно IgG к NP-белку, а в начале выздоровления появляются антитела, специфичные к вирусным гликопротеинам G1 и G2 [5]. Положительный результат определения вирусспецифических IgG не позволяет дифференцировать недавнее заражение человека хантавирусом от давно перенесенной инфекции, поскольку у переболевших формируется длительный иммунитет, и IgG к хантавирусам могут обнаруживаться в течение многих лет после заболевания. Надежным подтверждением недавнего инфицирования является сероконверсия (появление в крови сначала вирусспецифических IgM, а затем IgG) или четырехкратное увеличение титра IgG в образцах сыворотки крови, взятых у обследуемого пациента в острый период заболевания и в фазу выздоровления с интервалом 1 2 недели. Следует отметить, что у 1 2 % больных с явными клиническими проявлениями ГЛПС и соответствующим эпиданамнезом антитела к хантавирусам не выявляются, что, как предполагают, может быть связано с наличием серонегативных форм данного заболевания [20]. В этом случае для подтверждения хантавирусной инфекции важное диагностическое значение имеет метод ОТ-ПЦР [23]. Серологическая диагностика хантавирусных инфекций может проводиться с применением: реакции торможения гемагглютинации, поскольку хантавирусы инициируют продукцию антител, способных агглютинировать эритроциты некоторых животных; непрямого иммунофлюоресцентного анализа, в котором используют культуру клеток Vero-E6, зараженную хантавирусом. Метод имеет высокую чувствительность. К недостаткам этого теста относятся трудно стандартизуемая методика анализа и визуальная оценка его результатов; реакции нейтрализации бляшкообразования, которая является «золотым стандартом» серологических тестов. Тест является типоспецифичным и может быть применен для дифференцирования инфекций, вызываемых разными хан- 7

8 тавирусами. Для анализа необходимо использовать серотипы хантавирусов, адаптированные к культуре клеток Vero-E6 путем длительного серийного пассирования; иммуноблоттинга, который обладает высокой чувствительностью и специфичностью и потенциально, при соответствующем выборе рекомбинантных антигенов, может быть использован для типирования хантавирусов; иммуноферментного анализа (ИФА) [2, 24]. Основными недостатками первых трех методов являются невозможность унифицированной оценки результатов проведенного исследования и необходимость применения нативных хантавирусов, все работы с которыми должны проводиться в помещениях с высоким уровнем биобезопасности. В современной лабораторной диагностике хантавирусной инфекции наиболее широко применяется определение вирусспецифических иммуноглобулинов классов М и G с использованием иммуноферментного анализа (ИФА). Наборы реагентов для ИФА имеют высокую чувствительность и специфичность, позволяют за 2 3 часа провести одновременно анализ большого количества образцов и получить объективную инструментальную оценку его результатов [20]. Для определения иммуноглобулинов к хантавирусам с помощью ИФА в качестве антигена применяют очищенный вирус, рекомбинантные полипептиды аналоги его структурных белков, а также синтетические пептиды, представляющие собой отдельные антигенные детерминанты. В большинстве коммерческих наборов реагентов с этой целью используется рекомбинантный белок NP, рекомбинантные поверхностные гликопротеины G1 и G2 хантавирусов применяют значительно реже [2, 21]. В ЗАО «Вектор-Бест» для диагностики ГЛПС предлагает наборы реагентов «ВектоХанта-IgM» и «ВектоХанта-IgG» на основе высокоспецифичных рекомбинантных белков и конъюгатов моноклональных антител к IgM и IgG человека с пероксидазой хрена. Эти диагностические тесты предназначены для выявления в сыворотке (плазме) крови специфических иммуноглобулинов классов 8

