К ингибиторам матричного биосинтезаотносят:. Интерферон ингибирует в процессе трансляции этап


Ингибиторы трансляции - Справочник химика 21

    Д. Являются ингибиторами трансляции. [c.359]

    Здесь мы рассмотрим действие лишь некоторых широко используемых антибиотиков-ингибиторов трансляции как у про-, так и у эукариот (табл. 3.5 и 3.6). [c.161]

    Ниже описываются опыты по определению t в. экспериментах на мышах in vivo в нормальных условиях и при действии ингибиторов трансляции циклогексимида и ауринтрикарбоновой кислоты. [c.281]

    Лейтин В. Л., Лерман М. И, Кинетика синтеза полипептидной цепи in vivo эффект ингибиторов трансляции. — Биохимия , 1975, т. 40, с. 1060—1070. [c.373]

    Несмотря на то, что разные эукариотические бесклеточные белоксинтезирующие системы активно транслируют гетерологичные мРНК, гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно. Например, глобиновые мРНК используются в синтезе белка в семь-восемь раз лучше лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников китайских хомячков. Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции определенных мРНК. Факты такого рода необходимо учитывать при выборе бесклеточной системы для решения конкретных экспериментальных задач. [c.190]

    На этом этапе были сделаны два наблюдения, которые открыли совершенно новые подходы. Одним из них было обнаружение Керром и сотр. [124, 125] ингибитора трансляции в экстрактах из обработанных интерфероном клеток и его идентификация как 2,5-oligo(A) другим было выявление фосфорилиро-вания по крайней мере двух белков только в обработанных интерфероном клетках. В обоих случаях интерферон индуцировал синтез ферментов, которые полностью отсутствовали в необработанных клетках. Тот факт, что интерферон индуцирует антивирусное состояние только в том случае, если разрешен синтез мРНК и белков, конечно, был известен давно предпринимались попытки идентифицировать эти белки при помощи одно-или двумерного электрофореза [88, 201]. Однако, хотя было показано, что после обработки интерфероном образуется несколько новых полипептидов, ни один из них не удалось идентифицировать. Таким образом, под действием интерферона возникают две новые ферментативные активности. [c.59]

chem21.info

К ингибиторам матричного биосинтеза относят:

1.Ингибиторы репликации –

противоопухолевые препараты.

2.Ингибиторы транскрипции и трансляции – антибактериальные препараты.

3.Вирусы и токсины-ингибиторы

матричных синтезов в

эукариотических клетках.

4.Интерфероны.

1.Ингибиторы репликации – противоопухолевые препараты.

Препараты дауномицини доксорубицин,взаимодействуют с ДНК таким образом, что циклическая структура антибиотика

встраивается (“интеркалирует”) между

парами G-C.

Антибиотик актиномицин D – блокирует синтез ДНК и РНК у про- и эукариотов.

Токсичен, поэтому используется только в

научных целях.

В настоящее время создаются препараты , которые обеспечивают доставку ингибитора

только в опухолевые клетки. Это

достигается связыванием цитостатических антибиотиков с белками, рецепторы к которым находятся на опухолевых клетках.

2. Ингибиторы транскрипции и трансляции– антибактериальные препараты.

Антибиотик рифампицин ингибирует бактериальнуюДНК-зависимуюРНК-полимеразу ,применяется для лечения туберкулёза.

Стрептомицин - ингибирует инициацию синтеза белка у прокариотов и вызывает ошибки в прочтении информации матричной РНК.

Тетрациклин – нарушает элонгацию полипептидной цепи.

Левомицетин – ингибирует синтез белка за счёт присоединения к 50S субъединице рибосомы, подавляя пептидилтрансферазную активность.

Пенициллины и цефалоспорины – ингибируют синтез клеточных стенок у грамм –отрицательных бактерий.

Препараты антибактериальной группы отличаются высокой избирательностью и малотоксичны для человека. Это объясняется различиями в структуре РНК – полимераз, РНК и белков рибосом у прокариотов и эукариотов.

