1.Общие свойства моноклональных антител. Применение моноклональных антител


1.Общие свойства моноклональных антител

Моноклональные антитела (монАТ), в отличие от поликлональных, являются продуктом секреции одной антитело- продуцирующей клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся в процессе деления этой клетки. Все монАТ, являющиеся продуктом одного клона, представлены идентичными молекулами, отсюда вытекают основные свойства моноклональных антител:

  1. Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковую специфичность, то есть, направлены против одинаковых мест связывания (антигенных детерминант) на каком-либо конкретном антигене, тогда как поликлональная сыворотка имеет в своем составе антитела к разным участкам связывания с антигенам и даже к разным антигенам.

  2. Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковое сродство к связываемому антигену (аффинность), то есть моноклональные антитела бывают высокоаффинными («прочно» связывающие антиген) и низкоаффинные (образующие легко диссоциирующий комплекс с антигеном). Поликлональная сыворотка всегда представлена антителами разной аффинности.

  3. Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют один изотип и субизотип иммуноглобулинов, чего нельзя сказать о поликлональной сыворотке.

2. Применение моноклональных антител

Все вышеперечисленные свойства монАТ дают им преимущества перед поликлональными сыворотками в использовании их в диагностических целях, где монАТ нашли свое самое широкое применение.

2.1.Клиническая диагностика растворимых антигенов.

Почти все известные схемы анализа растворимых антигенов на основе монАТ можно отнести к двум типам: метод «двойного сэндвича» (рис.1.) и конкурентный анализ (рис.2.). В обоих случаях используют твердофазный носитель, на который прикрепляют (сорбируют) тем или иным способом монАТ. Далее, в случае «двойного сэндвича», этот носитель инкубируют с исследуемым раствором (чаще всего это биологические жидкости, которые хотят проверить на содержание в них какого-либо белка или низкомолекулярного соединения). Во время инкубации этот антиген (если он имеется в исследуемом растворе) связывается с монАТ, все несвязавшиеся компоненты образца удаляют, промывая твердый носитель буферными растворами или водой. Затем инкубируют со «вторыми» моноклональными антителами, которые, во-первых, должны быть направлены к другой части молекулы антигена, не экранированной первыми сорбированными монАТ, а, во-вторых, должны иметь на себе какую-либо метку, позволяющую регистрировать наличие или отсутствие присоединения «вторых» монАТ к твердому носителю и делать выводы о наличии и количественном содержании искомого антигена в растворе.

Недостатком этого метода является необходимость иметь два монАТ, направленных к разным участкам молекулы антигена и не мешающих друг другу связываться с антигеном. Существует ряд антигенов, как правило, низкомолекулярных, для которых невозможно получить такую пару монАТ по той причине, что антиген имеет только одну антигенную детерминанту, либо антигенные детерминанты расположены на недостаточном расстоянии друг от друга для того, чтобы две достаточно крупные молекулы антител могли независимо их связывать.

В таких случаях используют в среднем менее чувствительный конкурентный анализ. Для этого на твердофазный носитель прикрепляют монАТ, затем инкубируют его с исследуемым образцом, куда предварительно добавили меченый антиген, который хотят обнаружить в образце. При наличии в образце искомого антигена (естественно, немеченого) последний препятствует связыванию меченого антигена с сорбированными монАТ (конкурирует с ним за связывание с монАТ). В результате самый сильный сигнал наблюдают при отсутствии в исследуемом растворе искомого антигена (отрицательный контроль), а о содержании антигена можно судить по уровню снижения сигнала по сравнению с отрицательным контролем.

studfiles.net

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

Высшего и профессионального образования

«Оренбургский государственный аграрный университет»

Кафедра микробиологии

И.В. Савина

Гибридомные технологии.

Методы получения моноклональных антител

Методические указания для студентов, обучающихся по специальности «Микробиология», «Ветеринария»

Оренбург

2006

Автор: И.В. Савина.

Методическое указание к теме, предназначенной для самостоятельного изучение: «Гибридомные технологии. Методы получения моноклональных антител»

Рецензент: доцент кафедры эпизоотологии и паразитологии С.В. Селин

Методические указания обсуждены на заседании методической комиссии факультета Ветеринарной медицины ОГАУ и рекомендованы к опубликованию (протокол № от «» « » 2011г.)

Введение

Моноклональные антитела являются мощным инструментом исследования биологических макромолекул. С их помощью изучают структуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые компоненты клеток и тканей.