9 М и G к хантавирусам Добрава, Пуумала, Хантаан, Амур методом твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве антигенов в данных наборах использованы рекомбинантные белки, содержащие иммунодоминантные эпитопы нуклеокапсидного белка NP и гликопротеинов оболочки G1, G2 этих хантавирусов, иммобилизованные на поверхность лунок планшета. Наборы содержат все необходимые для проведения анализа компоненты, укомплектованы дополнительной пластиковой емкостью, одноразовыми наконечниками для автоматических дозаторов и пленкой для заклеивания планшет. При проведении анализа осуществляется цветовой контроль внесения исследуемого образца и конъюгата. Стрипированный вариант планшета позволяет проводить 12 независимых постановок по 8 анализов (включая контроли). Время проведения анализов 1,5 ч. Наборы реагентов «ВектоХанта-IgM» и «ВектоХанта-IgG» имеют регистрационные удостоверения и разрешены к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации. Список литературы: 1. Schmaljohn C., Hjelle B. // Emerg. Infect. Dis V. 3. P Jonsson C.B., Figueiredo L.T.M. and Vapalahti O. // Clin. Microbiol. Rev V. 23. N. 2. P Lee P., Gibbs C.J., Gajdusek D.C. et al. // J. Clin. Microbiol V. 22. N. 6. P Zhang Y.Z., Zou Y., Fu Z.F., Plyusnin A. // Emerg. Inf. Dis V. 16. N. 8. P Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом / Под ред. Р.А. Слоновой, Е.А. Ткаченко. Владивосток: Примполиграфкомбинат, с. 6. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д. и др. // Национальные приоритеты России (5). С Информация Госкомсанэпиднадзора // Здоровье населения и среда обитания. Ежемес. бюл C. 23; C. 31; C. 25; C. 35; C. 50; C. 50; C. 49; C. 46; C. 43; C. 50; C

10 8. Лещинская Е.В., Ткаченко Е.А., Рыльцева Е.В. и др. // Вопр. вирусологии Т С Yashina L.N., Patrushev N.A., Ivanov L.I. et al. // Virus Res V. 70. N P Якименко В.В., Гаранина С.Б.,Малькова М.Г. и др. // Тихоокеанский мед. журн С Vaheri A. Hantaviruses // Mahy B.W.J., Regenmortal M., editors. Encyclopedia of Virology Elsevier. P Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики / Под ред. Р.Ш. Магазова. Уфа: Гилем, с. 13. Иванис В.А. // Тихоокеанский мед. журн С Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. Учеб. пособие для ординаторов и интернов / Под ред. В.Х. Фазылова. Казань: КГМУ, с. 15. McCaughey C., Hart C.A. // J. Med. Microbiol V. 49. N. 7. P Mir M. // Clin. Lab. Med V. 30. N. 1. P Яшина Л.Н., Кузина И.И., Малышева Т.В. и др. // Вестн. РАМН С Платонов А.Е., Карань Л.С., Гаранина С.Б. и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни С Evander M., Eriksson I., Pettersson L. Et al. // J. Clin. Microbiol V. 45. N. 8. P Профилактика геморрагической лихорадки с почечным синдромом / Санитарно-эпидемиологические правила СП Москва: Роспотребнадзор С Elgh F., Ludkvist A., Alexeyev O.A. et al. // J. Clin. Microbiol V. 35. N. 5. P Kallio-Kokko H., Leveelahti R., Brummer-Korvenkontio M. et al. // J. Med. Virol V. 65. N. 3. P Zhenqiang B., Pierre B.H. F.,Cathy E.R. // J. Infect. Developing Countries V. 2. N. 1. P

11 НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ПРОИЗВОДСТВА ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ» ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЗООНОЗНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ по каталогу Наименование Количество анализов D-4902 ВектоХанта-IgG 12 8 D-4904 ВектоХанта-IgM 12 8 D-5150 ВектоНил-IgM 12 8 D-5152 ВектоНил-IgG 12 8 D-5154 ВектоНил-IgG-авидность 6 8 D-5052 ВектоККГЛ-IgG 12 8 D-5054 ВектоККГЛ-IgM 12 8 D-5056 ВектоККГЛ-антиген 12 8 D-1152 ВектоВКЭ-IgM 12 8 D-1154 ВектоВКЭ-антиген 12 8 D-1156 ВектоВКЭ-IgG

12 Предлагаем наборы реагентов для иммуноферментной и ПЦР-диагностики в режиме реального времени ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов А, В, С, D, E; TORCH-инфекций; инфекций, передаваемых половым путем; паразитарных и желудочнокишечных заболеваний; природно-очаговых и зоонозных инфекций; аутоиммунных и системных заболеваний; беременности и ее мониторинга; выявления опухолевых маркеров; гормонов и др., а также наборы реагентов для клинической биохимии. Максимальный выбор диагностической продукции! ЗАО «Вектор-Бест» , г. Новосибирск-117, а/я 492 тел.: (383) , тел./факс: , Internet: Представительства: Москва: (495) Санкт-Петербург: (812) Ростов-на-Дону: (863) Уфа: (347) Екатеринбург: (343) Хабаровск: (4212) Нижний Новгород: (831) Киев: (044) Формат /32. Гарнитура Century SchoolBook. Доп. тираж 2000 экз. Подписано в печать Отдел оперативной печати ЗАО «Вектор-Бест» , Новосибирская обл., пгт. Кольцово, а/я 121

docplayer.ru


Смотрите также