3. Вирусы и токсины – ингибиторы матричных синтезов в эукариотических клетках.

Вирусы.

Генетический материал вирусов представлен

молекулой ДНК или РНК, он содержит информацию о

специфических белках и ферментах, необходимых для репродукции вируса (вирус оспы, полиомиелита,

гриппа, гепатита). В инфицированных клетках

хозяина прекращается синтез нуклеиновых кислот и белков. Репродукция вирусных частиц идёт вплоть до гибели заражённой клетки.

Токсины.

Причиной гибели людей при отравлении бледной поганкой Amanita phalloides является токсин –

альфа-аманитин,вызывая необратимую дисфункцию печени и почек. Токсин ингибирует эукариотическиеРНК-полимеразы.Наибольшую чувствительность к яду обнаруживаетРНК-полимераза,катализирующая синтез мРНК.

Белок рицин, выделенный из клещевины обыкновенной ингибирует синтез белка у

эукариотов. Рицин – белковый компонент касторового масла. Длительное применение - может вызвать нарушение работы кишечника и гибель больного

4. Интерфероны.

Интерфероны –небольшиебелки (гликопротеины), содержат 160 аминокислотных остатков. Секретируются клетками позвоночных в ответ на заражение вирусами, препятствуют распространению вирусной инфекции. Одна молекула интерферона способна защитить одну клетку. Интерфероны стимулируют синтез ферментов, способных разрушать мРНК вирусов

Механизмы

генетической

изменчивости.

Биологическая эволюция и естественный отбор возможны только при наличии

генетической изменчивости. Геном постоянно

претерпевает изменения.

Изменения в последовательности

пуриновых или пиримидиновых оснований в гене, не исправленные ферментами репарации, получили название “мутации”.

Мутации в половых клетках, передаются по наследству и могут проявляться в фенотипе потомства как наследственная болезнь.

Геном эукариотов подвергается изменениям и при заражении ДНКили РНКсодержащими вирусами, которые внедряют

свой генетический материал в ДНК клеток

хозяина.

Изменения в геноме могут быть

разнообразны и затрагивать различные по протяженности участки ДНК от хромосом и генов до отдельных нуклеотидов.

Тип мутаций

Характер

Последствия

 

изменений

 

геномные

Изменение числа

Болезнь Дауна

 

хромосом

(появление

 

 

лишней

 

 

хромосомы у 21

 

 

пары)

хромосомные

Общее число

Мышечная

 

хромосом не

дистрофия

 

меняется.

Дюшена.

 

Наблюдаются

 

 

перестройки

 

 

хромосом,

 

 

видимые при

 

 

микроскопическом

 

 

исследовании

 

генные

Изменения

Серповидно-

 

затрагивают один

клеточная анемия,

 

кодон или

вызванная

Полиморфизм белков. Разнообразие антител.

studfiles.net

Матричные биосинтезы

  1. Через 1 час после внутривенного введения животным аспартата, содержащего изотоп 15N, радиоактивная метка была обнаружена в РНК и ДНК разных органов и тканей. Как объяснить результаты этого эксперимента?

Ответ:  Аспартат в клетке используется для синтеза нуклеотидов, которые идут на синтез ДНК и РНК. фосфорибозилдифосфат(ФРДФ) превращается в фосфорибозил амин , потом идёт каскад реакций ( здесь нужен аспартат, фолиевая кислота) получается ИМФ, а он превращается в АМФ и ГМФ

  1. Как и почему при гипоксии изменится синтез нуклеиновых кислот и белка?

Ответ:  Для синтеза нуклеиновых кислот и трансляции нужна энергия АТФ и ГТФ. А при гипоксии нарушается тканевое дыхание. Развивается гипоэргическое состояние, синтеза нукл кислот и трансляции не происходит

  1. Сколько нуклеотидов нужно затратить на стадии транскрипции препроинсулина (109 аминокислот), если интроны составляют 40 % гена? Сколько АТФ и ГТФ нужно затратить на стадии трансляции проинсулина (84 аминокислоты)?

