Выявление иммунных (IgG) анти-а, анти-в антител с использованием унитиола Назначение метода. Анти д антитела


Определение резус-принадлежности.

В повседневной практике определение резус-фактора производится либо с помощью антирезусных сывороток (анти-Д) или моноклональными анти-Д антителами.

Определение резус-фактора антирезусной сывороткой анти-д экспресс-методом (в пробирках без подогрева).

Для проведения данного исследования используется универсальная антирезусная сыворотка для экспресс-метода (анти-Д). Исследуемая кровь берется из пальца или из флакона с консервированной кровью непосредственно перед исследованием. На дно пробирки наносят одну каплю стандартной антирезусной сыворотки для экспресс - метода и добавляют одну каплю исследуемой крови. После чего осторожными движениями добиваются, чтобы образовавшаяся жидкость растекалась по стеклу пробирки. Через 3 минуты после внесения эритроцитов добавляют в пробирку 2-3 мл физиологического раствора. Пробирку осторожно переворачивают 3 раза. Затем читают результат. Наличие глыбок агглютинатов свидетельствует о содержании в эритроцитах резус-фактора. В случае резус-отрицательной крови агглютинация не наблюдается.

Определение резус-фактора с помощью моноклонального реагента (цоликлон анти-d Супер).

На тарелку наносят большую каплю реагента (около 0,1 мл). Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10 - 15 сек., а четко выраженная агглютинация наступает через 30 - 60 сек. Результаты реакции учитывают через 3 мин. Тарелку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20 - 30 сек, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации. Цоликлон анти-D Супер выпускается во флаконах по 2, 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). Срок хранения - 1 год в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение месяца в закрытом виде.

Проба на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по групповому фактору.

Проба на групповую совместимость крови донора и реципиента производится с каждым флаконом, непосредственно перед гемотрансфузией, одновременно с определением группы донора и реципиента при комнатной температуре (от +15о до +25о С). С помощью пробы на групповую совместимость устанавливают наличие или отсутствие в крови реципиента антител, направленных против донорской крови из данного флакона. Природа антител, если они обнаруживаются, этой пробой не устанавливается.

На тарелку наносят сыворотку реципиента, в нее помещают в 10 раз меньшую каплю донорской крови. Результат читают через 5 минут, при наличии агглютинации добавляют каплю физиологического раствора и продолжают наблюдение еще 2 минуты. При отрицательном результате агглютинация не наступает и капля остается равномерно окрашенной в красный цвет. Это означает, что в сыворотке реципиента антитела против эритроцитов донорской крови отсутствуют и противопоказаний к переливанию этой пробой не установлено.

Проба на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по резус-фактору Rho(d)

Эта проба дает возможность выяснить наличие или отсутствие антител системы резус в крови реципиента, направленных против эритроцитов донора. В пробирку помещают 2 капли сыворотки крови реципиента, 1 каплю 33% полиглюкина и 1 каплю донорской крови. в нее в 10 раз меньшую каплю крови донора. Содержимое пробирки перемешивают путем размазывания его по ее стенкам. Через 3 минуты в пробирку добавляют 3 мл физиологического раствора хлорида натрия и после перемешивания читают результат. При положительном результате видна агглютинация эритроцитов, выраженная в большинстве случаев неярко. При отрицательном результате агглютинация не наступает и содержимое остается равномерно окрашенной в розовый цвет. Положительный результат указывает на то, что в сыворотке реципиента содержатся антитела, вызывающие агглютинацию эритроцитов донора. Это значит, что кровь несовместима и ее переливать нельзя. Отрицательный результат - отсутствие агглютинации указывает и на то, что противопоказаний к переливанию данной пробой не выявлено. Постановка пробы на резус-совместимость может в отдельных случаях сопровождаться возникновением ложной реакции - псевдоагглютинации донорских эритроцитов в сыворотке реципиента. Дифференцировать истинную и псевдоагглютинацию можно только при рассмотрении под микроскопом свежеприготовленного мазка. Результат учитывается при малом увеличении микроскопа с окуляром .(х15). Истинная агглютинация дает глыбки агглютинатов в виде "тутовых ягод" или "гроздей винограда". При ложном положительном результате на фоне свободных эритроцитов видны разной длины цепочки эритроцитов, сложившихся в монетные столбики.

Следует помнить: проба на резус-совместимость не заменяет пробы групповой совместимости и ограничиваться ее проведением нельзя. Практика показывает, что в ряде случаев проба на резус-совместимость бывает отрицательной, в то время как на групповую совместимость дает четко положительный результат, что указывает на недопустимость переливания крови этого донора.

studfiles.net

Выявление иммунных (IgG) анти-а, анти-в антител с использованием унитиола Назначение метода

Определение IgG антител к антигенам эритроцитов системы АВ0 проводится при иммуногематологическом обследовании доноров, беременных, новорожденных с признаками гемолитической болезни, а также при исследовании причин гемотрансфузионных осложнений гемолитического типа.

