Методы определения индукции гамма-интерферона антигенами микобактерий туберкулеза. Гамма интерферон тест на туберкулез


Квантифероновый тест на туберкулез в инвитро

Сегодня существует альтернатива традиционным Манту и Диаскинтест (дст) – это квантифероновый (он же интерфероновый) тест в инвитро. Все три способа помогают обнаружить туберкулез на ранних его стадиях.

Метод квантифиронового теста

Метод квантифиронового теста перекочевал из стран, где заболеваемость туберкулезом на порядок ниже (Европа, США, Австралия). Ученые прорабатывают вариант замены традиционной диагностики на данный тест.

Вокруг этого ведутся споры, поскольку некоторые считают, что нельзя отменять систему исследований, которая на протяжении долгого времени давала позитивные результаты.

Их оппоненты доказывают крайнюю объективность такого теста и возможность его применения даже людям с аллергическими реакциями на туберкулин.

Сейчас метод нельзя назвать превалирующим, но он существует как альтернативное решение.

Как происходит распознавание инфекций

Особенно полезным это новшество оказалось для людей, которым противопоказано делать манту или дст, а также для детей в период карантина.

Чем отличается квантифероновый тест на туберкулез в инвитро от двух остальных способов диагностики?

Можно выделить такие отличия теста от манту и дст: при квантифироновом тесте не вводят подкожных инъекций, а используют взятую венозную кровь (для дальнейшей проверки на количество гамма-интерферона), тогда как при других способах используются подкожные инъекции, что исключает их применение при заболеваниях или ослабленном иммунитете.

Поскольку в первом случае нет контакта с организмом, то нет и побочных эффектов, во втором – могут быть побочные реакции, если человек не переносит вводимое вещество.

Как делают тест детям

Не может быть запрета на квантифероновый тест, потому что он проводится не в организме непосредственно, манту и дст могут быть запрещены, при хронических заболеваниях или обострениях.

При проведении дст и теста в инвитро не бывает реакции на БЦЖ, а при манту бывает реакция на антитела после БЦЖ.

Схема проведения квантиферонового теста в инвитро следующая: пациент сдает необходимое количество венозной крови в специально организованных пунктах. При этом кровь можно брать только при условии, что человек не ел на протяжении восьми часов.

Дальше кровь размещают в три пробирки и анализ нацелен на сканирование наличия в крови гамма-интерферона, который вырабатывается только у людей, заболевших туберкулезом.

Гамма-интерферон выделяется Т-лимфоцитами при нахождении микробактерий туберкулеза.

Укол в вену на руке

Инвитро способен определить белки, что имеются в составе микробактерии туберкулеза двух типов: человеческого и бычьего, поскольку на них вырабатываются антитела.

Так происходит объективное исследование наличия возбудителя туберкулеза в организме через сканирование гамма-интерферона в крови.

Также в случае положительного результата при прохождении теста необходимо провести работу по дифференциации найденного.

Она направлена на разграничение возбудителей туберкулеза и других микобактериоз, которые могут быть выявлены в процессе анализа.

Во время неоднократного проведения теста в инвитро было обнаружено, что третья часть пациентов имеет в крови микобактерии. Несмотря на это, туберкулез может развиться лишь у 5-9 % людей.

Схема проведения квантиферонового теста

Умножают риск развития заболевания такие неблагоприятные факторы:

  1. Контакт с людьми, владеющими открытой формой туберкулеза (чаще всего это медики или родственники).
  2. Слабый иммунитет (сюда относят людей ВИЧ-инфицированных, диабетиков или вышедших из заключения).

Квантиференовой тест может быть назначен в случаях:

  1. Если манту дал положительный результат.
  2. Если у пациента были контакты с больным туберкулезом.
  3. Если наблюдается высокий риск контактирования с возбудителем.
  4. Если у пациента есть противопоказания к традиционной туберкулинодиагностике или дст.
  5. В случае обследовании мигрантов.

Преимущества такого анализа

Преимущества квантиферонового теста сравнительно с дст и манту:

  • Нет побочных эффектов. Это обусловлено тем, что непосредственно анализ проводиться после изъятия пробы;
  • Высокая специфичность. Результаты теста не могут быть ложноположительными.
  • Отсутствие ограничений в проведении. Квантифероновый тест можно проводить даже при протекании острых вирусных заболеваний или сразу после вакцинации;
  • Объективность результатов. При таком методе исследования результаты добываются лабораторным путем, что на порядок объективнее, чем при визуальном анализе кожных проб;
  • Возможность применять людям, которые имеют аллергические реакции на туберкулин или противопоказания к кожным пробам;

Как и в каждом методе анализа, в квантифироновом тесте в инвитро есть свои недостатки.

Среди них: исследование (сравнительно с манту и дст) дорогостоящее; может показывать ложноотрицательный результат, поскольку владеет средней чувствительностью; невозможность определить латентная форма туберкулеза в организме или непосредственно воспаление.

Отдельной проблемой является пока нераспространенность пунктов, где сделать такой тест возможно.

Так, в России центры расположены только в крупнейших городах (Москва, Санкт-Петербург, Новосибирск), что однозначно усложняет доступ к такого рода исследованию.

tuberkulezkin.ru

Методы определения индукции гамма-интерферона антигенами микобактерий туберкулеза

В последние годы были разработаны, и во многих странах разрешены к применению два варианта лабораторных теста для диагностики латентной туберкулёзной инфекции, основанные на измерении продукции IFN-γ Т-лимфоцитами крови пациента в ответ на стимуляцию белками ESAT-6 и CFP-10. Один из них квантифероновый тест (QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) Cellestis, Victoria, Australia) использует твердофазный иммуносорбентный анализ для измерения антигенспецифичной продукцииIFN-γ циркулирующими клетками цельной крови (рис. 6) . Тест выполняется в течение нескольких часов.QFTобладает высокой чувствительностью и специфичностью. Он позволяет с достоверностью 95% исключить наличие активной туберкулезной инфекции.

Принцип метода состоит в том, что сенсибилизированные лимфоциты человека, инфицированного МБТ или больного туберкулезом, в условиях in vitro(в пробирке) при контакте со специфическими антигенами (в течение 20-24 часов) продуцируютIFN-γ, количество которого измеряется методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Рис. 6. Набор QuantiFERON-TBGoldIn-Tubи анализатор ИФА

Чтобы избежать ошибок, параллельно ставиться проба с неспецифическим митогеном (фитогемагглютинин, неспецифический стимулятор Т-клеток), обязательная для каждого образца. Это дает дополнительную гарантию в случае, если есть сомнения в иммунном статусе пациента. Пробирка с митогеном также служит контролем правильности проведения процедуры, включая взятие и подготовку образца крови, выполнения инкубации (положительный контроль). На исследование берется 3 мл венозной крови (в 3 специально подготовленные пробирки по 1 мл). В одной из пробирок содержаться антигены МБТ – белки ESAT-6 и CFP-10, вторая не содержит антигенов (отрицательный контроль), третья митоген. Поскольку ESAT-6 и CFP-10 экспрессируются при размножении МБТ, иммунный ответ на эти антигены соответствует наличию в организме активной туберкулезной инфекции.

Положительный результат QFT означает текущую инфекцию, вызванную МБТ. При этом данный результат не позволяет дифференцировать недавно приобретенную инфекцию от старой или латентную туберкулезную инфекцию от активного туберкулеза.

Отрицательный результат QFTозначает то, что инфекция, вызванная МБТ маловероятна, но при этом ее нельзя исключить при иммунной супрессии.

Неопределенный результат QFTотмечается при отсутствии отклика клеток на стимуляцию митогеном. Это указывает в первую очередь на погрешности в подготовке образца, либо на то, что у данного пациента иммунная система не функционирует должным образом. Обычно у них отмечается отрицательная проба Манту и в этом случае нельзя подтвердить или отвергнуть туберкулезную инфекцию.

Недостатками квантиферонового теста являются высокая стоимость (24 евро только стоимость расходных материалов на одно исследование), потребность в оснащении лаборатории, обученном персонале, требование к обработке крови для поддерживания функциональной активности лимфоцитов, необходимость взятия крови из вены.