Анализ экспрессии и регуляции генов, идентифицированных в различных геномных проектах, требует создания тысяч и тысяч новых моноклональных антител. Моноклональные антитела позволяют обеспечить высокую специфичность, чувствительность и воспроизводимость приемов иммуноанализа и в то же время -увеличить их разнообразие и адаптировать для решения проблем фундаментального и практического характера. Поэтому создание моноклональных антител для систем иммуноанализа было и остается актуальной задачей.

Опубликование в 1975 году статьи, в которой было описано слияние нормальных плазмацитов с их опухолевыми аналогами - клетками миеломы и последующий отбор клонов-продуцентов антител, открыло эру создания, исследования и использования моноклональных антител. Совокупность приемов получения штаммов-продуцентов моноклональных антител была основана на гибридомной технологией. В ее основе лежит синтез ряда достижений клеточной биологии, фундаментальной иммунологии и экспериментальной онкологии.

Перспективность гибридомной технологии для развития методов иммуноанализа была высоко оценена исследователями, и лаборатории многих стран мира занялись ее освоением и адаптацией. Вскоре стало понятно, что на каждом этапе создания гибридом имеются многочисленные технические проблемы и что способ их решения определив результат в целом. Первая из таких проблем связана с высокой зависимостью миеломных клеток-партнеров от ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Создание клеточных линий, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, способных расти и давать жизнеспособные гибриды в средах, не содержащих фетальной сыворотки, представляло актуальную задачу. Вторая проблема состояла в том, что при создании гибридом для иммунизации почти повсеместно использовали мышей BALB/c, от которых происходят миеломные штаммы-партнеры. Это приводило к сужению спектра эпитопов, распознаваемых полученными моноклональными антителами. Представлялось целесообразным в качестве доноров иммунных лимфоцитов использовать животных иного генотипа с иным репертуаром вырабатываемых антител с тем, чтобы получаемые моноклональные антитела по эпитопной специфичности могли дополнять ранее созданные реагенты. Наконец, пассирование гибридом на животных с целью получения больших количеств моноклональных антител остается до сих пор «узким местом» гибридомной технологии.

Таким образом, совершенствование ряда ключевых этапов гибридомной технологии представляет собой актуальную задачу.

studfiles.net

Занятие 16.

ТЕМА ЗАНЯТИЯ:Техника получения моноклональных антител. Иммуноферментный анализ.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Изучение основных стадий получения моноклональных антител. Рассмотрение основных направлений применения моноклональных антител в практической деятельности человека.

Вопросы, выносимые на семинар:

  1. Введите понятие «антитело». Приведите характеристику антител. Поясните исторические этапы их выделения.

2. Охарактеризуйте термин «моноклональные антитела». Приведите характеристику моноклональных антител.

  1. Введите понятие «гибридома». Поясните сущность гибридомной технологии получения моноклональных антител. Охарактеризуйте практическое значение гибридомной технологии.

  2. Перечислите и охарактеризуйте этапы получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела.

  3. Перечислите основные сферы применения моноклональных антител. Объясните назначение гибридомных банков.

  4. Поясните особенности применения моноклональных антител для снятия последствий передозировки лекарствами.

  5. Охарактеризуйте возможности применения моноклональных антител для диагностики злокачественных новообразований и наблюдения за ними.

  6. Опишите особенности применения моноклональных антител для направленного введения лекарственных препаратов.

  7. Расскажите о возможности использования моноклональных антител для выделения биологически активных веществ.

  8. Поясните возможность использования техники моноклональных антител для изучения структуры клеточных мембран.

  9. Охарактеризуйте особенности применения моноклональных антител в терапии некоторых заболеваний.

  10. Опишите сущность, сферы практического применения, достоинства и недостатки радиоиммунологического метода анализа.

  11. Охарактеризуйте основные черты иммуноферментного метода анализа: сущность, разновидности, области практического приложения, преимущества и недостатки метода.

  12. Рассмотрите особенности твердофазного метода анализа ELISA. Укажите сферы практического применения, достоинства и недостатки данного метода анализа.

  13. Поясните особенности гомогенного метода анализа EMIT: сущность, сфера применения, преимущества и недостатки метода.

  14. Перечислите и охарактеризуйте основные стадии проведения ИФА. Поясните основные сферы применения ИФА.

Задание 1: Изучить учебный материал.

Учебный материал.

  1. Общая характеристика моноклональных антител.