Характеристика метода

Выявление IgG антител к антигенам эритроцитов системы АВ0 затруднено из-за одновременного присутствия в сыворотке естественных изогемагглютининов, относящихся к классу IgM. В данном методе иммунные IgG анти-А, анти-В антитела выявляются после полного разрушения унитиолом естественных IgM анти-А, анти-В антител.

Для инактивации IgM используют 5% раствор унитиола (2,3-димеркаптопропансульфоната Na), разрушающий дисульфидные связи в молекулах иммуноглобулинов М. Выявление IgG анти-А, анти-В затем проводится в антиглобулиновом тесте с эритроцитами А и В.*

Метод пригоден для дифференциальной диагностики IgG и IgM антител к антигенам эритроцитов любой специфичности в сыворотке крови человека, а также моноклональных антителах.

Меры предосторожности

При проведении исследования необходимо надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

Оборудование и реактивы

- 5% раствор унитиола,

- моноклональные антитела анти-D супер IgM,

- стандартные эритроциты групп крови А, В, а также эритроциты 0 резус-положительной принадлежности,

- раствор натрия хлорида 0,9%,

- термостат лабораторный на +37°С,

- пробирки вместимостью 5-10 мл,

- пипетки,

- таймер,

- перчатки резиновые хирургические.

Проведение исследований Техника реакции

1. В сухой чистой пробирке смешать равные объемы испытуемой сыворотки и 5% раствора унитиола - опыт.

2. Во второй пробирке смешать равные объемы моноклональных антител анти-D супер IgM и 5% раствора унитиола - контроль.

3. Все пробы инкубировать в термостате при +37°С в течение 30 мин.

4. Сыворотки после обработки раствором унитиола исследуют с эритроцитами А и/или В в непрямом антиглобулиновом или в гелевом тесте с анти-IgG реактивом. Контроль испытывают с эритроцитами группы крови 0 резус-положительной принадлежности.

Интерпретация результатов

Сыворотки, сохранившие способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В после инкубации с раствором унитиола, содержат IgG анти-А или анти-В антитела - положительный результат.

Сыворотки, утратившие способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В после инкубации с раствором унитиола, не содержат IgG анти-А или анти-В антител - отрицательный результат.

Результат в контрольной пробе должен быть всегда отрицательным, что свидетельствует о разрушении антител класса IgM в моноклональных антителах анти-D и эффективности действия унитиола.

Для установления титра IgG антител производят последовательное разведение сывороток, обработанных унитиолом. За титр принимают величину наибольшего разведения, в котором отчетливо видна агглютинация со стандартными эритроцитами групп А и/или В.

Условия хранения и эксплуатации

Срок хранения вскрытой ампулы 5% раствора унитиола (2,3-димеркаптопропансульфоната натрия) не должен превышать 5 дней при хранении в холодильнике (+4 - 8°С).

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению.

______________________________

* При выявлении IgG анти-А, анти-В у доноров допускается проводить исследование на плоскости без подогрева.

studfiles.net

8. Время появления антител анти-с и анти-е

Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев (полные) до 2,5-3 лет (неполные) после начала иммунизации. Антитела появляются у 10-15% иммунизируемых лиц с титром 1:1 - 1:8 для неполных антител и 1:2 - 1:32 для полных антител.

9. Заключение

Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного влияния на состояние здоровья доноров.

В процессе иммунизации, а также после выработки антител при взятии крови и плазмы (плазмаферез) у доноров могут наблюдаться преходящие изменения периферической крови, например, увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов до 10%, моноцитов до 12%, лимфоцитов до 45%, повышение содержания общего количества лейкоцитов до 10х10 в степ. 9 /л, общего билирубина до 20,5 мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы до 1,36 мкмолей, пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 град. С. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для продолжения иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы (плазмаферез).

Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц, обработка сывороток и их испытание производятся согласно действующей "Инструкции по изготовлению сывороток антирезус".

Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию производится по отдельному расчету согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.

Оплата изоиммунным донорам за дачу крови и плазмы (плазмаферез) производится в двукратном размере по отношению к неиммунным донорам крови, плазмы согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.

С целью увеличения количества изоиммунных доноров крови, плазмы разрешается дополнительная оплата изоиммунным донорам за дачу крови или плазмы на усмотрение органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.

Изоиммунные доноры имеют право на внеочередное обслуживание в лечебных учреждениях.

Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/138, считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления

организации медицинской

помощи населению

Минздрава РФ

А.И.ВЯЛКОВ

Приложение N 17

УТВЕРЖДЕНО

Приказ Минздрава России

от 09.01.1998 г. N 2

Инструкция

По взятию и учету крови, получаемой от

Доноров малыми дозами, для приготовления

Стандартных эритроцитов

1. Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в других лечебно-профилактических учреждениях, где производится определение резус-принадлежности и изготовление сывороток антирезус и других антисывороток должны иметь постоянных доноров, у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов.