В 2011 г. в России разработана и зарегистрирована новая тест-система - набор реагентов для иммунологического определения туберкулезного инфицирования по индукции интерферона-гамма in virtroв присутствии специфических антигенов микобактерий туберкулёза«Тубинферон».Методика отличается отQFTтем, что наряду со специфическими рекомбинатными антигенами в качестве антигенного индуктора IFN-γ используется туберкулинPPD, повышая качество диагностики туберкулезной инфекции при дифференциальной диагностики инфекционной и поствакцинной аллергии. Чувствительность и специфичность отечественной системы довольно высока 96% и 98% соответственно.

Метод, аналогично, как при QFT, основан на иммуноферментном анализе, где после культивирования образцов гепаринизированной крови пациента при 37°Cв течение 22-24 часов в 3-х пробирках по 1 мл (оконтроль, проба с туберкулиномPPDи проба со специфическими пептидами МБТ ESAT-6 и CFP-10), определяют концентрацию IFN-γ. Наличие туберкулезного инфицирования диагностируют при уровне индукции IFN-γ в пробе со специфическими белками МБТ выше 70 пг/мл (нижний пороговый критерий). При более низких концентрациях в данной пробе и при наличии высокого уровня IFN-γ лишь в пробирки с туберкулином определяется наличие поствакцинной аллергии. Таким образом, по сравнению с квантифероновым тестом проба «Тубинферон» позволяет определить наличие поствакцинной аллергии.

Общий анализ крови. Основными причинами изменений состава крови при туберкулезе являются интоксикация и гипоксия. В начальный период заболевания в крови содержится нормальное количество эритроцитов и гемоглобина. По мере усиления изменений в легочной ткани нарушается газообмен, в результате чего может развиться гиперхромная анемия (увеличение количества гемоглобина при уменьшении количества эритроцитов). При значительном снижении массы тела больного могу наблюдаться явления гипохромной анемии, которая характеризуется уменьшением количества эритроцитов и гемоглобина. Частым спутником туберкулезного процесса является небольшой лейкоцитоз (в пределах 9,0-15,0х109/л). Число лейкоцитов выше 15,0х109/л бывает при казеозной пневмонии и в случае присоединения неспецифического воспалительного процесса. Одновременно увеличивается процент палочкоядерных нейтрофилов (в пределах 6-14%), могут наблюдаться эозинофилия, моноцитоз. При этом количество эозинофильных гранулоцитов может увеличиваться у некоторых больных в период антибактериальной терапии. Тяжелые формы туберкулеза протекают с эозино- и лимфопенией. Лимфопения присуща казеозным формам бронхоаденита, казеозной пневмонии, милиарному туберкулезу. Увеличение СОЭ при ограниченном туберкулезе, чаще бывает в пределах 25-35 мм/час, при казеозной пневмонии, хроническом диссеминированном, фиброзно-кавернозном туберкулезе легких и амилоидозе внутренних органов – до 50-60 мм/час.

Общий анализ мочи. Изменения в моче при туберкулезе легких могут наблюдаться как в начальный период, так и при длительной хронической интоксикации. При неосложненном туберкулезе легких анализы мочи без патологических изменений. У больных с выраженным интоксикационным синдромом на фоне возможны альбуминурия, эритроцитурия, реже цилиндрурия. На фоне лечения эти изменения быстро проходят. Хронические формы туберкулеза осложняются амилоидозом почек. При этом в моче обнаруживают постепенно нарастающую протеинурию, а затем гипостенурию, цилиндрурию. По мере прогрессирования процесса нарушается выделительная функция почек, появляются олигурия, азотемия. Изменения в моче могут быть не замеченными при ранних стадиях амилоидоза, и тогда повышенная СОЭ трактуется ошибочно.

studfiles.net

Иммунологическая диагностика туберкулеза - Статьи - Каталог статей

Туберкулез  - инфекционное заболевание. В России ежегодно регистрируется свыше 70 новых случаев на 100 тысяч населения. По классификации ВОЗ эпидемия туберкулеза объявляется, когда заболеваемость превышает 50 случаев на 100 тысяч населения. Возбудителем являются микобактерии  чаще человеческого,  но в некоторых случаях и бычьего типа. В очень редком числе случаев  бывают случаи инфицирования прочими разновидностями микобактерий.

Заражение происходит чаще всего воздушно-капельным путем, есть риск заражения и при употреблении молока/мяса больных животных. 

Микобактерии очень жизнеспособны и во внешней среде сохраняются годами.  Чаще всего у взрослых заболевание поражает легкие, однако не редкость и внелегочной туберкулез (туберкулез кожи, глаз, костей, мочеполовой, туберкулезный менингит). У детей чаще туберкулез начинается  с туберкулеза лимфатических узлов, высок риск внелегочных форм, большая опасность развития генерализованных и тяжелых форм  - милиарный туберкулез, туберкулезный менингит.

 Для того что бы немного разобраться в методах диагностики туберкулеза надо пояснить как развивается инфекционный процесс и каковы особенности туберкулезной инфекции. Микобактерии являются внутриклеточными патогенами. Они поглощаются макрофагами и продолжают внутри наших клеток жить и даже размножаться. Пораженные макрофаги пытаются активировать воспалительный процесс и ограничить место инфекции, что приводит к скоплению клеток вокруг возбудителя – образование гранулемы и очага (очагов) поражения.  Активированные иммунокомпетентные клетки выделяют ферменты, свободные радикалы, протеазы, призванные  уничтожить микобактерии, но в случае микобактерий может случиться так, что будут поражены собственные ткани в большей степени, а микобактерии продолжат размножаться. Этот механизм является частью гиперчувствительности замедленного типа, реакции клеточного иммунитета.  Антитела в организме человека в первую очередь вырабатываются на внеклеточные агенты. И в случае туберкулеза микобактерии недосягаемы для антител. 

Лабораторная диагностика туберкулеза. 

Микробиологические методы диагностики туберкулеза: Выделение самой микобактерии из мокроты, мочи либо других секретов является важной частью диагностики туберкулеза. Однако выделение микобактерий происходит только когда в результате активного заболевания очаг уже разрушен, ткани повреждены и размножающиеся микобактерии из очага  поступают во внешнюю среду  (открытая форма туберкулеза).  Но даже при наличии активного заболевания в открытой форме микобактерий в материале может быть слишком мало для обнаружения ее путем посева или микроскопии. 

Диагностическая ценность антител к туберкулезным микобактериям. Как мы уже выяснили ранее, антитела при туберкулезе не играют важной защитной роли, и в процессе иммунологического ответа участвуют мало. Концентрация антител не отражает ни формы заболевания, ни его активности, ни напряженности иммунитета. По данным разных авторов значимый титр антител появляется только у 50-70% пациентов с  явным активным туберкулезом. Даже наличие бактериовыделения не является гарантом  положительного анализа.  Несмотря на то, что есть множество тестов на антитела к возбудителю туберкулеза российского и европейского производства, применять эти тесты для ранней диагностики, для скрининга туберкулезной инфекции нет никакого смысла.

ПЦР-диагностика туберкулеза. Метод ПЦР основан на выделении генетической информации конкретного возбудителя. ПЦР может показать, что частицы ДНК микробного (вирусного) агента есть в анализируемой жидкости, даже если сам микрорганизм погиб, либо его критически мало в материале. Метод ПЦР является  способом диагностики туберкулеза. Так ПЦР мочи может быстро и точно доказать открытый мочеполовой туберкулез. ПЦР секретов, жидкостей, тканей после биопсии лимфоузла или органа поможет диагностировать сложные случаи внелегочного туберкулеза. ПЦР  в мокроте докажет открытую форму туберкулеза на самой ранней стадии, при минимальном бактериовыделении, который не удается выявить микроскопией или высевом. Однако при использовании ПЦР в качестве скрининга или ранней диагностики туберкулеза возникает закономерный вопрос: что хотят найти и что хотят исследовать? При ранних формах туберкулезной инфекции выделения микобактерий еще не будет ни в какой форме. Процесс при туберкулезе очаговый и микобактерия размножается в ткани.  Микобактерия может распространяться гематогенным путем – то есть может временно находится в крови  – но только короткий срок сразу после заражения, либо при развитии осложнений и распространения туберкулеза из первичного очага (если речь идет не о туберкулезном сепсисе). Зафиксировать подобное явление - редкая удача. ПЦР мокроты так же не покажет ничего при закрытом процессе, кроме того, собрать мокроту у некашляющего человека, тем более ребенка, невозможно. В сети есть информация, что иногда в таких случаях мокроту заменяют на слюну, но это как минимум бессмысленно. У ПЦР есть еще один минус –  это его крайне высокая чувствительность. При разрушении старого очага  туберкулеза (первичного, прошедшего незамеченным или после излеченного заболевания) другими причинами (опухоль, абсцесс) ПЦР может показать наличие туберкулезной палочки в мокроте (моче), хотя сам процесс не будет туберкулезным, за счет того, что единичные выжившие микобактерии и  их фрагменты сохраняются в очаге. 