Ответ:Так как каждая аминокислота кодируется триплетом из 3 нуклеотидов, то для кодирования 109 аминокислот нужно 327 нуклеотидов (109*3=327).Но в задаче сказано,что 40% гена составляют интроны-некодирующие участки гена,следовательно,109 аминокислот-это 60% гена,так как интроны в процессе сплайсинга вырезаются.

109-60% Х-100% Х=182(весь ген) И для его кодирования нужно 182*3=546 нуклеотидов.

На включение одной аминокислоты в растущую полипептидную цепь клетка затрачивает 4 макроэргические связи: 2 из АТФ в ходе реакции, катализируемой аа-тРНК синтетазой (в процессе активации аминокислот АТФ расщепляется на АМФ и пирофосфат), и 2 молекулы ГТФ: одна используется на связывание аа-тРНК в А-центре рибосомы, а вторая затрачивается на стадию транслокации.

На стадии трансляции проинсулина,учитывая,что он состоит из 84 аминокислот-84АТФ и 168 ГТФ.

  1. Объясните, почему скорость синтеза соляной кислоты в присутствии ингибиторов транскрипции не меняется, если синтез соляной кислоты индуцируется гистамином и снижается, если синтез индуцируется гастрином.

Ответ:Гастрин-это фермент,то есть белок.А Гистамин-биогенный амин.Именно поэтому в присутствии ингибиторов транскрипции синтез гастрина уменьшается,а следовательно и синтез соляной кислоты уменьшается,а гистамин не меняется!

  1. Причиной гибели людей при отравлении бледной поганкой является токсин аманитин, который вызывает необратимую дисфункцию печени и почек. Как известно, токсичность вещества обусловлена его способностью ингибировать РНК-полимеразу (особенно РНК-полимеразу II). Объясните механизм токсического действия бледной поганки.

Ответ: Токсическое действие обусловлено ингибированием синтеза белка и РНК. Т.к. не РНК то и трансляция невозможна. Белка мало и клетка погибает т.к. в печени и почках активно идёт синтез белка.

  1. В эукариотических клетках дифтерийный токсин вызывает модификацию фактора элонгации EF2, что приводит к нарушению транслокации. Какой процесс в клетках будет нарушен при заражении дифтерией?

Ответ: Транслокация протекает на стадии элонгации при трансляции. Следовательно нарушается синтез белка.

  1. Известно, что интерферон, обладая противовирусным действием, индуцирует синтез РНКазы и протеинкиназы, которая приводит к фосфорилированию факторов инициации трансляции в клетках эукариот. Объясните механизм противовирусного действия интерферона.

Ответ: Факторы трансляции активны в фосфорилированном виде, РНКазы принимают участие в созревании РНК. Следовательно нарушается синтез белка( без РКК невозможна трансляция)

  1. У больного после длительного лечения большими дозами тетрациклина развилась жировая инфильтрация печени. С чем связано развитие данной патологии?

Ответ: Тетрациклин нарушает комплекс рибосомы и тРНК. Т.е. подавляет трансляцию. Для транспортировки липидов нужны белки. Липопротеины не образуются и развивается жировая инфильтрация печени.

  1. Пациенту с тяжелой формой пневмонии назначили антибактериальный препарат рифамицин. Назовите причины нарушения синтеза бактериальных белков в организме больного. Почему применение препарата не нарушает синтез белка в клетках организма больного?

Ответ: Рифамицин ингибирует ДНК зависимую РНК полимеразу( присоединяется к ДНК зараженной клетки и синтезируется РНК) при игибировании фермента нарушается транскрипция, что вызывает гибель клетки. На человеческие РНК полимеразы не действует.( антибиотик специфичен дня бактериального фермента)

  1. Объясните целесообразность использования доксорубицина в противоопухолевой терапии.