Стандартные эритроциты применяют в обязательном порядке при определении группы крови АВО, резус-принадлежности, выявлении антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении стандартных сывороток, предназначенных для определения группы крови АВО, сывороток антирезус, различных тест-сывороток для выявления антигенов эритроцитов.

1.1. При определении группы крови необходимо иметь контрольные эритроциты трех групп: О, А (подгруппа А1) и В;

1.2. при приготовлении стандартных изогемагглютинирующих сывороток следует использовать кровь доноров, указанных в пункте 1.1, и дополнительно иметь доноров подгруппы А2, А3, Ах, А2В, АВ2;

1.3. при определении резус-принадлежности необходимы контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты;

1.4. при изготовлении стандартных сывороток антирезус и при выявлении резус-антител необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в пункте "в", и дополнительно подобрать доноров групп О, А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти доноры должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от наличия у них различных антигенов резус, число доноров должно быть пополнено за счет доноров группы О(I) так, чтобы в эритроцитах доноров этой группы обязательно имелись антигены резус D, C, E, c, e, Cw порознь или в различных сочетаниях, а также антигены систем К - k, Fya - Fyb и других систем эритроцитов;

1.5. при изготовлении тест-сывороток различной специфичности необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в пунктах 1.3. и 1.4. и типированных по антигенам различных эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и отрицательные по различным антигенам.

2. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у доноров из пальца или из вены не чаще трех раз в неделю в зависимости от потребности.

3. Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь малыми дозами, не входит в состав учреждения Службы крови, донор находится на учете непосредственно в этой лаборатории.

При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые четыре месяца) донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови допускается при условии содержания гемоглобина не ниже 12 г% (120 г/л) для женщин и 13 г% (130 г/л) - для мужчин.

4. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления стандартных эритроцитов, должна быть заведена книга учета взятия крови по следующей форме:

Фамилия ______________ имя _____________отчество _____________

Группа крови _________________________,

фенотип по различным системам эритроцитов ____________________

1. Дата взятия крови

1. Количество взятой крови

1. Расписка донора, давшего кровь

1. Расписка лица, взявшего кровь

1. Расписка лица, использовавшего кровь для работы

2.

2.

2.

2.

2.

5. Взятие крови количественно подытоживается за 1,5-2 месяца. Итог подписывается руководителем лаборатории или отдела, для нужд которого бралась кровь.

6. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен указать количество взятой крови и за какой период времени взята кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела.

7. Принимая во внимание многократность и характер процедуры взятия крови у доноров, компенсацию за взятую у них кровь устанавливают в тройном размере по сравнению с суммой компенсации, установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным.

8. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все льготы, как для доноров, дающих кровь для переливания больным, согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Федерации. Выходной день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве не менее 100 мл.

"Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 14 октября 1976 года N 06-14/1, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления

организации медицинской

помощи населению

Минздрава РФ

А.И.ВЯЛКОВ

Приложение N 18

УТВЕРЖДЕНО

Приказ Минздрава России

от 09.01.1998 г. N 2

studfiles.net

ОФС.1.8.2.0004.15 Испытание на анти-D антитела в лекарственных препаратах иммуноглобулинах человека

Содержимое (Table of Contents)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод определения анти-D антител в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. Анти-D антитела определяют методом гемагглютинации «на плоскости» (Метод А) или в геле (Метод В).

Принцип метода состоит в том, что содержащиеся в испытуемом препарате анти-D антитела, являясь иммуноглобулинами класса G, способны вызывать агглютинацию D-положительных эритроцитов.

Проведение испытания

Содержание анти-D антител определяют с использованием папаинизированных D-положительных эритроцитов человека группы крови I (0). Предпочтительно использование эритроцитов фенотипа 0R2R2, возможно также применение эритроцитов фенотипов 0R1R1 или 0R1R2. Смешивание эритроцитов разных фенотипов недопустимо.

Для контроля специфичности анализа применяют D-отрицательные эритроциты фенотипа 0rr.

Допустимо применение как свежеприготовленной суспензии эритроцитов (при испытаниях методом гемагглютинации «на плоскости», Метод А), так и стандартных эритроцитов, входящих в тест-наборы (Методы А и В). При определении содержания анти-D-антител Методом А используют 3% суспензию эритроцитов, при определении содержания гемагглютининов гелевым методом (Метод В) используют 0,8% суспензию эритроцитов.