Проба Манту (туберкулиновая проба).  Основой  иммунного ответа на туберкулез является клеточная реакция гиперчувствительности, которая развивается с первых недель заражения.  Проба Манту выявляет именно эту иммунную перестройку, связанную с микобактериями. Реакция проявляется очень рано, и не зависит от конкретного очага поражения. Внутрикожно, в область предплечья, вводят препарат  из убитых микобактерий. К этой области начинают стекаться клетки, и если иммунная система уже обучена борьбе  с туберкулезной палочкой, и специфический клон лимфоцитов размножен и активен в данный момент, то реакция (гиперчувствительность замедленного типа) на месте введения будет выраженной. Переход от нормальной к резкоположительной пробе Манту или резкое увеличение реакции при поствакцинальной аллергии является показателем того, что за период между пробами произошло инфицирование. Не все инфицированные дети получат заболевание, все будет зависеть от иммунной системы, генетической предрасположенности, условий жизни. Но сам факт свежего инфицирования является поводом для внимательного наблюдения и обследования ребенка в течении минимум года. 

Манту не вакцина, по своей природе это аллергопроба. Манту не опасна заражением, так как не содержит самих микобактерий. Манту является распространенным и предпочтительным видом скрининга во всем мире из-за возможности выявления ранних форм туберкулеза, а так же  из-за простоты пробы и  низкой стоимости для массовых обследований.  Но конечно и у нее есть недостатки. Абсолютно большинство детей получают прививку БЦЖ  в первые дни жизни и значит уже имеют контакт с вакцинным штаммом туберкулезной палочки.  Иммунная реакция на вакцинный штамм проявляется не-нулевой, но слабоположительной и положительной реакцией на пробу Манту (инфильтрат до 5мм).  У некоторых детей развивается повышенная реакция на микобактерии – поствакцинальная аллергия – при этом проба Манту   будет от 6 до 17 мм.  При поствакцинальной пробе не бывает резкого увеличения пробы Манту со временем (если делать пробу не чаще 2х раз в год), наоборот, год от года реакция снижается. Максимум поствакцинальной аллергии приходиться на возраст около 2 х лет.

  Поствакцинальная аллергия - нормальная реакция организма.  Только правильная оценка папулы/инфильтрата и пигментации на месте введения, знание динамики пробы в прежние годы  и анализ рубчика БЦЖ  может с большой степень достоверности дифференцировать поствакциональную аллергию от свежего инфицирования. При хорошем рубчике от БЦЖ, отсутствии выраженной пигментации и небольшой размер инфильттрата на месте пробы Манту можно предполагать поствакцинальную аллергию.  

Проба Манту может быть неинформативной при снижении реактивности кожи (у детей до 6 месяцев например, или ввиду индивидуальных особенностей). Проба будет всегда отрицательной при первичном клеточном иммунодефиците и СПИДе. Иногда при  активном туберкулезном процессе проба Манту может не показать процесс, либо наоборот вызвать серьезное ухудшение общего состояния и подъем температуры, поэтому важно регулярное ежегодное обследование. 

Диаскин тест

Относительно новый  (по сравнению с пробой Манту)тест, набирающий популярность.  Аналог пробы Манту. Не будем писать много о нем, так вся теоретическая часть полностью аналогична пробе Манту, а серьезные независимые исследования его диагностической эффективности автору этой заметки пока еще не встретились. Диаскинтест так же является аллергопробой, выявляющей иммунную перестройку, которая характерна для микобактериальной инфекции. Однако, в отличии от пробы Манту, в качестве аллергена вводят очищенные, приготовленные с применением высокотехнологичных методов аллергены микобактерий туберкулеза человека.  Поэтому, по заявление его авторов, диаскинтест не реагирует на вакцинацию БЦЖ, а только на инфицирование микобактерией человека. Поэтому его рекомендуют для дифференциальной диагностики поствакцинальной аллергии.

Интерфероновый тест in vitro на туберкулез. Примером является квантифероновый тест in vitro (инвитро) (Quantiferon). Подобные тесты есть в разных вариантах.   Квантифироновый тест являет in vitro (пробирочным) аналогом пробы Манту. Лимфоциты тем или иным образом выделяют из крови (для этого берут 3-5 мл крови из вены) и подвергают контакту с микобактериями или их продуктами. Лимфоциты, которые уже знакомы  с микобактериями, активно реагируют на этот контакт и выделяют гамма-интерферон (кроме известной противовирусной активности, этот цитокин является главным продуктом активации клеточного иммунитета). Пик секреции гамма-интерферона показывает наличие специфичных к туберкулезу лимфоцитов.  Секрецию интерферона регистрируют в Elispot в классическом квантифероновом тесте,  в других модификациях - цитометрией, ИФА. Тест представляется очень перспективным, уже используется в зарубежных странах, есть и в России. На данный момент ряд авторов говорит о высокой специфичности (высокая достоверность положительного результата, выше чем при пробе Манту),  низком уровне сомнительных результатов (что является плюсом, результаты по этому показателю лучше, чем у  Манту), но низкой чувствительности (степень доверия отрицательному результату), которая очень сильно зависит от модификации метода, качества проведения анализа. По чувствительности тест пока  уступает пробе Манту, что принципиально  для скрининга. Квантерфероновый (интерфероновый) тест при туберкулезе, так же как и проба Манту не может отличить латентную инфицированность от активного заболевания. Этот тест пока не рекомендуют для самостоятельной диагностики.   Научную информацию можно найти здесь и здесь

Близкие по теме новости: 

 

www.proimmunitet.ru

Квантифероновый тест

План статьи: 1. Что такое квантифероновый тест? 2. Особенности диагностического метода 3. Показания к применению 4. Расшифровка 5. Достоинства и недостатки

Квантифероновый тест – усовершенствованный метод диагностики туберкулеза, разработанный с целью замены устаревших реакции Манту и Диаскинтеста. Туберкулез распространен повсеместно, его возбудители отдельные представители микобактерий (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum), поэтому внедрение новых экспресс методов анализа неизбежно.

Туберкулезная инфекция передается воздушно-капельным и контактным способами, но не всегда вызывает заболевание. Иммунная система здорового человека способна справиться с возбудителями, но иногда часть бактерий сохраняется в организме в скрытом виде и, при удобной возможности, активизируется, вызывая симптомы поражения. Любой человек здоровый на вид может выступать носителем туберкулезной инфекции в неактивной форме. Возбудитель в этом случае не передается другим людям, но переход заболевания из латентного состояния в активное может случиться в любой момент. Кожные пробы Манту и Диаскинтест обладают рядом ограничений к проведению. В отличие от этих методов квантифероновый тест практически не имеет противопоказаний.

Что такое квантифероновый тест?

В клиниках Европы для диагностики туберкулеза используют в основном квантифероновый тест, который имеет явные плюсы перед архаичными кожными методами. В отличие от кожных тестов при проведении данного способа анализируется венозная кровь на туберкулез. Что такое квантифероновый тест? При проведении данного анализа оценивается концентрация специфического гамма‑интерферона – маркера инфицирования организма туберкулезными микобактериями, который высвобождается из Т-клеток после их стимуляции специфическими протеинами возбудителей.

Забор крови для тестаКвантифероновый тест позволяет подтвердить или опровергнуть наличие туберкулезной инфекции. Его применение дает возможность:

  1. Выявить скрытую туберкулезную инфекцию.
  2. Регулярно исследовать человека, контактирующего с больными, например, работников медицинских учреждений.
  3. Проводить анализ при наличии противопоказаний для кожных туберкулиновых тестов.
  4. Быстро обследовать иммигрантов на наличие возбудителя.