Ответ: Доксорубицин подавляет синтез ДНК и РНК в активнопролифирирующих клетках. Следовательно подавляет рост опухолей. Так же действует на клетки эпителия, кроветворные клетки( этим обусловлены осложнения при химиотерапии)

studfiles.net

Синтез белка, ингибиторы инициация - Справочник химика 21

    Мы уже видели, что антибиотики-чрезвычайно важный инструмент в биохимических исследованиях, так как действие многих антибиотиков весьма специфично. Например, рифампицин - мощный ингибитор инициации синтеза РНК (разд. 25.18). Известно много антибиотиков, ингибирующих синтез белка (табл. 27.3). В случае некоторых из них установлен и механизм действия. Стрептомицин - сильно основной трисахарид - препятствует связыванию формилметионил-тРНК с рибосомами и нарушает таким образом правильную инициацию белкового синтеза. Кроме того, стрептомицин вызывает неправильное считывание мРПК. Если в качестве матрицы используется poly(U), то наряду с включением фенилаланина (UUU) происходит включение изолейцина (AUU). Место действия стрептомицина в рибосоме было определено в результате опытов по реконструкции компонентов рибосом из чув- [c.105]     Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

    Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка считывания K3L, кодирующая белок мол. массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического фактора инициации elF-2a мол. массой 36,1 кДа. N-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серин, который в elF-2a фосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. КЗЬ-белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования elF-2a, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K3L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону. С помощью ПЦР-мутагенеза гена K3L, находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены КЗЕ-последо-вательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО K3L . Этот штамм оказался в 10-15 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа (рис. 11.11). Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с K3L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью де- [c.241]

    Для объяснения зависимости инициации репликации от клеточной массы были предложены две модели. Одна из них предполагает непрерывный синтез белка-инициа-тора в течение клеточного цикла. Накопление критического количества такого белка может служить сигналом для инициации. В соответствии со второй моделью в определенном периоде цикла в клетке синтезируется белок-ингибитор, а при увеличении объема клетки его уровень падает ниже эффективного. Существуют данные, свидетельствующие о том, что инициация действительно регулируется клеточной массой. Однако пока не установлено, происходит ли это в результате накопления инициатора или разведения ингибитора. В настоящее время предпочтение отдается модели, предполагающей синтез инициатора, поскольку она согласуется с данными, свидетельствующими о том, что для события инициации требуется синтез белка. [c.401]

    Следует отметить, однако, что до сих пор не раскрыты молекулярные механизмы, при помощи которых интерфероны тормозят размножение вирусов. Известно только, что интерфероны ингибируют биосинтез всех белков (и хозяйских, и вирусных), вероятнее всего, на уровне процесса трансляции. Возможно, что интерферон индуцирует синтез особого бел-ка-ингибитора, который затем связывается с рибосомами и блокирует трансляцию, или интерферон переводит один из активных эукариотических белковых факторов инициации в неактивный фактор путем фосфорилиро-вания. [c.93]

    Репрессия трансляции под действием двуспиральной РНК. В лизате ретикулоцитов двуцепочечные РНК, включая как двуспиральные фрагменты вирусного происхождения (полиовируса или реовирусов), так и синтетические комплексы поли(А) поли(и) или поли(1) поли(С), вызывают ингибирование синтеза белка в присутствии гемина, похожее по всем признакам на репрессию, вызываемую отсутствием гемина. Двуцепочечная РНК, которая оказывает такое воздействие на трансляцию, должна состоять не менее, чем из 50 пар нуклеотидных остатков. Оказалось, что, так же как и в результате отсутствия гемина, в присутствии такой двуцепочечной РНК происходит активация ингибитора инициации, обозначаемого как dsl, и этот ингибитор тоже является протеинкиназой, фосфорилирующей а-субъединицу eIF-2. В отличие от H I, однако, dsl связан с рибосомными частицами и представляет собой белок с молекулярной массой около 67000 дальтон. Активация ингибитора требует АТФ и происходит как результат автофосфорилирования белка. Именно автофосфорилирование индуцируется взаимодействием белка с двуцепочечной РНК. По-видимому, механизм репрессии инициации под действием активированного dsl во всем аналогичен таковому в случае H I и заключается в изменении взаимодействия eIF-2 в результате его фосфорилирования с дополнительным белком eIF-2B (см. выше). [c.262]