Метод гемагглютинации «на плоскости» (Метод А)

В стеклянные пробирки или лунки планшета вносят равное количество соответствующего разведения препарата и 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови I (0) — первый ряд и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови I (0) — второй ряд. К подготовленному разведению стандартного образца также добавляют равное количество 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд). Пробы осторожно встряхивают (на шейкере) в течение 10 сек, затем центрифугируют в течение 1 мин при 80 об/мин. Пробирки (планшеты) располагают под углом 70° к горизонтальной поверхности и оценивают визуально агглютинацию эритроцитов через 4 – 5 мин (но не более чем через 10 мин).

Содержание анти-D антител, определяемое максимальным разведением препарата, при котором наблюдают агглютинацию любой интенсивности, сравнивают с содержанием анти-D антител в положительном стандартном образце.

Метод гемагглютинации в геле (Метод В)

Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS).

В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8 % суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения испытуемого образца. Одновременно готовят пробы положительного и отрицательного стандартных образцов содержания анти-D антител: в дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения стандартного образца. Пробы инкубируют при температуре (37±0,5)°С в течение 30 мин. По окончании инкубации пробы центрифугируют (на специальной центрифуге для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограммированный режим) и оценивают агглютинацию. Агглютинированные эритроциты распределяются в толще гелевой колонки или в ее верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки.

Содержание анти-D антител, определяемое максимальным разведением препарата, при котором наблюдают агглютинацию любой интенсивности, сравнивают с содержанием анти-D антител в положительном стандартном образце.

Критерии приемлемости результатов:

— в пробирках (планшетах, микропробирках), содержащих суспензию D-отрицательных эритроцитов человека, агглютинация должна отсутствовать. Наличие агглютинации в этих пробирках (планшетах, микропробирках) свидетельствует о неспецифической реакции; испытания в этом случае необходимо повторить;

— содержание анти-D антител в положительном стандартном образце должно соответствовать аттестованным величинам.

Примечания

  1. Подготовка испытуемого образца. Испытуемый образец разводят фосфатным буферным раствором (рН 7,4±0,1), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка в образце 25 г/л. Это разведение испытуемого образца принимают за двукратное разведение (1:2), даже если оно и не соответствует истинной кратности разведения.

Готовят два ряда двукратных разведений испытуемого образца с использованием фосфатного буферного раствора (рН 7,4±0,1), содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина (1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256). При использовании гелевого метода (Метод В) разведения испытуемого образца готовят с использованием 0,9% раствора натрия хлорида или буферного раствора низкой ионной силы (LISS).

  1. Подготовка стандартных образцов содержания анти-D антител. В качестве стандартных образцов используют 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий 0,0475 МЕ/мл анти-D антител и имеющий номинальный титр в реакции гемагглютинации 1:8 (положительный стандартный образец) и 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий анти-D антитела в разведении не более 1:2 (отрицательный стандартный образец). Содержание анти-D антител в положительном стандартном образце является максимально допустимым для препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения. Подготовку стандартных образцов проводят в соответствии с инструкцией по применению. Анализ проводят с образцами, разведенными фосфатным буферным раствором (рН 7,4±0,1), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка 25 г/л.
  2. Подготовка раствора папаина. Лиофилизат папаина растворяют в соответствии с инструкцией производителя. Инкубируют при температуре (37±0,5)0С в течение 10–15 мин. Раствор используют свежеприготовленным. Возможно хранение раствора при температуре(6±2)0С в течение 5 сут или при температуре минус (21±1)°С в течение 6 мес. Раствор после оттаивания повторному замораживанию не подлежит.
  3. Подготовка суспензии стандартных эритроцитов. Свежеприготовленные D-положительные эритроциты (хранившиеся не более 3 сут), полученные не менее чем от 3 доноров, центрифугируют в течение 10 мин при 1500–2000 об/мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Процедуру повторяют не менее 3 раз, до получения прозрачной надосадочной жидкости.

В стеклянную пробирку вносят равные объемы промытых эритроцитов и раствора папаина, инкубируют в течение 15 мин при температуре (37±0,5) 0С, а затем центрифугируют при 1500–2000 об/мин в течение 10 мин. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют при тех же условиях.

Для приготовления 3% суспензии 1 объем осадка папаинизированных эритроцитов ресуспендируют в 32 объемах фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычего сывороточного альбумина.

Аналогичным образом приготавливают 3% суспензию D-отрицательных эритроцитов, полученных от 1-3 доноров.

  1. Приготовление фосфатного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 8,0 г натрия хлорида, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г калия хлорида, 0,2 калия дигидрофосфата. Добавляют 900 мл воды очищенной. Доводят рН до 7,4±0,1 1М раствором натрия гироксида или 1 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают, доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.

Скачать в PDF ОФС.1.8.2.0004.15 Испытание на анти-D антитела в лекарственных препаратах иммуноглобулинах человека

Поделиться ссылкой:

pharmacopoeia.ru


Смотрите также