Особенности диагностического метода

Забор крови производится натощак, требуется минимум 8 ч паузы после приема пищи. Процесс исследования включает 3 пробирки для достижения четкого результата, отсекания ложных положительных и отрицательных проб.

Квантифероновый тест проводится по достаточно сложной методике. Первая и третья пробирка выполняют функции отрицательного и положительного контроля. В пробу 1 вносят гепарин, в норме там не должно быть много гамма-интерферона. В пробирку 3 (Mitogen) вводят фитогемагглютинин для стимуляции выделения интерферона. Эти две пробы позволяют установить нормальную реакцию иммунных клеток в плане вырабатывания гамма-интерферона. Во вторую пробирку вносят микобактериальные антигены. Если инфицирование организма есть, то будет повышенная выработка маркера. Метод позволяет оценить результат с помощью индивидуальных контрольных значений человека.

Три пробиркиКвантифероновый тест не позволяет провести дифференцировку латентного и активного туберкулеза, хотя по симптоматике эти 2 формы недуга отличить несложно. Выделяют 3 варианта результата анализа: отрицательный, сомнительный и положительный. В случае последнего выдается направление к фтизиатру, который решает, какие действия пациенту нужно предпринять.

Уровень гамма-интерферона не показывает степень инфицирования и стадию болезни, а также активность иммунной системы человека и, соответственно, вероятность перехода туберкулеза из скрытой в активную форму.

Показания к применению

В России квантифероновый тест для анализа наличия туберкулезной инфекции практически не используется. Считается, что большая часть населения является носителями возбудителей, но только у 2% развивается активная фаза, поэтому данный метод анализа будет показывать положительный результат крайне часто.

Если обнаруживается положительный квантифероновый тест у ребенка, то его все равно сравнивают с пробой манту. Данный метод анализа позволяет обследовать детей с сильными реакциями на кожные тесты. Есть данные, что оценка гамма-интерферона может не дать точного результата у детей в 16% случаев, поэтому его проводят после положительных кожных тестов.

Данный анализ – полноценная замена Манту или Диаскинтеста, может применяться для уточнения сомнительных данных кожных анализов.

При каких противопоказаниях можно применять исключительно квантифероновый метод?

  1. Непереносимость туберкулина.
  2. Обострение кожных болезней и аллергии.
  3. Повышенный риск появления мощной аллергической реакции.
  4. Обострение инфекционных болезней.
  5. Васкулиты любой разновидности (воспаления кровяных сосудов).
  6. Эпилепсия.

Обострение инфекционных болезней

Расшифровка

Что показывает результат квантиферонового теста в зависимости от концентрации гамма‑интерферона? При отрицательных итогах наличие туберкулезного возбудителя в организме полностью не исключается. Ложные отрицательные результаты могут возникать при:

  1. Иммунодефицитах.
  2. Нарушении предварительной подготовки перед забором крови.
  3. Ранних сроках туберкулеза.

Иногда ложный отрицательный результат отмечается у детей до 5 лет. Сомнительный результат обнаруживается при чувствительности к ТВ-антигену и нарушении предварительной подготовки.

В 3 пробирках используются разные методы анализа, поэтому расшифровка квантиферонового теста включает 3 значения и итоговый результат. Отрицательный результат и нормальную реакцию организма в плане вырабатывания гамма‑интерферона устанавливают, если маркера обнаруживается:

  1. Менее 8 нг/мл в контрольной пробирке (NIL).
  2. Менее 0,35 нг/мл во второй пробе с ТВ-антигеном. Допускается превышение, но цифра должна быть 25% от NIL.
  3. Более 0,5 нг/мл в образце с добавлением митогена.

Достоинства и недостатки

Квантифероновый тест в 6 раз чувствительнее пробы Манту. Анализ не реагирует на БЦЖ (вакцину против туберкулеза), то есть у такого пациента не будет ложноположительного результата. Основные преимущества анализа:

  1. Наивысшая специфичность и чувствительность (89-99%).
  2. Отсутствие противопоказаний и побочных реакций.
  3. Безопасность проведения.
  4. Более объективная интерпретация результатов по сравнению с кожными тестами.

В отличие от европейских стран квантифероновый тест в России не причислен к категории обязательных анализов. Методика проводится только в платном формате, поэтому используется только в крайнем случае.Ложный отрицательный результат встречается в 11% случаев, но это хороший итог, так как нет диагностических решений для 100% определения наличия или отсутствия инфицирования. Однозначно точный ответ тест дает в случае инфицирования организма M. tuberculosis. Положительный квантифероновый тест необязательно свидетельствует о заражении организма туберкулезными микобактериями, «виновниками» такого итога могут быть другие возбудители (M. kansasii, M. marinum, M. szulgai).

M. tuberculosis

Кратко — недостатки теста:

  1. Вероятность появления ложного отрицательного результата.
  2. Положительный результат в результате активности нетуберкулезных микобактерий. Туберкулеза нет, а анализ показывает обратное. Такой результат встречается и при проведении Манту или Диаскинтеста.
  3. Провести анализ можно далеко не в любом городе.
  4. Стоимость колеблется от 1500 до 4500 руб, что достаточно дорого.

Квантифероновый тест на туберкулез во многих странах, в том числе государствах на территории СНГ ориентирован на дополнительную оценку детей с целью опровержения или утверждения возможного положительного результата. Поэтому проба Манту будет еще долго основным способом проверки инфицирования человека туберкулезными микобактериями.

vlegkih.ru

Квантифероновый тест на туберкулез - как и где сделать

На сегодняшний день квантифероновый тест представляет собой самый современный метод обследования на туберкулез, используя мощности лабораторий.

Основные показатели к  проведению диагностики

Нужно ли говорить, что только своевременно выявленное заболевание позволяет облегчить лечение. Именно по этой причине, квантифероновый тест на туберкулез  позволяет на ранних сроках определять  и приступить к лечению, достигая высоких результатов.

Квантифероновый тест на туберкулез представляет собой надежный современный метод по диагностике и раннему выявлению  этого заболевания.  Стоит сказать, что высокая эффективность в прогнозировании, были оценены и приняты к использованию в более чем в 17 странах.

Выявленное на самых ранних сроках заболевание поддается лечению с минимальными затратами. Именно это позволяет  сделать квантифероновый тест на туберкулез. Для его выполнения потребуется сдать на исследование только венозную кровь. При этом основным требованием является сдача крови на тест является выполнение утром натощак. Причем между последним приемом пищи должно пройти не менее 8 часов.

При помощи квантиферонового теста есть возможность произвести измерение иммунитета, а так же проверяется  уровень Т-лимфоцитов, отличающихся высокой чувствительностью к микобактериям туберкулеза. Это позволяет не только своевременно выявлять начало инфекционного заражения,но и разработать методику эффективного лечения.

Основной принцип выполнения теста заключается в том, что при попадании в организм человека бактерий, способных вызвать туберкулез, могут возникать реакция сенсибилизированных Т-лимфоцитов.

Где они начинают  взаимодействовать с антигенами этого заболевания. При этом вырабатывается вещество под названием интерферон-гамма. Это позволяет проводить различные виды исследований, которые в конечном итоге позволят осуществить на основе измерения количества вещества и его реакции с антигеном получить информацию о наличии или отсутствии в организме болезни.

В процессе диагностики будут использоваться различные антигены, относящиеся непосредственно к развитию в организме туберкулезной палочки. Именно это  дает квантифероновому тесту стать более объективным, в отличие от кожных проб. При нем не возникают ложноположительные результаты, даже при наличие в организме не туберкулезной инфекции.

Как проводится тестирование на туберкулез

Во время проведения квантиферонового теста на туберкулез, появление положительного результата буде говорить о том, что  в организме имеется:

  • развивается активная форма заболевания;
  • проходит латентная форма болезни.

Получение отрицательного результата может говорить о том, что:

  • в организме нет этого заболевания;
  • о том, что происходит реверсия – перерождение микобактерий, когда они из спящего состояния переходят в жизнеспособный режим.

Это может оказать воздействие на конечный результат, особенно если исследователи не будут обращать внимание на время, прошедшее с момента заражения и то состояние, в котором находится иммунная система человека. Такое обследование позволит  человеку получить исчерпывающие ответы на свои вопросы.