    В экстрактах ретикулоцитов происходит с высокой скоростью синтез субъединиц гемоглобина до тех пор, пока не иссякает гем. В отсутствие гема синтез белка останавливается из-за быстрого образования ферментативного ингибитора белкового синтеза. Этим ингибитором является протеинкиназа. Мигпенью для киназы служит eIF-2 - фактор инициации, связывающий GTP и доставляющий Met-TPHKf к 408-субчастице рибосомы Инактивация eIF-2 в результате фосфорилирования приводит к блокирова- [c.155]

    Первая ситуация возникает в ретикулоцитах, когда те лишаются гемина, кофактора, необходимого для сборки гемоглобина-основного белка эритроцитов. В отсутствие гемина инициация белкового синтеза прекращается. Это связано с тем, что падение концентрации кофактора до уровня ниже критического активирует ингибитор белкового синтеза, т.е. протеинкиназу (фермент, катализирующий перенос фосфатной группы на белки), а фактор eIF2a является субстратом этого фермента. [c.78]

    Об участии РНК-полимеразы в инициации репликации в сайте ori свидетельствовали данные, показывающие, что начало репликации бактериальной ДНК можно подавить рифампицином в период, когда ингибиторы белкового синтеза оказываются неэффективными. Это значит, что, по-видимому, важен именно синтез РНК (а не ее трансляция и образование белка). Подходящей системой для изучения этой функции может служить фаг лямбда, сайт инициации которого позволяет вести двунаправленную репликацию и, кроме того, способен приобретать структуру клеверного листа , подобную той, которая постулирована для Е. соИ. Инициация репликации в сайте начала репликации ДНК фага лямбда требует активации посредством транскрипции. [c.425]

    О взаимосвязи между синтезом РНК и образованием вирионов свидетельствуют и результаты опытов с использованием гуанидина. Этот ингибитор специфически блокирует сборку вирионов [120] при концентрации 1—3 мМ, никак не сказываясь на синтезе макромолекул в клетке [299]. Согласно современным представлениям, гуанидин влияет на инициацию синтеза РНК. Когда его добавляют в середине инфекционого цикла, переход новосинтезированных молекул РНК из репликативных комплексов в вирионы сразу блокируется это сопровождается накоплением пустых оболочек, прекращением расщепления VPO и перехода радиоактивного белка в вирионы [13]. [c.238]

chem21.info

Особенности получения и применение интерферонов

Содержание

Введение

1. Особенности получения интерферонов

2. Механизмы действия интерферонов

3. Терапевтическое применение ИНФ человека

Заключение

Список литературы

Введение

Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон, продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители.

Интерфероны (ИФН) — группа аутогенных гликопротеинов, биомеханизм действия которых связан с одновременным противовирусным эффектом - активацией клеточных генов, в результате чего синтезируются белки, ингибирующие синтез вирусной ДНК (РНК) и обладающие иммуномодулирующим эффектом — способностью усиливать экспрессию антигенов на клеточных мембранах и увеличивать активность цитотоксических Т-клеток и естественных киллеров [4].

ИФН подразделяются на два типа. К первому типу, действующему как ингибиторы репликации вируса и оказывающему преимущественно противовирусный эффект, относятся 22 различных подтипа ИФН-α и один подтип ИФН-β. Ко второму типу, проявляющему иммуномодуляторную активность, относятся ИФН-γ.

Существует три иммунологически различных класса ИФН: ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ.

К ИФН естественного происхождения относятся лимфобластоидный и лейкоцитарный ИФН (ИФН-α), синтезируемые соответственно стимулированными моноцитами и В-лимфоцитами человека, которые затем экстрагируются и очищаются; фибробластный ИФН (ИФН-β), получаемый из культуры фибробластов человека, и Т-лимфоцитарный ИФН (ИФН-γ).

К искусственно синтезируемым ИФН относится рекомбинантный ИФН-α, который представляет собой высокоочищенный единственный подтип ИФН-α, получаемый по рекомбинантной молекулярной технологии [1].