Антитела– белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызывающим их образование, или с изолированной детерминантной группой этого антигена.

Разрешив ряд методических проблем, Милстейн, Говард, Батчер из Института физиологии (Кембридж) успешно осуществили слияние клеток, продуцирующих моноклональные антитела против крысиного антигена тканевой совместимости – молекулы, ответственной за генетическую индивидуальность организма и реакцию отторжения трансплантата.

Когда после слияния клеток двух различных линий образуется клон, антитела, которые он продуцирует, необязательно могут быть моноклональными в иммунологическом смысле, ибо в каждой клетке гибридного клона присутствуют хромосомы обеих родительских клеток, экспрессия которых ведет к продукции иммуноглобулинов селезеночных и миеломных клеток, но на ранних стадиях размножения гибридной клетки быстро утрачивается часть хромосом. Такая утрата хромосом имеет неслучайный характер. Исходя из этого Д. Келер и Ц. Милштейн пытались выделить клоны, которые потеряли хромосомы, принадлежащие миеломе, и поэтому экспрессировали хромосомы иммунных лимфоцитов, т.е. те которые, синтезируют только тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов (НL), реагирующих с эритроцитами барана. Такая селекция значительно бы облегчилась, если бы имелась мутантная миеломная линия, не продуцирующая иммуноглобулинов. Тогда в результате слияния получились бы только HL-гибридомы.

Отобранные клоны могут храниться в замороженном состоянии. В любое время определенную дозу такого клона можно ввести животному той же линии, от которой были получены клетки для слияния. У животного развивается опухоль, которая продуцирует моноклональные антитела заданной специфичности. Антитела обнаруживаются в сыворотке крови животного в очень высокой концентрации – 10 – 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела выделять из культуральной жидкости.

Ц. Милштейн и его сотрудники получили моноклональные антитела, направленные против антигенов малого размера, т.е. гаптенов, белков, углеводов и гликолипидов, а также против вирусов и компонентов клеточной мембраны.

В настоящее время гибридомная технологияполучила широкое развитие. Теперьмоноклональные антителаможно определить, как химический реагент известной структуры, который можно получить по желанию, тогда как соответствующая антисыворотка является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть в точности воспроизведена после гибели исходного животного. Моноклональные антитела очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с нужным антигеном и затем в течение 6 – 12 мес. получают неограниченное количество моноспецифических антител очень высокой степени чистоты и гомогенности. В то время как для получения антител традиционными методами необходимо приблизительно 1200 л сыворотки крови человека, полученной из крови 6000 доноров. Ц. Милштейн и его коллеги выделили «специфические антитела» для группы А из культур гибридомы, оказывавшиеся столь же эффективными, как и наилучшие из имеющихся реагентов.

Абсолютной воспроизводимостью, стандартностью и наивысшей из возможных специфичностью обладает моноклональные антитела, которые секретируются одним клоном антителообразующих клеток и идентичны не только по антигенной специфичности, но и по классу и типу тяжелых и легких цепей в молекуле. Разделить клоны антителообразующих клеток, образующихся in vivo, невозможно, поэтому моноклональные антитела получают с использованием гибридомной технологии in vitro. Продуцентом является гибридная клетка (гибридома) – продукт слияния В-лимфоцита, секретирующего антитела на определенный антиген и непрерывно растущей клетки миеломы.

До недавнего времени для гибридизации использовали исключительно миеломные клетки и В-лимфоциты мышей или крыс, но продуцируемые ими моноклональные антитела имеют ограниченное терапевтическое применения, т.к. они представляют собой чужеродный белок для человеческого организма.

Освоение технологии получения гибридом на основе иммунных клеток человека связано со значительными трудностями: человеческие гибридомы растут медленно, сравнительно малостабильны, но уже получены гибридомы человека – продуценты моноклональных антител. Оказалась, что и человеческие моноклональные антитела в некоторых случаях вызывают иммунные реакции, и их клиническая эффективность зависит от правильного подбора класса антител, гибридомных линий, подходящих для данного больного.

К достоинствам человеческих моноклональных антител относится способность распознавать тонкие различия в структуре антигена, которые не распознаются моноклональные антитела мыши и крысы.

Предприняты попытки получения химерных гибридом, сочетающих мышиные миеломные клетки и человеческие В-лимфоциты; такие гибридомы находят пока лишь ограниченное практическое применение.