Проводимый в лаборатории квантифероновый тест на туберкулез позволить определить какую реакцию иммунных клеток, может дать  проводимое исследование. В отличи от проводимых иных видов анализов, квантифероновый имеет два основных отличия:

  • проверка реакции проходит не на коже пациента, а в пробирке;
  • могут быть использованы 3 и более антигенов туберкулезной палочки.

Причем, применяемые антигены не всегда будут применяться при изучении анализов. В том числе и в вакцине БЦЖ. Это позволяет избежать проявления положительного результата на пробу у прошедших прививку детей, чем  не может похвастаться реакция Манту.

Если при обработке пробы будет получен положительный квантифероновый тест, то это позволит с уверенностью сказать, что:

  • в организме имеется туберкулезная палочка в латентной стадии. Это означает, что сама болезнь никак себя не проявляет;
  • наличие в организме возбудителя туберкулеза, находящегося в активной стадии развития процесса.

Эффективность этого метода заключается в том, что использование теста даст возможность выяснять ли в организме инфекция или нет. Исследователь получает ответы на вопросы, связанные с определением уровня инфицирования. Заболевание может находиться в первичной, латентной, активной или полностью пролеченной форме.

Это позволит определить чувствительность квантиферонового теста.  Такое изучение позволит получать отрицательный результат, даже при начале или развитие заболевания. Тест может быть проведен для каждой категории в отдельности. Причем больные распределяются по  категориям и полученный результат  усредняется. Это позволяет выявить наиболее эффективный метод выявления туберкулеза.

Загрузка...

testanaliz.ru

Анализ на туберкулез — Какие анализы нужно сдавать на туберкулез, симптомы

Развитие болезни туберкулеза (ТБ), является двух этапным процессом. Первый этап, известный как латентный ТБ, человек инфицирован туберкулезными бактериями, без клинических проявлений. Второй этап, известный как активное заболевание, когда бактерии воспроизвели достаточное количество себе подобных, и вызывают ТБ человека. С целью предотвращения второго этапа, необходимо выполнить анализ на туберкулез.

Виды анализов

Для диагностики туберкулеза существует несколько тестов. Некоторые анализы предназначены для латентного ТБ, другие — для активного ТБ, а некоторые — для обоих. Имеются также варианты, чтобы выяснить, есть ли у кого-то туберкулезные бактерии, восприимчивые к лечению или резистентные к лекарственным средствам. Анализы с лекарственной устойчивостью, известны как анализы на лекарственную чувствительность. Даже если у человека есть симптомы болезни, часто бывает трудно диагностировать это, а особенно трудно, сделать это быстро. Быстрая диагностика — это то, что необходимо для эффективного лечения туберкулеза с лекарственной устойчивостью. Некоторые анализы на туберкулез, такие как кожный тест, реагируют непосредственно на туберкулезные бактерии. Другие, такие как рентген грудной клетки, показывают эффект бактерий на человека, подозреваемого в наличии ТБ.

Точность тестов на туберкулез

Некоторые анализы туберкулеза занимают много времени, чтобы получить результат, а некоторые не очень точны. Они имеют либо низкую чувствительность (способность правильно определять людей с ТБ), и / или низкую специфичность (способность правильно определять людей, у которых нет ТБ).

Если анализ имеет низкую чувствительность, то будет значительное количество «ложных негативов», и результат теста покажет, что у человека нет туберкулеза, когда он действительно есть. Точно так же низкая специфичность, покажет значительное количество «ложных подтверждений», указывающих, что у человека есть туберкулез, когда на самом деле его нет.

Наиболее точные анализы, как посев культуры, занимают много времени. Другие также очень дороги и требуют сложных лабораторных установок.Кожный тест на ТБ.

Кожный тест (тест Манту) является широко используемым для диагностики. В странах с низкими показателями заболеваемости туберкулезом часто используется для тестирования скрытой инфекции. Проблема с его использованием в странах с высоким уровнем распространения заболевания заключается в том, что у большинства людей может быть скрытый туберкулез.

Кожный тест включает в себя инъекцию небольшого количества жидкости (называемой туберкулином) в кожу в нижней части руки. Затем человек должен вернуться через 48-72 часа, чтобы обученный медицинский работник посмотрел место введения пробы. Работник здравоохранения будет искать плотное возвышение над кожей или опухоль, и если она есть, то они будут измерять ее размер. Результат анализа, зависит от размера возвышения. Чем больше размер пораженного участка, тем выше вероятность, что человек был инфицирован бактериями в прошлом. Этот анализ также не может определить, имеет ли человек латентный ТБ или активный.

Пробы для определения гамма — интерферона (IGRA)

Интерферон гамма выпуска (IGRA), является новым типом более точного исследования, для которого необходимо сдать кровь на туберкулез.IGRA — это тест, для которого сдается анализ крови на туберкулез, и определяется иммунный ответ человека на бактерии. Иммунная система производит некоторые специальные молекулы, называемые цитокинами. Эти тесты, обнаруживают цитокин, называемый цитокином гамма-интерферона. На практике пациенту необходимо сдать анализ крови на туберкулез. После кровь смешивают со специальными веществами для определения присутствия цитокина.

Преимущества теста IGRA включают в себя тот факт, что для проведения исследования сдаются анализы один раз и требуется только одно посещение. Результаты могут быть доступны в течение 24 часов, и до вакцинации БЦЖ не вызывает ложно положительный результат.

Микроскопия мокроты как тест на туберкулез

Микроскопия мокроты часто является первым тестом болезни, который используется в странах с высоким уровнем инфекции. Мокрота — это густая жидкость, которая образуется в легких и дыхательных путях, ведущих к легким. Мокроту обычно собирает больной.

Для тестирования обычно собирают несколько образцов мокроты. В 2012 году было предложено собрать два образца в один и тот же день без потери точности.

Для проведения исследования очень тонкий слой образца помещают между предметными стеклами, и это называется мазком. Затем к образцу прикладывают серию специальных красителей, и окрашенный предметный знак исследуют под микроскопом на наличие признаков микобактерий.Микроскопия мазка мокроты является недорогой, простой, и людей легко обучить делать это относительно быстро и легко. Главное, как пациент сдав мокроту на анализ, результаты получает в течение нескольких часов.

Серологические тесты на туберкулез

С целью серологической диагностики необходимо сдать пациенту анализ крови, чтобы пройти тест на туберкулез. Проводятся с образцами крови, и могут диагностировать ТБ, обнаруживая антитела в крови. Недостатком является очень сложное обнаружение антител к микобактериям в крови.Флуоресцентная микроскопия.

Использование флуоресцентной микроскопии — это способ сделать более точным анализ мокроты. С помощью флуоресцентного микроскопа мазок освещается кварцевым галогеном или ртутной лампой высокого давления, что позволяет увидеть весьма большую площадь мазка и в результате ускорить исследование образца.

Недостатками является: ртутная лампа является дорогостоящей, требует времени для прогрева, сжигает значительное количество электричества, короткий срок их службы. Способ преодоления недостатков, является использование светоизлучающих диодов (светодиодов). Они включаются чрезвычайно быстро, имеют чрезвычайно долгий срок службы и не взрываются.

Рентген грудной клетки

Основной метод выявления туберкулеза. Выполняется планово в течении всего периода жизни человека. При данном методе происходит облучение рентгеновскими лучами грудной клетки. После проявления снимка, врач специалист проводит диагностику на туберкулез, и другие заболевания органов грудной полости.

При активном туберкулезе легких — уплотнения, инфильтраты, полости, часто наблюдаются в верхних долях легких. Возможны, медиастинальная, внутригрудная лимфаденопатия или плевральные выпоты (туберкулезный плеврит).

Аномалии на рентгенограммах грудной клетки могут быть наводящими на размышления о туберкулезе, но не обязательно диагностическими. Снимки грудной клетки могут быть использованы для исключения возможности легочного туберкулеза у человека, который имеет положительную реакцию на туберкулиновый тест кожи и никаких симптомов болезни.

Какое исследование лучше?