1. Особенности получения интерферонов

Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами.

Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.

В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.

Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.

Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041).

Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.

Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии.

Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона.

Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

1) Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.

2) Полученным продуктом трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.

3) Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - мРНК.

4) Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка [4].

5) Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК человека.

2. Механизмы действия интерферонов

ИФН проявляют некоторые виды активности как лимфокины и им-муномодуляторы. ИФН I типа, действующие преимущественно как ингибиторы репликации вирусов в клетке, реализуют свой эффект, стимулируя выработку рибосомами клеток хозяина клеточных ферментов, которые тормозят продукцию вирусов, нарушая трансляцию вирусной мРНК и синтез вирусных белков.

ИФН вырабатывают большинство видов животных, но проявление их активности видоспецифично, т.е. они действуют только у того вида животных, в которых вырабатываются.

ИФН вызывают индукцию трех ферментов:

протеинкиназы, нарушающей начальный этап построения пептидной цепи;

олигоизоаденилат синтетазы, активирующей РНК-азу, которая разрушает вирусную РНК;

фосфодиэстеразы, разрушающей конечные нуклеотиды тРНК, что приводит к нарушению элонгации пептида.

С учетом антивирусного и иммуномоделирующего эффектов ИФН в НПО «Биомед» предложены и успешно апробированы, суппозитории с ИФНаn1 и пробиотиками при терапии дисбактериозов вирусной и бактериальной этиологии, кандидозов; в гинекологической практике для лечения эндометритов, кольпитов, вагинитов и гинекологического герпеса.

3. Терапевтическое применение ИНФ человека

mirznanii.com

Трансляция

ТРАНСЛЯЦИЯ

Адапторная роль транспортных РНК

Транспортные РНК является единственным посредником между 4 х буквенной последовательностью нуклеиновых кислот и 20 ти буквенной последовательностью белков. Именно от наличия того или иного антикодона в тРНК зависит, какая аминокислота включится в белковую молекулу, т.к. ни рибосома, ни мРНК не узнают аминокислоту.

Присоединение аминокислоты к тРНК осуществляется ферментом аминоацил-тРНК-синтетазой, имеющей специфичность одновременно к двум соединениям: какой-либо аминокислоте и соответствующей ей тРНК.

Так как существует около 60 различных тРНК, то некоторым аминокислотам соответствует две или более тРНК. Транспортные РНК, способные присоединять одну и ту же аминокислоту называют изоакцепторными

Биосинтез белков

После считывания информации с ДНК и переноса ее на матричную РНК начинается синтез белков. Каждая зрелая мРНК несет информацию только об одной полипептидной цепи. Если клетке необходимы другие белки, то необходимо транскрибировать мРНК с иных участков ДНК.

Биосинтез белков или трансляция происходит на рибосомах, внутриклеточных белок­синтезирующих органеллах, и включает 5 ключевых элементов:

  • матрица – матричная РНК
  • растущая цепь – полипептид
  • субстрат для синтеза – 20 протеиногенных аминокислот
  • источник энергии – ГТФ
  • ферменты – рибосомальные белки и рРНК
Выделяют три основных стадии трансляции: инициация, элонгация, терминация.

Инициация

Для инициации необходимы мРНК, ГТФ, малая и большая субъединицы рибосомы, три белковых фактора инициации (ИФ 1, ИФ 2, ИФ 3), метионин и тРНК для метионина

В начале этой стадии формируются два тройных комплекса: первый – мРНК, малая субъединица, ИФ 3; второй – мет тРНК, ИФ 2, ГТФ. После их объединения и присоединения большой субъединицы начинается стадия элонгации.

Элонгация

Для этой стадии необходимы все 20 аминокислот, тРНК для всех аминокислот, белковые факторы элонгации, ГТФ. Элонгация представляет собой циклический процесс, повторяющийся столько раз, сколько аминокислот необходимо включить в полипептидную цепь. Удлинение цепи происходит со скоростью примерно 20 аминокислот в секунду.