Наряду с преимуществами моноклональные антитела имеют недостатки, порождающие проблемы их практического использования. Они не стабильны при хранении в высушенном состоянии, в то время как в смеси обычных (поликлональных) антител всегда присутствует группа антител, устойчивая при избранных условиях хранения. Таким образом, неоднородность обычных антител дает им дополнительный резерв стабильности при изменении внешних условий, что соответствует одному из основных принципов повышения надежности систем. Моноклональные антитела нередко имеют слишком низкое сродство к антигену и чрезмерно низкую специфичность, что препятствует их применению против изменчивых антигенов, характерных для инфекционных агентов и опухолевых клеток. Необходимо также отметить высокую стоимость моноклональных антител на международном рынке.

studfiles.net

Моноклональные антитела применение

Моноклональные антитела в иммунологии. Использование моноклональных антител

Ответственное достижение медицины последних лет — разработка и клиническое применение биологических препаратов, созданных на базе моноклональных антител. Первые моноклональные антитела применяли по большей части с диагностической целью. Как раз посредством моноклональных антител к поверхностным молекулам определяют субпопуляционный состав лимфоцитов, выполняют иммуногистохимические изучения для диагностики онкологических и аутоиммунных болезней при работе с материалами биопсии.

Моноклональные антитела применение

Посредством цитолитических моноклональных антител выполняют сортировку клеток для выделения нужной популяции (к примеру, выделение стволовых кроветворных клеток для трансплантаций). Вероятно создание моноклональных антител к антигенам вирусов, бактерий и других патогенов для лечения инфекционных болезней.

Области применения моноклональных антител. • с диагностической целью: определение экспрессии разных молекул; • блокада рецепторов; • инактивация и лизис клеток (лечение онкологических и аутоиммунных болезней).

Моноклональные антитела применение

Сперва были созданы гетероиммунные антитела (мышиные античеловеческие, овечьи антимышиные и т.д.). Их применяют по большей части для диагностических целей и селекции клеток. При введении в организм человека они приводят к выработке антител.

Препараты для клинического применения были созданы для обеспечения высокоспецифичного, высокоаффинного сродства моноклональных антител с антигеном в сочетании с минимизацией побочных эффектов, в частности выработки больным антител к чужеродному белку. Так, антитело человека делается носителем антигенсвязывающего фрагмента мышиного иммуноглобулина. Эти препараты на 75% складываются из белка человека и на 25% — из белка мыши. Такая структура снабжает высокое сродство к антигену и сокращает (не смотря на то, что и не исключает) возможность образования против них антител организмом хозяина, что может привести к серьёзным побочным побочным, вплоть до развития анафилаксии. Пример химерного антитела — препарат ремикейд (инфликсимаб).

Моноклональные антитела применение

Следующим шагом стало создание гуманизированных моноклональных антител, на 80-95% складывающихся из белка человека и лишь на 5-10% — из белка мыши. Мышиного происхождения в этих молекулах — лишь гипервариабельные участки, формирующие антигенсвязывающий центр. Наконец, были созданы генно-инженерные. всецело гуманизированные моноклональные антитела, молекулы которых всецело складываются из белка человека.

Большая часть препаратов на базе моноклональных антител больные переносят хорошо. При применении химерных вероятна выработка антител к ним и развитие анафилактических реакций. Препараты, подавляющие функции и уменьшающие количество разных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, смогут стать причиной уменьшения противоинфекционной резистентности и/либо обострение хронических зараз. Для предотвращения этих осложнений нужно тщательное наблюдение за больными, получающими лечение препаратами на базе моноклональных антител, и своевременное назначение адекватной сопроводительной терапии. Те же меры безопастности нужно предпринимать для уменьшения риска и тяжести течения токсических реакций, обрисованных при применении моноклональных антител для лечения онкологических болезней (к примеру, препаратов, подавляющих ангиогенез). При лечении антителами против ФНО-ot вероятна активация скрытого туберкулеза.

Моноклональные антитела применение

Перспективное направление в создании новых препаратов на базе моноклональных антител — каталитические антитела абзимы. Это молекулы, владеющие свойствами антител (смогут связываться с определенными эпитопами) и биологических катализаторов разных химических реакций (энзимов).

Области применения абзимов. • Диагностика аутоиммунных болезней (анти-ДНК аутоантитела с каталитической активностью). • Лечение аутоиммунных болезней. • Лечение инфекционных болезней (создание абзимов, направленных на специфический катализ инфекционных агентов).

cyberviewdvr.ru


Смотрите также