Не существует единого теста, использование которого, могло решить диагностику туберкулеза. Большинство тестов дешевле, но не очень точны. Некоторые из них, использоваться только для тестирования на бактерий. Другие, такие как, тест на культуру микобактерий, могут быть использованы для диагностики туберкулеза, а также протестировать некоторые виды резистентности к лекарственным препаратам.

Похожие статьи

Загрузка...

medtub.ru

Тест на интерферон-гамма-анализ эффективности плевральной жидкости и периферической крови при плевральном туберкулезе

Interferon-Gamma Release Assay Performance of Pleural Fluid and Peripheral Blood in Pleural TuberculosisИсточник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3873962/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: ZZ MG FL. Проводили эксперименты: FL XZ FD. Проанализированы данные: FL MG ZZ. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: FD HJ XY. Написал рукопись: FL MG. Собранные данные: LZ LM XW LX ZW.

Диагноз туберкулеза плевры (ТБ) остается сложным. Анализ интерферон-гамма-релизов (IGRA) является перспективным методом диагностики туберкулеза в странах с низким уровнем туберкулеза. Выделение интерферона-гамма (IFN-γ) Т-лимфоцитами увеличивается в локализованном месте заражения антигеном Mycobacterium tuberculosis. Это исследование предназначалось для изучения клинической точности T-SPOT.TB на плевральной жидкости и периферической крови для диагностики туберкулеза плевры в стране с высоким уровнем ТБ.

168 субъектов с плевральным выпотом были проспективно проспективно изучены с T-SPOT.TB на образцах плевральной жидкости и периферической крови одновременно.

Кривая работоспособности приемника (ROC) и значение отсечки плевральной жидкости T-SPOT.TB были установлены в соответствии с пятнообразующими клетками (SFC) между культивируемой / биопсийной группой плевральной туберкулины и без плевральной туберкулезной группы. Чувствительность плевральной жидкости T-SPOT.TB и периферической крови T-SPOT.TB была сходной (96,3% и 92,7% соответственно) (P = 0,691). Напротив, специфичность плевральной жидкости T-SPOT.TB (94,5%) была значительно выше, чем у T-SPOT.TB периферической крови (76,1%) (P = 0,002). 2% (2/98) результатов плевральной жидкости T-SPOT.TB были неопределенными.

Диагностическая точность T-SPOT.TB периферической крови низкая в странах с высоким уровнем туберкулеза из-за латентной туберкулезной инфекции. Плевральная жидкость T-SPOT.TB является относительно полезным и дополнительным тестом для изучения плеврального туберкулеза в странах с высоким уровнем ТБ, но его диагностическая точность должна быть подтверждена в ходе дальнейших масштабных исследований.

Туберкулез (ТБ) является основной причиной смерти от излечимого инфекционного заболевания. Ежегодно в развивающихся странах с высоким бременем сообщается от восьми до десяти миллионов новых случаев ТБ (Who, 2011). В Китае ежегодно сообщается о 4,99 миллионах новых случаев активного туберкулеза (АТБ) в соответствии с пятым общенациональным обследованием ТБ в 2010 году. ТБ является основной причиной плевральных жидкостей (ПФ) в районах с высокой распространенностью ТБ и может составляют 25% всех плевральных выпотов [1]. Ежегодно во всем мире происходит более полумиллиона случаев плеврального выпота, вызванного туберкулезом [2]. Ранняя и точная диагностика плеврального туберкулеза остается проблемой из-за трудностей в дифференциальной диагностике между плевральным туберкулезом и злокачественным выпотом плевры. Неисправность плеврального туберкулеза приводит к неправильному лечению пациентов, вызывая ненужные страдания пациента. Хотя культура бактерий и гистология являются золотым стандартом диагностики плеврального туберкулеза, низкое содержание бактерий в PF приводит к нечувствительности окраски Ziehl-Neelsen и бактериальной культуры [3,4]. Обычная биохимическая и клеточная характеристика ПФ не имеет специфичности [5]. В настоящее время биопсия плевральной ткани широко считается прямым методом подтверждения диагноза. Однако биопсия плевры инвазивна, зависит от оператора и технически сложна (особенно у детей) [6]. До настоящего времени аденозиндезаминаза (АДА), фермент, связанный с активностью Т-лимфоцитов, является наиболее рентабельным маркером ПФ и обычно используется в условиях высокой распространенности. Однако некоторые исследования показали, что чувствительность ADA была ниже для диагностики туберкулеза плевры. Увеличение ADA также может наблюдаться при других видах инфекции, злокачественных заболеваниях и ревматических заболеваниях. и лимфопролиферативные расстройства и, следовательно, не являются специфическими для плеврального туберкулеза [7,8]. Поэтому срочный, точный диагностический тест срочно необходим для плеврального туберкулеза.

В последнее время анализы на экспрессию интерферона-γ (IGRA) все чаще используются для определения ответа IFN-γ на специфические антибиотики Mycobacterium tuberculosis, раннюю секреторную антигенную мишень 6 (ESAT-6) и протеин 10 фильтрационного фильтрата (CFP-10). Гены, кодирующие эти антигены, присутствуют в Mycobacterium tuberculosis, но отсутствуют штамм BCG и большинство штаммов микобактерий (NTM), не относящихся к туберкулезу [9]. В странах с низким уровнем туберкулеза IGRA считаются альтернативными полезными инструментами для диагностики активного туберкулеза. Однако в странах с высокой распространенностью туберкулеза случаи скрытой туберкулезной инфекции (ЛТБИ) чрезвычайно высоки, что неизбежно скажется на диагностической точности периферической крови (ПБ) IGRA. Таким образом, этот анализ является сомнительным как диагностический маркер в странах с высоким уровнем ТБ [10,11].

Во время активного ТБ микобактерий-специфичные Т-клетки размножаются и набираются в место заражения, где количество эффекторных Т-клеток намного выше, чем у ПБ [12,13]. Jafari et al. продемонстрировал, что активный туберкулез легких может быть быстро подтвержден с помощью ELISPOT-анализа в бронхоальвеолярной лаважной жидкости при отрицательной мазке, в то время как в другом исследовании, проведенном 36 пациентами с ПФ в регионе с промежуточным заболеванием туберкулеза (Южная Корея), предложен PF T-SPOT. ТБ может быть самым полезным тестом среди анализов на экспрессию интерферона-гамма [14,15]. Будь PB T-SPOT.TB и PF T-SPOT.TB могут быть полезными инструментами для диагностики плеврального туберкулеза в странах с высоким уровнем ТБ, остается неясным.

В этом исследовании мы исследовали IGRAs на основе ELISPOT (T-SPOT.TB), применяемые как к ПФ, так и к ПБ, полученным от пациентов с плевральным выпотом, чтобы оценить диагностическую эффективность этого анализа для диагностики туберкулеза плевры в Китае.

Это исследование получило этическое одобрение Комитета по этике Пекинской грудной больницы, столичного медицинского университета. Информированное согласие было получено от всех участников в письменной форме.

Это проспективное исследование было проведено в Пекинской больнице грудной клетки. В общей сложности 168 пациентов с плевральным выпотом неопределенной этиологии были зачислены с мая 2012 года по июнь 2013 года. Пациенты были протестированы с PB T-SPOT.TB и PF T-SPOT.TB при зачислении. Медицинские записи были собраны по возрасту, полу, основному заболеванию, результатам лечения шрамов БЦЖ и ВИЧ-инфекции. Проводились также клинические, микробиологические, гистопатологические и биохимические исследования ПФ и образцов мокроты. Лица были исключены, если они имели предыдущую историю болезни туберкулеза и историю контакта с туберкулезом, или они получили противотуберкулезную терапию до регистрации. Основные клинические характеристики набранных субъектов были обобщены в таблице 1. В общей сложности 70 пациентов были исключены из исследования из-за отсутствия подтвержденного диагноза, среди которых у 58 пациентов был клинический ТБ без признаков культуры или биопсии. (Рисунок 1).

Сокращения: туберкулез, туберкулез; ADA, аденозиндезаминаза; LDH, лактатдегидрогеназа; CRP, C реактивный белок.

* Тест Rivalta: используется в качестве теста на прокол для дифференциации экссудата и транссудата.

Всего было привлечено в общей сложности 168 пациентов с неопределенным PF, 98 были включены в окончательный анализ (у этих пациентов были парные PB T-SPOT.TB и PF T-SPOT.TB). Туберкулез, туберкулез плевры; нет туберкулеза, нет плеврального туберкулеза (окончательный диагноз исключал плевральный туберкулез).