Терминация

Синтез белка будет продолжаться до тех пор, пока рибосома не достигнет на мРНК особых терминирующих кодонов – стоп-кодонов УАА, УАГ, УГА. Данные триплеты не кодируют ни одной из аминокислот, их также называют нонсенс-кодоны. Кроме стоп-кодонов для окончания синтеза белка требуются ГТФ и белковые факторы терминации, которые последовательно катализируют

1. Гидролитическое отщепление полипептида от конечной тРНК

2. Отделение от П участка последней, уже пустой, тРНК,

3. Диссоциацию рибосомы.

Полирибосомы

По причине того, что продолжительность жизни матричной РНК невелика, перед клеткой стоит задача использовать ее максимально эффективно, т.е. получить максимальное количество «белковых копий». Для достижения этой цели на каждой мРНК может располагаться не одна, а несколько рибосом, встающих последовательно друг за другом и синтезирующих пептидные цепи. Такие образования называются полирибосомы.

Посттрансляционная модификациябелков

Чаще всего в результате трансляции полипептидные цепи образуются в неактивной форме, поэтому необходимы дополнительные изменения – процессинг.

К ним относятся:

1. Удаление с N конца метионина или даже нескольких аминокислот

специфичными аминопептидазами;

2. Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина;

3. Частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с

инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ;

4. Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам:

  • фосфорной кислоты – фосфорилирование по сер, тре, тир используется при регуляции активности ферментов или для связвания ионов кальция
  • карбоксигруппы – при участии витамина К происходит  карбоксилирование глутамата в составе протромбина, проконвертина, фактора Стюарта, Кристмаса, это позволяет связать ионы кальция при инициации свертывания крови.
  • метильной группы – метилирование аргинина и лизина в составе гистонов используется для регуляции активности генома
  • гидроксильной группы – образование гидроксипролина и гидроксилизина необходимо для созревания молекул коллагена
  • йода – в тиреоглобулине присоединение йода необходимо для образования предшественников тиреоидных гормонов йодтиронинов.
  • углеводных остатков – гликирование требуется при синтезе гликопротеинов
5. Включение простетической группы:
  • гема – при синтезе гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы
  • витаминных коферментов – биотина, ФАД, пиридоксальфосфата и т.п.
6. Объединение протомеров в единый олигомерный белок, например, гемоглобин, лактатдегидрогеназа.

Фолдинг белков

Фолдинг – это процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру. Для обеспечения фолдинга используется группа вспомогательных белков под названием шапероны (chaperon, франц. – спутник). Они предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом, изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы, способствуют переходу вторичной структуры в третичную.

При нарушении функции шаперонов и отсутствии фолдинга в клетке формируются белковые отложения – развивается амилоидоз. Насчитывают около 15 вариантов амилоидоза.

Лекарственная регуляция

1. Инактивация факторов инициации:
  • интерферон активирует внутриклеточные протеинкиназы, которые, в свою очередь, фосфорилируют белковый фактор инициации ИФ 2 и подавляют его активность.
2. Нарушение кодон-антикодонового взаимодействия:
  • стрептомицин присоединяется к малой субъединице и вызывает ошибку считывания первого основания кодона.
3. Нарушение элонгации:
  • тетрациклины блокируют А центр рибосомы и лишают ее способности связываться с аминоацил тРНК
  • левомицетин связывается с 50S-частицей рибосомы и ингибирует пептидил­трансферазу
  • эритромицин связывается с 50S-частицей рибосомы и ингибирует транслоказу
  • пуромицин по структуре схож с тирозил тРНК, входит в А центр рибосомы и участвует в пептидилтрансферазной реакции, образуя связь с имеющимся пептидом. После этого комплекс пуромицин пептид отделяется от рибосомы, что останавливает синтез белка.

medznate.ru

Интерферон: индукция противовирусного состояния: введение

Интерферон: индукция противовирусного состояния: введение

Противовирусная активность интерферонов альфа и бета состоит в подавлении белкового синтеза и репликации ДНК в вирусинфицированных клетках, в активации натуральных киллеров (НК) , лизирующих пораженные клетки, в усилении экспрессии молекул I класса МНС . Эта последняя активность интерферонов имеет прямое отношение к индукции специфического (адаптивного) иммунного ответа, так как обеспечивает повышенную генерацию антивирусных цитотоксических T-клеток (CD8 T-клеток) .

Под действием интерферонов альфа и бета активируются также защитные механизмы соседних клеток, обеспечивая их устойчивость к вирусной инфекции. Активация затрагивает гены ряда белков, обладающих прямой антивирусной активностью.

Интерферон-гамма, как и другие типы интерферонов, ингибирует размножение вируса в клетке, но, кроме того, сильно активирует макрофаги и НК-клетки .

В обработанных интерфероном зараженных вирусом клетках можно выделить несколько путей ингибирования белкового синтеза вирусами и вирусными дцРНК ( Farrell et al., 1978 ). Первые два пути требуют присутствия АТФ .

Первый путь, приводящий к ингибированию инициации белкового синтеза, включает активацию протеинкиназной системы . При участии дцРНК и АТФ эта система фосфорилирует и посредством этого инактивирует связанный с рибосомой белок Р1 и фактор инициации белкового синтеза еIF-2 .

Второй путь, связанный с деградацией как мРНК, так и рРНК, приводит к снижению скорости синтеза белков и включает действие по крайней мере двух ферментов.

Активированная 2'-5'-олигоаденилатсинтетаза , синтезирует 2-5'олигонуклеотиды , которые в свою очередь активируют клеточную эндорибонуклеазу , деградирующую РНК, что блокирует синтез белка в зараженных клетках.

Кроме того в индукции противовирусного состояния важную роль играет синтез белка Mx .

Пути влияния дцРНК на эффективность белкового синтеза представлены на рис. схема индукции антивирусного состояния .

Следует однако отметить, что роль отдельных ферментов в установлении и развитии противовирусного состояния не равноценна.

Показано, что первый путь подавления белкового синтеза, связанный с активацией протеинкиназы и фосфорилированием рибосомного белка Р1 и фактора инициации белкового синтеза, по-видимому, играет ведущую роль в регуляции трансляции вирусной мРНК в обработанных интерфероном клетках, так как в условиях, когда отсутствовала заметная деградация мРНК, наблюдалось интерферон зависимое фосфорилирование белка Р1 и фактора eIF-2 и ингибирование трансляции вирусной мРНК ( Miyamioto, Samuel, 1980 ).

Возможно, это связано с тем, что протеинкиназа и 2'-5'-олигоаденилатсинтетаза активны при разных уровнях дцРНК в клетке: протеинкиназа активна при низкой концентрации дцРНК (10-8-10-7г/мл) и неактивна при высокой (10-5г/мл), а 2'-5'-олигоаденилатсинтетаза, напротив, имеет максимум активности при высокой концентрации дцРНК (10-5г/мл) ( Williams et al., 1979 ).

Следует, однако, иметь ввиду, что активность индуцируемых интерфероном ферментов и антивирусная активность интерферона в общем случае может зависеть также от типа инфицированных вирусом клеток, от того, каким вирусным штаммом инфицированы клетки, а также от множественности инфекции.

Рассмотренные внутриклеточные механизмы действия интерферона в основном были получены при исследовании интерферонов I типа и имеют непосредственное отношение только к их противовирусной активности.

Инфицированные вирусом клетки способны синтезировать интерферон-альфа (ИФ-альфа) и интерферон-бета (ИФ-бета) . ИФ-альфа синтезируется вирусинфицированными лейкоцитами , ИФ-бета - продукт фибробластов и многих других клеточных типов; интерферон-гамма (ИФ-гамма) образуют некоторые субпопуляции T-лимфоцитов .

Интерферон-альфа и интерферон-бета действуют на ранних этапах развития антивирусного ответа; интерферон-гамма продуцируется эффекторными Т-клетками после индукции адаптивного иммунного ответа .

Ссылки:

medbiol.ru