Окончательный диагноз был основан на клинических проявлениях, бактериологических, биохимических исследованиях, гистопатологическом исследовании. Наконец, всем пациентам поставили диагноз: (1) подтвержденный культурой / биопсией туберкулез плевры: если были сделаны окончательные диагнозы на положительную культуру M. TB от PF или наличие казеитной гранулемы в образце плевральной биопсии; или (2) нет плеврального туберкулеза: другие диагнозы, кроме туберкулеза, были сделаны с помощью микробиологических, гистопатологических и серологических исследований.

Тест T-SPOT.TB (Oxford Immunotec Ltd., Abingdon, UK) проводился в соответствии с инструкциями производителя. 6 мл образца гепаринизированного ПБ и 50 мл образцов ПФ собирали в течение 2 ч после сбора. Для анализа PF T-SPOT.TB образцы центрифугировали при 4000 об / мин в течение 10 мин. Супернатанты отбрасывали и осадки ресуспендировали в 5 мл фосфатного буфера, последующие процессы были такими же, как для теста с использованием образцов крови. Мононуклеарные клетки PF (PFMC) и PB (PBMC) выделяли и доводили до концентрации 2,5 × 106 / мл, а затем инокулировали двумя антигенами (ESAT-6 и CFP-10). Процедуру проводили на планшетах, предварительно покрытых антителами против интерферона-γ при 37 ° С в течение 16-20 часов. После применения второго антитела, конъюгированного с щелочной фосфатазой и хромогенного субстрата, количество клеток с формированием пятен (SFC) в каждой лунке автоматически подсчитывали с помощью системы CTL ELISPOT (CTL-ImmunoSpot® S5 Versa Analyzer, США).

Мы получили новое значение отсечки ПФ, используя анализ характеристической кривой приемника (ROC) в соответствии с SFC между культурой / биопсией, подтвержденной группой плевральной туберкулины, и группой плевральной ТБ (рисунок 2). Результаты PF T-SPOT.TB считались положительными, если после вычитания количества SFC в отрицательной контрольной скважине было подсчитано более 54 пятнообразующих клеток (SFC), и если общее количество SFC было по меньшей мере вдвое больше количества SFC в отрицательный контроль хорошо. Результаты считались отрицательными, если они не соответствовали определению для положительного результата, то есть если было подсчитано менее 54 SFC после вычитания количества SFC в отрицательной контрольной скважине или если общее количество SFC было меньше, чем в два раза больше SFC в отрицательной контрольной скважине. Результаты были определены как неопределенные (1), если положительный контроль потерпел неудачу (2), если в лунках было высокое фоновое обесцвечивание, исключающее значимую оценку пластины.

Горизонтальная линия в графике рассеяния означает медиану пятнообразующих клеток. SFC, пятнообразующие клетки; Туберкулез, туберкулез плевры; нет туберкулеза, нет плеврального туберкулеза.

Изготовителем был рекомендован диагностический критерий PB T-SPOT.TB для положительного, отрицательного и неопределенного результата.

Обработка образцов: все образцы для диагностики туберкулеза плевры были обработаны с использованием стандартных методов и процедур в соответствии с Руководством Ассоциации по борьбе с туберкулезом в Китае [16]. Образцы с твердой плевральной тканью гомогенизировали и затем дезактивировали 4% -ным NaOH в течение 10 мин. 50 мл образцов PF центрифугировали при 4000 об / мин в течение 10 мин. Супернатанты отбрасывали и осадки ресуспендировали в 2 мл фосфатного буфера. Микобактериальные культуры проводили путем инокуляции полученной суспензии и обработанной твердой плевральной ткани образцов на твердые среды L-J (Lownstein-Jenson, L-J). Если доказано, что культура микобактерий является положительной, необходимо идентифицировать штамм для идентификации Mycobacterium tuberculosis (M.TB).

Плевральная биопсия была выполнена, если возможно, плевральная ткань была представлена ​​в гистопатологическое исследование и кислотоустойчивое окрашивание бактерий (AFB). Диагноз подтвержденного плеврального туберкулеза был сделан, если образцы показали казеозную гранулему.

Непрерывные переменные сравнивались с использованием непараметрического теста Манна-Уитни U. Кривая ROC была построена путем построения скорости чувствительности к скорости (1-специфичности) результатов в диапазоне значений отсечки PF T-SPOT.TB и PB T-SPOT.TB. Индекс Youden использовался для выбора оптимальных точек на кривой ROC (оптимальный баланс между чувствительностью и специфичностью). Сравнение пропорций проводили с использованием теста Chi-squared. Девяносто пять процентов доверительных интервалов (95% ДИ) оценивались в соответствии с биномиальным распределением. Значение было установлено для P

Среди 168 пациентов с PF неопределенной этиологии 55 были диагностированы как подтвержденные культурой / биопсией туберкулез плевры, а 43 были диагностированы как отсутствие плеврального туберкулеза. Клинические характеристики этих 98 пациентов показаны в таблице 1. Средний возраст группы плевральной туберкулины (57) был выше, чем у группы ТБ (39). Было 5 и 4 случая без БЦЖ в плевральной туберкулезной группе и без плевральной туберкулезной группы соответственно, и эти пациенты были из отдаленной сельской местности. Все пациенты в исследовании были отрицательными в тесте на серологию ВИЧ. Главным осложнением был сахарный диабет, но не было существенной разницы в плевральной туберкулезной группе и группе плевральной ТБ. Показатель лимфоцитов, активность аденозиндезаминазы (АДА) и С-реактивный белок (ППР) ПФ в плевральной туберкулезной группе были выше, чем в группе без плевральной ТБ. Распространение туберкулеза пораженных органов, отличных от плевральной ткани, было сильно гетерогенным, в том числе легким, лимфатическим узлом, бронхом, костью, кишечником и брюшиной ТБ (таблица 2).

По сравнению с ПБ использовались различные точки резания в отдельных кузове. Однако определение ПФ, обладающее уникальными физиологическими и анатомическими характеристиками, не было определено. Мы установили новую ROC-кривую PF и определили 216 пятнообразующих клеток (SFC) на миллион PFMC как оптимальную величину отсечки, которая могла бы максимизировать специфичность без значительной потери чувствительности. Площадь под кривой (AUC) PF T-SPOT.TB и PB T-SPOT.TB составляла 0,950 (95% ДИ, 0,901-0,999) и 0,855 (95% ДИ, 0,818-0,952) соответственно.

По сравнению с группой плевральной туберкулеза группа плевральной туберкулеза имела значительно больше SFC в PFMC и PBMC. В группе плевральной туберкулеза в PFMC было больше SFC, чем в РВМС. Однако в группе без плевральной ТБ не было существенной разницы в SFC между PF и PB (рис. 3).

Для группового сравнения с помощью теста Манна-Уитни. ★ Р

Диагностическая характеристика PF T-SPOT.TB и PB T-SPOT.TB для 98 испытуемых представлена ​​в таблице 2. Общая чувствительность PF T-SPOT.TB и PB T-SPOT.TB составила 96,3% (95% ДИ , 84,5% -99,0%) и 92,7% (95% ДИ, 82,7% -97,1%), что свидетельствует о различии в чувствительности между этими двумя тестами. В заметном контрасте специфичность PF T-SPOT.TB (92,9%, 95% ДИ, 81,0% -97,5%) значительно выше, чем у ПТ Т-СПОТ.ТБ (62,8%, 95% ДИ, 47,9% 76,0%). PPV, NPV, LR + и LR- PF T-SPOT.TB составляли 94,5%, 95,1%, 13,481 и 0,040, а соответствующие параметры PB T-SPOT.TB составляли 76,1%, 87,1%, 2,492 и 0,116 (таблица 3 ).

Сокращения: PPV, положительная прогностическая ценность; NPV, отрицательная прогностическая ценность; LR +, отношение правдоподобия для положительного теста; LR-, отношение правдоподобия для отрицательного значения.

* было 1 неопределенный PF T-SPOT.TB результат в группе плевральной туберкулеза и без плевральной группы TB соответственно; a P = 0,691, сравнение PB T-SPOT.TB и PF T-SPOT.TB в группе плевральной туберкулеза; b P = 0,002, сравнение F PB T-SPOT.TB и PF T-SPOT.TB в группе плевральной ТБ.

В терминах результатов PF T-SPOT.TB неопределенная ставка составляла 2,0% (2/98, 95% ДИ, 0,6% -7,1%). Был 1 неопределенный результат в плевральном туберкулезе и без плевральной туберкулезной группы, соответственно. Все неопределенные результаты были вызваны высоким обесцвечиванием фона в лунках, что препятствовало визуализации пятна. В PB T-SPOT.TB не было неопределенного результата.

Мы также сравнили чувствительность и специфичность PF T-SPOT.TB с чувствительностью PF ADA. Мы обнаружили, что хотя существенной разницы в специфичности PF ADA (93%; 40/43) и (92,9%, 39/42) не было. Однако чувствительность (96,3%; 52/54) PF T-SPOT.TB (72,7%, 40/55) значительно выше, чем чувствительность PF ADA.

В этом исследовании мы проспективно исследовали возможное клиническое использование теста T-SPOT.TB, применяемого к PF и PB для диагностики плеврального туберкулеза в области ТБ. Наши данные показывают, что PF T-SPOT.TB, а не PB T-SPOT.TB, является быстрым и точным анализом для диагностики плеврального туберкулеза в странах с высоким уровнем ТБ.

Наше исследование первоначально набирало 168 пациентов с плевральной болезнью, которые обычно наблюдались клиницистами в условиях высокой нагрузки. Впоследствии пациенты, больные с диагнозом плеврального туберкулеза, но не подтвержденные бактериальной культурой и патологией, были исключены из анализа, так как возможно, что клинические перья ТБ вызваны некоторыми другими заболеваниями, такими как плевральная мезотелиома и парапневмонические выпоты. Включение этих субъектов может привести к смещению диагностических показателей T-SPOT.TB. Тем не менее, мы не обнаружили существенной разницы в чувствительности и специфичности PF-SPOT. ТБ между клинически диагностированной плевральной туберкулезной группой и без группы ТБ (данные не показаны). Насколько нам известно, это самое большое исследование для оценки диагностической эффективности IGRA с использованием последовательно завербованных пациентов с подтвержденным культурой / биопсией туберкулезом плевры.

В нашем исследовании чувствительность PB T-SPOT.TB для выявления плеврального туберкулеза соответствовала предыдущим исследованиям, проведенным в странах с низким и средним уровнем заболеваемости туберкулезом [17,18,19]. Однако специфичность нашего PB T-SPOT.TB для выявления плеврального туберкулеза была ниже, чем в исследованиях, проведенных в странах с низким и средним уровнем заболеваемости туберкулезом, в которых сообщалось о специфичности 67,0% -90,5% [15,18,19]. Основная причина низкой специфичности ПБ в нашем исследовании может быть связана с высоким LTBI в контрольной группе. Положительная ставка PB T-SPOT.TB в контрольной группе (ставка LTBI) составила 37,2% (16/43), что соответствует ставке LTBI (44,5%) в общенациональном обследовании ТБ в 2000 году в Китае [ 20,21,22]. На сегодняшний день IGRA является лучшим перспективным тестом для диагностики LTBI, особенно в популяциях, вакцинированных BCG. Однако в Китае не проводилось базового обследования распространенности LTBI, определенного T-SPOT.TB на сегодняшний день.

Чувствительность PF T-SPOT.TB была аналогична чувствительности PB T-SPOT.TB в нашем исследовании. Однако специфичность PF T-SPOT.TB PF была значительно выше, чем у PB T-SPOT.TB. Недавно была отмечена высокая специфичность PF T-SPOT.TB в нескольких исследованиях, проведенных в странах с промежуточным страхованием от туберкулеза, таких как Тайвань и Южная Корея [15,19]. Низкая специфичность PB T-SPOT.TB, возможно, была вызвана тем, что иммунные ответы, анализируемые на PBMC, могли предоставлять только справочную информацию об эффекторной активности Т-клеток в активном ТБ. Лишь меньшинство лимфоцитов в организме человека находится в ПБ, а частота, с которой специфические Т-клетки МТБ встречаются в ПБ, очень низка даже в АТБ [14]. Поэтому было невозможно различать активный туберкулез и LTBI с использованием этих анализов. Относительно высокая специфичность PF T-SPOT. ТБ для плеврального туберкулеза, возможно, обусловлен отделением антигенспецифических эффекторных Т-клеток. Эффекторные Т-клетки можно было набирать и расширять среди лимфоцитов из локализованного участка инфекции туберкулеза, такого как плевральная полость. В соответствии с этой возможностью Wilkinson et al. сообщили, что ESAT-6-специфичные, IFN-γ секретирующие Т-клетки были сконцентрированы в 15 раз в PF относительно их уровня в крови у пациентов с известным плевральным туберкулезом [23]. Поэтому мы предположили, что эффекторные Т-клетки в PF могут быть менее затронуты, чем PB LTBI. Таким образом, ответы IGRA, обнаруженные в PFMC, могли бы обеспечить относительно лучшую дискриминацию ATB от LTBI, чем реакции только на PBMC [24].

В текущем исследовании было обнаружено 2 неопределенных результата в PF T-SPOT.TB из-за высокого обесцвечивания фона в лунках, которые препятствовали визуализации пятна. Туберкулезный плевральный выпот обычно содержит большое количество клеток, белка, участка крови и фибрина, которые могут вызывать высокое обесцвечивание фона. В соответствии с этой возможностью в PB T-SPOT.TB не было неопределенных результатов. По неизвестным причинам наши результаты несовместимы с предыдущим отчетом, в котором объединенная неопределенная скорость PB T-SPOT.TB составляла 8,2%, а неопределенные результаты, как полагали, были обусловлены разным уровнем продукции IFN-γ [25] ,

В нашем исследовании мы обнаружили, что, несмотря на отсутствие различий в специфичности между PF ADA и PF T-SPOT.TB, чувствительность PF ADA значительно ниже чувствительности PF T-SPOT.TB. Есть две возможные причины, которые могут привести к относительно низкой чувствительности ADA. Во-первых, было показано, что некоторые пациенты на ранней стадии плеврального туберкулеза имеют низкий уровень ПФА АДА. Во-вторых, было предложено, что ADA является менее чувствительным маркером плеврального туберкулеза у пациентов с ослабленным иммунитетом [26]. Различные плевральные состояния приводят к повышенному уровню ПФА ADA, при этом преобладают плевральные злокачественные опухоли (особенно лимфомы), ревматоидный плеврит и парапневмонический выпот. В нашем исследовании, среди 3 положительных случаев ADA в группе плевральной туберкулеза, 1 субъект страдает парапневмоническим плевральным выпотом, а два других случая страдают лимфомой [27].

Необходимо устранить ограничения нашего исследования. Во-первых, количество случаев было небольшим, доверительные интервалы наших результатов теста могли быть уже, если бы мы набрали более крупную когорту. Во-вторых, установление кривой ROC и значение отсечки полагалось на SFCs PF и PB в подтвержденном культурой / биопсией плевральном туберкулезе и без плевральной туберкулезной группы. Таким образом, субъекты с LTBI в группе плевральной туберкулины будут влиять на точность. Тем не менее, они не могут быть полностью устранены путем тщательного расследования и экспертизы из-за высокой распространенности LTBI в Китае. В-третьих, мы получаем оптимальное обрезание PF T-SPOT.TB из анализа ROC в этой учебной когорте, а определенная точность PF T-SPOT.TB для диагностики плеврального туберкулеза нуждается в дополнительной когорте валидации.

Наше исследование показывает, что диагностическая точность PF T-SPOT.TB может быть выше, чем у PB T-SPOT.TB, сравнивая отсечки для PF T-SPOT.TB и PB TSPOT.TB. Однако, поскольку обрезание PF T-SPOT.TB было получено из анализа ROC этой когорты, тогда как оценка PB TSPOT.TB была подтверждена, определенная диагностическая ценность PF T-SPOT.TB должна быть доказана дальнейшим крупномасштабная когорта подтверждения [28].

Благодаря всем пациентам, участвовавшим в этом исследовании.

rupubmed.com